大鼠弥漫性轴突损伤的超微结构研究
作者：亓树彬 许百男 孟宇宏 郭岩 段玮 康筱玲
单位：亓树彬(现在海军总医院全军神经外科中心100037)；许百男(100853 北京，中国人民解放军总医院神经外科)；孟宇宏 段玮 康筱玲(海军总医院病理科)；郭岩(北京邮电总医院神经外科)
关键词：
中华医学杂志000127 目前，弥漫性轴突损伤(DAI)被认为是一种独立的脑损伤类型。电镜下可以分辨轴突损伤的不同阶段，但详细的电镜资料目前尚不全面。为此，我们观察了超微结构水平弥漫性轴突损伤的形态变化，以确定损伤程度和阶段，并探讨其机制，为临床诊治提供参考。
一、材料与方法
成年SD大鼠18只，体重250～350 g。分为损伤后1、3、6、24、72 h组和正常对照组(每组3只)。用一种旋转损伤装置诱发大鼠DAI。将大鼠头沿冠状面逆时针旋转90度，时间5 ms，角速度4.44 Gy/s，角加速度1.45×105 Gy/s。对照组不实施旋转。观察大鼠伤后的临床反应。损伤组在上述5个时间点分批处死，对照组24 h后处死。开胸左心，颈动脉插管脑灌注，5 min内灌注120 ml生理盐水，后15～30 min内灌注4%多聚甲醛戊二醛液200 ml，灌注压120 cm H2O，同时，右心耳剪口放液。断头取脑，肉眼观察鼠脑的变化。取脑白质、胼胝体、海马、脑干、小脑上脚置3%戊二醛液中固定24 h(4℃)。标本均取材1 mm3组织2～3块，3%戊二醛及1%锇酸固定，梯度乙醇及丙酮脱水，环氧树脂812包埋，半薄切片1 μm光镜定位，甲苯胺蓝染色，光镜定位，50 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，Philips-CM100透射电镜观察。
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二、结果
1.临床观察：损伤组动物致伤后均出现原发昏迷(25～150 min，平均51 min)及呼吸暂停数秒钟。损伤组动物中有10只出现抽搐，表现为前后肢均向尾侧伸直，4只醒后表现为左侧肢体活动受限。所有动物醒后均反应迟钝，定向力差。对照组活动、反应均正常。
2.脑组织大体病理：损伤组动物中14只脑有肉眼所见的异常，表现为中线两侧大、小脑表面出血，脑室出血，蛛网膜下腔出血。所有脑标本均无挫裂伤、血肿及局限性病灶。
3.电镜观察：(1)对照组轴突形态规则，神经丝沿轴突长轴平行排列。轴浆中偶见细胞器，髓鞘均匀一致。髓鞘和轴膜密闭在一起。(2)损伤动物组：在脑干及矢状窦旁白质，伤后1小时即见到轴突肿胀，神经丝聚集，但仍沿轴突长轴平行排列(图1a)，未见神经丝错排及崩解。线粒体局部水肿并轻度退变。轴膜和髓鞘分离形成透亮区，但未见轴膜和髓鞘的破坏。损伤后3 h，肿胀轴突出现扭曲，神经丝排列明显紊乱，出现密集区及空白区，偶见神经丝颗粒状崩解。轴突内线粒体聚集并肿胀变性及不规则空泡，可见细胞器退变，部分轴膜和髓鞘内陷及溶解断裂(图1b)。被覆髓鞘出现节段性脱失，并出现明显的片层分离及突起。
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图1 a.损伤后1 h，见有轻度的细胞器退变，轴膜和髓鞘分离形成透亮区，轴突内神经丝聚集 ×6 600; b.损伤后3 h，轴膜、髓鞘碎裂及退变细胞器 ×11 500
在脑干、小脑上脚及矢状窦旁白质区发现散在分布的轴突回缩球及某些轴突即将发生断裂。损伤后6 h，轴突肿胀进一步加重，轴突球数量明显增多。轴突内结构紊乱，轴浆内有较多小泡体形成。神经丝明显出现颗粒状崩解，细胞骨架结构难于分辨。线粒体进一步聚集增多(图2a)，在部分区域线粒体退变、髓样体形成，而另一些区域则出现线粒体增生肥大。伤后24 h，轴突断裂更多见(图2b)，在断裂轴突端出现混乱的结构(图2c)。轴突内神经丝大量颗粒状崩解，致使丝样结构不能分辨，线粒体大量聚集，达6 h的2倍。髓鞘大范围节段性溶解，偶见脱髓鞘改变。伤后3天，肿胀轴突内神经丝几乎完全颗粒样崩解，轴突球内结构已完全不能辨认。肿胀轴突内线粒体退变，并较多髓样体及碎片样结构形成。
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图2 a.损伤后6 h，线粒体聚集增多，细胞骨架结构不清 ×8 900； b.损伤后24 h，轴突断裂 ×8 900； c.损伤后24 h，断裂轴突端出现混乱结构 ×11 500
三、讨论
旋转加速度、减力是发生DAI的主要力学机制。据报道[1]，在旋转损伤中，产生延迟昏迷的脑损伤常没有颅内局灶性、扩展性病灶(挫裂伤、血肿)，也没有颅高压，但可有轻微的脑表面挫伤和小量蛛网膜、硬膜下腔出血。本实验中，损伤鼠均出现原发昏迷及呼吸暂停，并有行为、运动及肉眼所见脑中轴部位的异常(中线两侧大脑、小脑表面点片状出血及脑室出血)，所有脑标本均无挫裂伤、血肿及局限性病灶，这与文献描述的DAI特征相符[2]。电镜下轴突的变化主要是(1)轴膜局部破坏，造成轴膜通透性的改变；(2)轴突内线粒体肿胀；(3)形成‘结节球’和结节之间轴突内径的局限性缩小；(4)轴突微管的丧失和轴突内神经丝关系的变化，即从早期的神经丝聚集到神经丝侧臂的丢失；(5)结节间轴膜的退化；(6)轴膜从髓鞘内面分离形成所谓的轴突间空隙；(7)轴突肿胀；(8)出现髓鞘突起；(9)轴突断裂形成变性轴突球。
