紫杉醇对三株不同类型淋巴瘤细胞的体外作用
作者：周晓燕 许良中 朱伟萍 张太明 李小妹 金爱萍 何开玲
单位：周晓燕 许良中 朱伟萍 张太明 李小妹 金爱萍(200032 上海医科大学肿瘤医院病理科)；何开玲(上海医科大学生化教研室)
关键词：抗肿瘤药，植物；淋巴瘤；细胞系；脱噬作用
中华医学杂志000122 摘 要：目的 观察抗癌新药紫杉醇对不同类型淋巴瘤细胞的作用，探讨其应用价值。方法 应用倒置显微镜、显微镜、流式细胞术、DNA片段分析等方法，在体外观察了抗癌新药紫杉醇对3株不同类型淋巴瘤细胞株Jurkat (T细胞淋巴瘤)、BJAB ( B细胞淋巴瘤，EBV阴性)及Raji (B细胞淋巴瘤，EBV阳性)的作用。结果 紫杉醇对3株淋巴瘤细胞生长均有抑制作用，并可诱导细胞凋亡，但敏感性及程度不同。以Jurkat最为敏感，在一定剂量和作用时间范围内，主要表现为发生了细胞凋亡；BJAB次之，先发生G2/M期阻滞，继而发生细胞凋亡；Raji 最不敏感，主要表现为G2/M期阻滞，仅部分细胞进入细胞凋亡。结论 紫杉醇是淋巴瘤治疗有价值的化疗药，其敏感性可能随肿瘤类型、有无EB病毒感染和诱导细胞凋亡的程度而异。
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The effects of taxol on different types of lymphoma cell lines
ZHOU Xiaoyan, XU Liangzhong, HE Kailing, et al.
(Department of Pathology, Cancer Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032，China)
Abstract：Objective To observe the effects of new anticancer drug taxol on different types of lymphoma cells and to explore the value of its clinical application. Methods Inverted microscope, light microscope, electron microscope, FCM and DNA gel electrophoresis were used to observe the effects of taxol on three different types of lymphoma cell lines, including Jurkat (T cell lymphoma), BJAB (B cell lymphoma, EBV negative) and Raji (B cell lymphoma, EBV positive). Results Taxol can inhibit the growth and induce the apoptosis of all the three cell lines, while different sensitivities and apoptosis extent. Jurkat cells were most sensitive, mainly showing apoptosis; BJAB cells were last sensitive, showing G2/M arrest before apoptosis; Raji cells were last sensitive, mainly showing G2/M arrest and only part of cells going to apoptosis. Conclusion Taxol is a valuable chemotherapeutic agent for lymphoma. Its sensitivity differed with the types of lymphoma, EBV infection and the extent of induced apoptosis.
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Key Words：Antineoplastic Agents, phytogenic; Lymphoma； Cell line； Apoptosis▲
紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是从紫杉树皮中提取的一种抗癌新药[1]，它对晚期卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤有效，但有关淋巴瘤的研究较少，有报道紫杉醇对复发的中度恶性淋巴瘤较为敏感[2]，对种植于小鼠的同种同基因淋巴瘤有明显的抑制作用[3]。但紫杉醇对不同类型淋巴瘤细胞的作用及其机制尚少有研究。故我们选用3株代表性的淋巴瘤细胞株，即Jurkat (T细胞淋巴瘤)、BJAB(B细胞淋巴瘤，EBV阴性)及Raji (B细胞淋巴瘤，EBV阳性)，在体外观察了紫杉醇对他们的作用。
