谷氨酸对大鼠胶质细胞细胞周期和凋亡及坏死的影响
作者：王伟 唐荣华 刘洋 周洁平
单位：(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院神经内科)
关键词：
中华医学杂志000124 关于缺血期间胶质细胞的功能状态、细胞周期的变化以及胶质细胞的死亡形式研究较少。谷氨酸(Glu)作为脑内主要的兴奋性神经递质，与癫痫的发生以及神经元的损伤有密切联系[1]，我们观察了离体培养的大鼠皮层胶质细胞经不同浓度的谷氨酸刺激后胶质细胞细胞周期的改变和细胞凋亡及坏死的比例，以期明确脑缺血病理损害介质Glu对胶质细胞功能状态的影响，为探讨缺血性神经细胞的生存与死亡机制提供理论依据。
一、材料与方法
1.胶质细胞培养：(1)神经细胞原代培养：参照Manthrope等[2]的方法，取孕18 d SD大鼠鼠脑皮质，用完全培养基37 ℃，体积分数为5% CO2条件进行培养；细胞计数后以5×106个细胞/ml接种于25 ml培养瓶中，定期换液观察至培养的第8 d，此时神经细胞分化良好，可见典型的锥体样神经细胞; (2)贴壁生长的细胞传代：原代培养细胞经0.5%胰白酶和0.2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)混合液(1∶1)消化处理后，用培养液稀释至3×105个活细胞/ml，并接种到新培养瓶内，37℃，体积分数为5% CO2条件进行培养，经以上2次传代培养的细胞则为胶质细胞。
, 百拇医药
2.流式细胞仪对胶质细胞细胞周期及死亡形式的测定：(1)样品制备：取106个新鲜细胞/样品置于0.1 ml PBS中，加入4℃的体积分数为70%冷乙醇后存放在4℃冰箱中，检测时1 500 r/min离心5 min，弃乙醇，PBS洗2次; (2)PBS离心洗涤后弃上清，每样品管中加1 ml碘化丙啶(PI)染液，保存在黑暗中染色30 min，上机前用400目尼龙网过滤; (3)选用FACS420型流式细胞仪检测细胞内DNA含量，由于坏死或凋亡细胞的DNA发生不同程度的断裂，DNA断裂生成的小碎片易于从细胞内释放到细胞外，导致细胞内的DNA含量减少，流式细胞仪检测显示，在正常二倍体细胞的G0/G1期峰之间，呈现一亚G1期峰，又称AO峰。通过计算机软件分析得出的AO峰的百分率表示凋亡的发生率，而AO峰之前部分所占百分率表示坏死的发生率。
3.实验分组：传代培养的胶质细胞分为3组，正常对照组(I组)、低浓度(10-3mol)Glu组(II组)、高浓度(10-2mol)Glu 组(III组)。II组、III组分别于第2次传代培养后第9 d培养瓶中加入Glu，使其终浓度分别达到10-2mol，10-3mol。继续培养12 h后终止培养，细胞固定待测。正常对照组第2次传代后于相同时限加入等量的培养液，其他方法与Glu治疗组相同。
, 百拇医药
4.统计学处理：采用计算机统计软件对实验数据进行处理，计量资料用卡方检验，计数资料采用t检验。
二、结果
本研究结果发现，10-3mol浓度的Glu即可诱导胶质细胞发生细胞凋亡，其凋亡细胞数占总体细胞数的百分率明显高于正常对照组(P<0.01)，而且随着Glu浓度的提高，胶质细胞细胞凋亡增加(表1)。低浓度(10-3mol)Glu刺激组胶质细胞死亡形式以细胞凋亡为主，高浓度(10-2mol)Glu刺激组胶质细胞死亡形式则以坏死为主。流式细胞仪对胶质细胞细胞周期的分析结果显示，Glu刺激组胶质细胞G2-M期较对照组明显延长(P<0.01)，存在细胞周期阻滞现象(表2)。
表1 谷氨酸对胶质细胞凋亡及坏死的影响(%，
±s) 组别
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鼠数
坏死
细胞凋亡
Ⅰ组
10
6.5±2.5
7.0±2.2
Ⅱ组
10
7.5±1.6
17.9±3.0*
Ⅲ组
10
, 百拇医药
24.7±5.3**
20.9±3.9*
注：与Ⅰ组比较，*P<0.01；与Ⅱ组比较，**P<0.05表2 谷氨酸对胶质细胞细胞周期的影响(%，±s) 组别
鼠数
G0-G1
G2-M
S
Ⅰ组
, 百拇医药 10