, 百拇医药
轴突损害存在于各种程度的颅脑损伤中。轴突损害并非损伤直接造成撕裂或拉断，而是局部轴突膜通透性改变，轴浆运输中断，引起轴突肿胀和断裂[3]。在电镜下可以分辨轴突损伤的不同阶段。本研究中，损伤后3 h即可见到轴突球，但其内部结构仅为丝的紊乱和细胞器聚集，24 h轴突球内部结构不能辨认。说明轴突断裂是有一个时间过程。文献报道[4]DAI多在桥脑基底、大脑脚、矢旁皮层下白质、海马、胼胝体。本实验表明，损伤最常见部位是矢旁白质、脑干和小脑上脚的纵行纤维，这和伤后的表现相一致。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870793)
参考文献：
[1]Adams JH, Duchen LW. Greenfield′s neuropathology, Fifth Edition. 1992,122-134.
, 百拇医药
[2]Ross DT, Meaney DF, Sabol MK, et al. Distribution of forebrain diffuse axonal injury following inertial closed head injury in miniature swine. Experimental Neurol. 1994,126:291-299.
[3]Maxwell WL, Watt C, Graham DI, et al. Ultrasturctural evidence of axonal shearing as a result of lateral acceleration of the head in non-human primates. Acta Neuropathol, 1993,86：136-144.
[4]Stephen BL, John WF, Peter CB, et al. A head impact model of early axonal injury in the sheep. J Neurotrauma, 1996,13：505-514.
收稿日期：1999-04-22, http://www.100md.com
单位：亓树彬(现在海军总医院全军神经外科中心100037)；许百男(100853 北京，中国人民解放军总医院神经外科)；孟宇宏 段玮 康筱玲(海军总医院病理科)；郭岩(北京邮电总医院神经外科)
关键词：
中华医学杂志000127 目前，弥漫性轴突损伤(DAI)被认为是一种独立的脑损伤类型。电镜下可以分辨轴突损伤的不同阶段，但详细的电镜资料目前尚不全面。为此，我们观察了超微结构水平弥漫性轴突损伤的形态变化，以确定损伤程度和阶段，并探讨其机制，为临床诊治提供参考。
一、材料与方法
成年SD大鼠18只，体重250～350 g。分为损伤后1、3、6、24、72 h组和正常对照组(每组3只)。用一种旋转损伤装置诱发大鼠DAI。将大鼠头沿冠状面逆时针旋转90度，时间5 ms，角速度4.44 Gy/s，角加速度1.45×105 Gy/s。对照组不实施旋转。观察大鼠伤后的临床反应。损伤组在上述5个时间点分批处死，对照组24 h后处死。开胸左心，颈动脉插管脑灌注，5 min内灌注120 ml生理盐水，后15～30 min内灌注4%多聚甲醛戊二醛液200 ml，灌注压120 cm H2O，同时，右心耳剪口放液。断头取脑，肉眼观察鼠脑的变化。取脑白质、胼胝体、海马、脑干、小脑上脚置3%戊二醛液中固定24 h(4℃)。标本均取材1 mm3组织2～3块，3%戊二醛及1%锇酸固定，梯度乙醇及丙酮脱水，环氧树脂812包埋，半薄切片1 μm光镜定位，甲苯胺蓝染色，光镜定位，50 nm超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，Philips-CM100透射电镜观察。
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二、结果
1.临床观察：损伤组动物致伤后均出现原发昏迷(25～150 min，平均51 min)及呼吸暂停数秒钟。损伤组动物中有10只出现抽搐，表现为前后肢均向尾侧伸直，4只醒后表现为左侧肢体活动受限。所有动物醒后均反应迟钝，定向力差。对照组活动、反应均正常。
2.脑组织大体病理：损伤组动物中14只脑有肉眼所见的异常，表现为中线两侧大、小脑表面出血，脑室出血，蛛网膜下腔出血。所有脑标本均无挫裂伤、血肿及局限性病灶。