材料和方法
一、细胞株
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Jurkat为人T细胞淋巴瘤细胞株，由上海第二医科大学瑞金医院血液研究所提供；BJAB为人EB病毒阴性Burkitt′s淋巴瘤细胞株，由日本大阪大学医学院病理科Aozasa教授惠赠；Raji为人EB病毒阳性Burkitt′s淋巴瘤细胞株，从中国科学院细胞库购得。
二、细胞培养及紫杉醇处理
细胞在含体积分数10%的灭活小牛血清(杭州四季青生物工程研究所产品)、100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640(美国GIBCO公司产品)培养液中生长，常规条件下培养，2～3天传代1次。取指数生长期约3×105/ml细胞传代于培养瓶及接种于24孔板中，培养12 h后加入不同浓度紫杉醇[Bristol-Myers squibb company (princeton,NJ)]，继续培养不同时间，观察其生长，用4×10-3kg/L台盼蓝染色计数，计算细胞生长抑制率。
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三、研究方法及指标
1. 细胞形态学观察：对3株未处理及紫杉醇处理的淋巴瘤细胞作以下对比观察：(1)倒置显微镜下细胞形态改变，台盼蓝染色观察细胞膜通透性；(2)细胞均匀涂片，丙酮固定10 min, HE染色，光镜下观察；(3)电镜观察：将5×106的细胞按要求常规处理，超薄切片，在透射电镜JEM-1200EX下观察。
2.流式细胞术分析(FCM)：2×106的细胞用0.1 mol/L PBS洗涤 3次；体积分数为70%冷酒精固定30 min；体积分数1%的Triton X-100 10 ml处理10 min；1×10-4 kg/L的RNA酶1 ml处理10 min；2.5×10-3 kg/L 的碘化丙锭染色20 min；流式细胞仪分析。
3.DNA裂解分析：2×106的细胞用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，离心后弃上清，加60 μl PBS重新悬浮细胞；加等体积2×buffer(50 mmol/L Tris,40 mmol/L依地酸钠,1.6×10-2 kg/L Sarcoyl)充分混匀，RNase 1×10-4kg/L 50℃孵育30 min；蛋白酶K(美国Promega公司)1×10-3kg/L，50℃孵育4～24 h，70℃加热10 min；取上述细胞裂解产物30 μl，加6 μl 6x凝胶加样缓冲液，在1.5×10-2kg/L的琼脂糖凝胶上电泳，40v,4 h左右；紫外灯下观察并拍照。
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结果
一、紫杉醇对 3株淋巴瘤细胞生长的抑制及细胞凋亡的诱导
紫杉醇对Jurkat、BJAB和Raji细胞的生长均具有明显的抑制作用，Jurkat细胞对紫杉醇的反应最为敏感，用较小的剂量(1 ng/ ml)在短时间内(3～6 h)即可见抑制作用，BJAB、Raji细胞则需较高的浓度和较长时间，BJAB细胞比Raji细胞稍为敏感。在一定作用时间和剂量范围内，这种抑制作用具有时间效应和剂量效应(图1)，并表现为不同程度的细胞凋亡和G2/M期阻滞。紫杉醇诱导Jurkat细胞凋亡的浓度范围为：1～200 ng/ml, 时间为3～30 h；诱导BJAB、Raji细胞凋亡的浓度为40～4 000 ng/ml, 时间为12～36 h。如果超出该范围，细胞出现以细胞膜破裂、细胞溶解为特征的细胞坏死。下述内容均为在此剂量和时间范围内的观察结果。
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图1 紫杉醇在体外对Jurkat(A)、BJAB(B)、Raji(C)淋巴瘤细胞的生长抑制作用(各抑制率为5次重复实验的平均值)
二、紫杉醇作用后的细胞形态学改变
1. 倒置显微镜下观察:可见Jurkat和BJAB细胞在紫杉醇作用后部分细胞变长，膜鼓起或起泡，逐渐脱离细胞形成小体，而Raji细胞的主要改变为细胞透亮性下降，并见颗粒。台盼蓝染色均为阴性，表明细胞在紫杉醇作用后细胞膜完整，通透性未见明显改变。