91.4±1.6
0.8±0.7
7.9±1.5
Ⅱ组
10
92.6±2.0
1.4±1.0
6.0±1.5
Ⅲ组
10
92.3±3.1
3.5±0.9*
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4.2±3.6
注：与Ⅰ组比较，*P<0.01 三、讨论
胶质细胞膜上除了Na+通道外，还表达所有其他类型的电压门控和受体(如Glu,GABA)门控通道[3]，因此，在神经元与胶质细胞之间具有多种相互作用方式。多数学者认为，胶质细胞对神经元具有保护、支持及营养作用。如星形胶质细胞的突起参与构成血脑屏障，能从血液中摄取营养物质、营养因子，供给神经元，促进神经元的存活。此外，星形胶质细胞尚能参与神经递质的代谢，维持神经元周围K+离子平衡，分泌蛋白酶和蛋白酶抑制剂，激活抗氧化径路，具有多种神经元保护作用[4，5]。近来有学者提出，脑缺血时胶质细胞代谢池中Glu的释放是细胞外Glu升高的一个重要来源[4]，急性脑缺血期间胶质细胞尤其是小脑质细胞可释放大量的谷氨酸，活化多种蛋白酶、细胞因子、一氧化氮(NO)，具有多种细胞毒性介导作用[3]。由于胶质细胞对神经元具有以上多方面的作用，因此，研究缺血性神经元的损伤与抗损伤机制，必须涉及胶质细胞的功能状态以及生存与死亡机制，必须同时研究缺血期间胶质细胞的功能状态，明确胶质细胞与神经细胞之间的关系以及胶质细胞与神经介质之间的关系。
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本研究表明，Glu刺激下胶质细胞细胞周期中G2-M期明显延长，存在细胞周期阻滞现象，10-3mol浓度的Glu即可诱导胶质细胞发生细胞凋亡，而且随着Glu浓度的提高，胶质细胞细胞凋亡增加；此外，本研究还发现，在低浓度(10-3mol)Glu刺激下胶质细胞死亡形式以细胞凋亡为主，高浓度Glu(10-2mol)刺激下胶质细胞死亡形式则以坏死为主。尽管Glu诱导胶质细胞凋亡和坏死的机制不十分清楚，但由于胶质细胞具有Glu受体和其他类型的电压门控和受体门控通道，因此，推测Glu诱导胶质细胞凋亡和坏死的机制可能有(1)与Glu引起神经元损伤的机制相仿，过度释放的Glu激活胶质细胞膜上的Glu门控离子通道，使Na+过度内流，继发引起Cl-和水被动进入细胞内，细胞产生急性水肿，造成胶质细胞急性损伤。更为重要的是Glu作用于NMDA受体，激活NMDA受体门控Ca2+通道，引起Ca2+过度内流导致胶质细胞凋亡或坏死；(2)导致胶质细胞在细胞周期G2/M检测点处(checkpoint)的运动受到阻滞，当损伤未及时修复时，导致胶质细胞凋亡。■
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基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目(39700047)
参考文献：
[1]Meldrun B, Garthwaite J. Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease. Trends Pharmacol Sci, 1990,11:379-387.
[2]Manthrope M, Adler R, Varon S. Development, reactivity and GFAP immunofluorescene of astroglia-containint monolayer cultures from rat cerebrum. J Neurocytol, 1979,8:609.
[3]朱长庚.星型胶质细胞，解剖学报，1990，21：441-446.
[4]Rothman SM, Olney JW. Excitotoxicity and the NMDA receptor. Trens Neurosci, 1987,10:299-302.
[5]韩济生.神经科学纲要.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993，386.