3.电镜观察：(1)对照组轴突形态规则，神经丝沿轴突长轴平行排列。轴浆中偶见细胞器，髓鞘均匀一致。髓鞘和轴膜密闭在一起。(2)损伤动物组：在脑干及矢状窦旁白质，伤后1小时即见到轴突肿胀，神经丝聚集，但仍沿轴突长轴平行排列(图1a)，未见神经丝错排及崩解。线粒体局部水肿并轻度退变。轴膜和髓鞘分离形成透亮区，但未见轴膜和髓鞘的破坏。损伤后3 h，肿胀轴突出现扭曲，神经丝排列明显紊乱，出现密集区及空白区，偶见神经丝颗粒状崩解。轴突内线粒体聚集并肿胀变性及不规则空泡，可见细胞器退变，部分轴膜和髓鞘内陷及溶解断裂(图1b)。被覆髓鞘出现节段性脱失，并出现明显的片层分离及突起。
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图1 a.损伤后1 h，见有轻度的细胞器退变，轴膜和髓鞘分离形成透亮区，轴突内神经丝聚集 ×6 600; b.损伤后3 h，轴膜、髓鞘碎裂及退变细胞器 ×11 500
在脑干、小脑上脚及矢状窦旁白质区发现散在分布的轴突回缩球及某些轴突即将发生断裂。损伤后6 h，轴突肿胀进一步加重，轴突球数量明显增多。轴突内结构紊乱，轴浆内有较多小泡体形成。神经丝明显出现颗粒状崩解，细胞骨架结构难于分辨。线粒体进一步聚集增多(图2a)，在部分区域线粒体退变、髓样体形成，而另一些区域则出现线粒体增生肥大。伤后24 h，轴突断裂更多见(图2b)，在断裂轴突端出现混乱的结构(图2c)。轴突内神经丝大量颗粒状崩解，致使丝样结构不能分辨，线粒体大量聚集，达6 h的2倍。髓鞘大范围节段性溶解，偶见脱髓鞘改变。伤后3天，肿胀轴突内神经丝几乎完全颗粒样崩解，轴突球内结构已完全不能辨认。肿胀轴突内线粒体退变，并较多髓样体及碎片样结构形成。
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图2 a.损伤后6 h，线粒体聚集增多，细胞骨架结构不清 ×8 900； b.损伤后24 h，轴突断裂 ×8 900； c.损伤后24 h，断裂轴突端出现混乱结构 ×11 500
三、讨论
旋转加速度、减力是发生DAI的主要力学机制。据报道[1]，在旋转损伤中，产生延迟昏迷的脑损伤常没有颅内局灶性、扩展性病灶(挫裂伤、血肿)，也没有颅高压，但可有轻微的脑表面挫伤和小量蛛网膜、硬膜下腔出血。本实验中，损伤鼠均出现原发昏迷及呼吸暂停，并有行为、运动及肉眼所见脑中轴部位的异常(中线两侧大脑、小脑表面点片状出血及脑室出血)，所有脑标本均无挫裂伤、血肿及局限性病灶，这与文献描述的DAI特征相符[2]。电镜下轴突的变化主要是(1)轴膜局部破坏，造成轴膜通透性的改变；(2)轴突内线粒体肿胀；(3)形成‘结节球’和结节之间轴突内径的局限性缩小；(4)轴突微管的丧失和轴突内神经丝关系的变化，即从早期的神经丝聚集到神经丝侧臂的丢失；(5)结节间轴膜的退化；(6)轴膜从髓鞘内面分离形成所谓的轴突间空隙；(7)轴突肿胀；(8)出现髓鞘突起；(9)轴突断裂形成变性轴突球。
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轴突损害存在于各种程度的颅脑损伤中。轴突损害并非损伤直接造成撕裂或拉断，而是局部轴突膜通透性改变，轴浆运输中断，引起轴突肿胀和断裂[3]。在电镜下可以分辨轴突损伤的不同阶段。本研究中，损伤后3 h即可见到轴突球，但其内部结构仅为丝的紊乱和细胞器聚集，24 h轴突球内部结构不能辨认。说明轴突断裂是有一个时间过程。文献报道[4]DAI多在桥脑基底、大脑脚、矢旁皮层下白质、海马、胼胝体。本实验表明，损伤最常见部位是矢旁白质、脑干和小脑上脚的纵行纤维，这和伤后的表现相一致。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870793)
参考文献：
[1]Adams JH, Duchen LW. Greenfield′s neuropathology, Fifth Edition. 1992,122-134.
, 百拇医药
[2]Ross DT, Meaney DF, Sabol MK, et al. Distribution of forebrain diffuse axonal injury following inertial closed head injury in miniature swine. Experimental Neurol. 1994,126:291-299.
[3]Maxwell WL, Watt C, Graham DI, et al. Ultrasturctural evidence of axonal shearing as a result of lateral acceleration of the head in non-human primates. Acta Neuropathol, 1993,86：136-144.
[4]Stephen BL, John WF, Peter CB, et al. A head impact model of early axonal injury in the sheep. J Neurotrauma, 1996,13：505-514.
收稿日期：1999-04-22, http://www.100md.com