收稿日期：1999-02-10, 百拇医药
单位：(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院神经内科)
关键词：
中华医学杂志000124 关于缺血期间胶质细胞的功能状态、细胞周期的变化以及胶质细胞的死亡形式研究较少。谷氨酸(Glu)作为脑内主要的兴奋性神经递质，与癫痫的发生以及神经元的损伤有密切联系[1]，我们观察了离体培养的大鼠皮层胶质细胞经不同浓度的谷氨酸刺激后胶质细胞细胞周期的改变和细胞凋亡及坏死的比例，以期明确脑缺血病理损害介质Glu对胶质细胞功能状态的影响，为探讨缺血性神经细胞的生存与死亡机制提供理论依据。
一、材料与方法
1.胶质细胞培养：(1)神经细胞原代培养：参照Manthrope等[2]的方法，取孕18 d SD大鼠鼠脑皮质，用完全培养基37 ℃，体积分数为5% CO2条件进行培养；细胞计数后以5×106个细胞/ml接种于25 ml培养瓶中，定期换液观察至培养的第8 d，此时神经细胞分化良好，可见典型的锥体样神经细胞; (2)贴壁生长的细胞传代：原代培养细胞经0.5%胰白酶和0.2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)混合液(1∶1)消化处理后，用培养液稀释至3×105个活细胞/ml，并接种到新培养瓶内，37℃，体积分数为5% CO2条件进行培养，经以上2次传代培养的细胞则为胶质细胞。
, 百拇医药
2.流式细胞仪对胶质细胞细胞周期及死亡形式的测定：(1)样品制备：取106个新鲜细胞/样品置于0.1 ml PBS中，加入4℃的体积分数为70%冷乙醇后存放在4℃冰箱中，检测时1 500 r/min离心5 min，弃乙醇，PBS洗2次; (2)PBS离心洗涤后弃上清，每样品管中加1 ml碘化丙啶(PI)染液，保存在黑暗中染色30 min，上机前用400目尼龙网过滤; (3)选用FACS420型流式细胞仪检测细胞内DNA含量，由于坏死或凋亡细胞的DNA发生不同程度的断裂，DNA断裂生成的小碎片易于从细胞内释放到细胞外，导致细胞内的DNA含量减少，流式细胞仪检测显示，在正常二倍体细胞的G0/G1期峰之间，呈现一亚G1期峰，又称AO峰。通过计算机软件分析得出的AO峰的百分率表示凋亡的发生率，而AO峰之前部分所占百分率表示坏死的发生率。
3.实验分组：传代培养的胶质细胞分为3组，正常对照组(I组)、低浓度(10-3mol)Glu组(II组)、高浓度(10-2mol)Glu 组(III组)。II组、III组分别于第2次传代培养后第9 d培养瓶中加入Glu，使其终浓度分别达到10-2mol，10-3mol。继续培养12 h后终止培养，细胞固定待测。正常对照组第2次传代后于相同时限加入等量的培养液，其他方法与Glu治疗组相同。
, 百拇医药
4.统计学处理：采用计算机统计软件对实验数据进行处理，计量资料用卡方检验，计数资料采用t检验。
二、结果
本研究结果发现，10-3mol浓度的Glu即可诱导胶质细胞发生细胞凋亡，其凋亡细胞数占总体细胞数的百分率明显高于正常对照组(P<0.01)，而且随着Glu浓度的提高，胶质细胞细胞凋亡增加(表1)。低浓度(10-3mol)Glu刺激组胶质细胞死亡形式以细胞凋亡为主，高浓度(10-2mol)Glu刺激组胶质细胞死亡形式则以坏死为主。流式细胞仪对胶质细胞细胞周期的分析结果显示，Glu刺激组胶质细胞G2-M期较对照组明显延长(P<0.01)，存在细胞周期阻滞现象(表2)。
表1 谷氨酸对胶质细胞凋亡及坏死的影响(%，
±s) 组别, http://www.100md.com
鼠数
坏死
细胞凋亡
Ⅰ组
10
6.5±2.5
7.0±2.2
Ⅱ组
10
7.5±1.6
17.9±3.0*
Ⅲ组
10
, 百拇医药
24.7±5.3**
20.9±3.9*
注：与Ⅰ组比较，*P<0.01；与Ⅱ组比较，**P<0.05表2 谷氨酸对胶质细胞细胞周期的影响(%，
±s) 组别鼠数
G0-G1
G2-M
S
Ⅰ组
, 百拇医药 10
91.4±1.6
0.8±0.7
7.9±1.5
Ⅱ组
10
92.6±2.0
1.4±1.0
6.0±1.5
Ⅲ组
10
92.3±3.1
3.5±0.9*
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4.2±3.6
注：与Ⅰ组比较，*P<0.01 三、讨论
胶质细胞膜上除了Na+通道外，还表达所有其他类型的电压门控和受体(如Glu,GABA)门控通道[3]，因此，在神经元与胶质细胞之间具有多种相互作用方式。多数学者认为，胶质细胞对神经元具有保护、支持及营养作用。如星形胶质细胞的突起参与构成血脑屏障，能从血液中摄取营养物质、营养因子，供给神经元，促进神经元的存活。此外，星形胶质细胞尚能参与神经递质的代谢，维持神经元周围K+离子平衡，分泌蛋白酶和蛋白酶抑制剂，激活抗氧化径路，具有多种神经元保护作用[4，5]。近来有学者提出，脑缺血时胶质细胞代谢池中Glu的释放是细胞外Glu升高的一个重要来源[4]，急性脑缺血期间胶质细胞尤其是小脑质细胞可释放大量的谷氨酸，活化多种蛋白酶、细胞因子、一氧化氮(NO)，具有多种细胞毒性介导作用[3]。由于胶质细胞对神经元具有以上多方面的作用，因此，研究缺血性神经元的损伤与抗损伤机制，必须涉及胶质细胞的功能状态以及生存与死亡机制，必须同时研究缺血期间胶质细胞的功能状态，明确胶质细胞与神经细胞之间的关系以及胶质细胞与神经介质之间的关系。
, http://www.100md.com
本研究表明，Glu刺激下胶质细胞细胞周期中G2-M期明显延长，存在细胞周期阻滞现象，10-3mol浓度的Glu即可诱导胶质细胞发生细胞凋亡，而且随着Glu浓度的提高，胶质细胞细胞凋亡增加；此外，本研究还发现，在低浓度(10-3mol)Glu刺激下胶质细胞死亡形式以细胞凋亡为主，高浓度Glu(10-2mol)刺激下胶质细胞死亡形式则以坏死为主。尽管Glu诱导胶质细胞凋亡和坏死的机制不十分清楚，但由于胶质细胞具有Glu受体和其他类型的电压门控和受体门控通道，因此，推测Glu诱导胶质细胞凋亡和坏死的机制可能有(1)与Glu引起神经元损伤的机制相仿，过度释放的Glu激活胶质细胞膜上的Glu门控离子通道，使Na+过度内流，继发引起Cl-和水被动进入细胞内，细胞产生急性水肿，造成胶质细胞急性损伤。更为重要的是Glu作用于NMDA受体，激活NMDA受体门控Ca2+通道，引起Ca2+过度内流导致胶质细胞凋亡或坏死；(2)导致胶质细胞在细胞周期G2/M检测点处(checkpoint)的运动受到阻滞，当损伤未及时修复时，导致胶质细胞凋亡。■
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目(39700047)
参考文献：
[1]Meldrun B, Garthwaite J. Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease. Trends Pharmacol Sci, 1990,11:379-387.
[2]Manthrope M, Adler R, Varon S. Development, reactivity and GFAP immunofluorescene of astroglia-containint monolayer cultures from rat cerebrum. J Neurocytol, 1979,8:609.
[3]朱长庚.星型胶质细胞，解剖学报，1990，21：441-446.
[4]Rothman SM, Olney JW. Excitotoxicity and the NMDA receptor. Trens Neurosci, 1987,10:299-302.
[5]韩济生.神经科学纲要.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993，386.
收稿日期：1999-02-10, 百拇医药