2. 显微镜下观察：以Jurkat细胞的形态改变最为明显，1 ng/ ml紫杉醇作用 3 h即可见核浓缩、染色质靠核周边凝聚呈新月形、核裂解连同细胞膜、细胞浆形成凋亡小体。这种细胞的数量随时间和剂量的增加而增加(图2～5)，还可见少量核分裂期细胞。BJAB细胞在作用12 h时主要表现为核分裂期细胞，随着作用时间的延长，染色质浓缩靠边的细胞逐渐增多，并出现核裂解形成凋亡小体(图6～9)。而Raji细胞在紫杉醇作用后大部分为核分裂细胞，少部分细胞表现为染色质浓缩或断裂成多个致密小体(图10～13)。
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图2～5 Jurkat细胞100 ng/ml Taxol作用不同时间后光镜下观察显示细胞凋亡逐渐增加。图2.未处理组， 图3.处理6 h, 图4. 处理12 h, 图5. 处理24 h。HE ×100
图6～9 BJAB细胞在1 000 ng/ml Taxol作用不同时间后的光镜下观察结果。图6 未处理组， 图7 处理12 h(大部分细胞阻滞于分裂期), 图8 处理24 h(凋亡细胞逐渐增加), 图9 处理36 h(大部分细胞表现为细胞凋亡)HE ×100。
图10～13 Raji细胞在1 000 ng/ml Taxol作用不同时间后的光镜下观察结果。图10未处理组， 图11 处理12 h(大部分细胞阻滞于分裂期), 图12处理24 h，图13处理36 h, 图12，13均显示很少的细胞为细胞凋亡HE ×100
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三、流式细胞术分析
Jurkat细胞在紫杉醇作用后早期可见 S期细胞增多，同时在G1峰前出现亚二倍体峰，即凋亡小峰(Ap峰)，随后AP峰逐渐增高，并具有时间和剂量相关性。BJAB细胞在紫杉醇作用后首先表现为G2/M期的阻滞，在G1峰前出现AP小峰，随后G2/M逐渐降低，Ap逐渐增高。而Raji细胞主要表现为G2/M期阻滞，代表细胞凋亡的AP峰大多数小于10%。
四、 DNA片段分析
在紫杉醇作用后出现典型的DNA裂解片段梯形图谱(图14)，以Jurkat细胞最为明显。
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1.未处理组，2、3、4、5、6：分别为1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、 100 ng/ml及200 ng/ ml处理30 h
图14 Jurkat细胞在Taxol处理后出现DNA梯形图谱
讨论
研究表明，许多化疗药均能不同程度地诱导细胞凋亡，肿瘤细胞凋亡敏感性可能是化疗效果的关键因素[4]，因此能否诱导凋亡已成为筛选抗癌药物的标准之一，如何诱导凋亡也已成为新的化疗目标。
细胞凋亡时细胞、细胞核、DNA电泳、FCM分析均有特征性变化[5,6]，本研究通过对上述指标观察，清晰地显示了紫杉醇对3株淋巴瘤细胞的凋亡诱导作用及其发生的时间和程度。紫杉醇在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中已有应用，其作用机制是与微管结合使微管稳定性增强，抑制微管解聚，使细胞周期阻滞于分裂期[7]；并促进细胞凋亡[8,9]，本研究显示，紫杉醇对淋巴瘤细胞同样有这两方面的作用，其细胞凋亡的诱导作用表明紫杉醇将是淋巴瘤治疗中有价值的药物。
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不同类型的淋巴瘤细胞对紫杉醇诱发细胞凋亡的敏感性不同，它可能与细胞的表型及细胞内在基因如p53、bcl-2等的表达状态有关[10]，有报道造血系统的肿瘤比上皮来源的肿瘤易发生细胞凋亡[4]，p53野生型的细胞比p53突变型的细胞易诱发细胞凋亡[11]。本研究表明T淋巴瘤细胞比B淋巴瘤细胞易引起细胞凋亡，但这一结论是否带有普遍性尚需对更多的细胞株作进一步深入研究。另有研究表明EB病毒感染是影响细胞凋亡敏感性的因素，因此EB病毒感染可能是Raji细胞比EBV阴性的BJAB细胞不易发生细胞凋亡的原因。由于EB病毒感染是淋巴瘤发生的重要原因，而细胞凋亡的敏感性与药物抑制作用具有相关性，因此临床上用紫杉醇治疗淋巴瘤时，应注意到患者的肿瘤类型以及是否有EB病毒的感染,这些都可能是影响药物疗效的重要因素。
紫杉醇对淋巴瘤细胞的另一作用G2/M期阻滞均出现于细胞凋亡发生以前，提示分裂期阻滞可能是紫杉醇诱发细胞凋亡的重要因素。但Jurkat细胞出现很短时间的G2/M期阻滞后迅速进入细胞凋亡，而Raji细胞则主要表现为G2/M期阻滞，不易进入凋亡，因此不同类型的淋巴瘤细胞进入G2/M期阻滞的时间、从G2/M期阻滞到细胞凋亡的时间及进入细胞凋亡的能力是各不相同的。G2/M期阻滞可能与诱导细胞凋亡有关，但它并不是启动细胞凋亡的前提，细胞凋亡的发生也不是G2/M期阻滞的必然结果。小鼠体内研究表明分裂期阻滞与肿瘤生长的抑制无明显相关，而细胞凋亡与生长抑制明显相关，诱导细胞凋亡的能力是药物作用疗效的有用指标[3]。但处于分裂期的细胞比其它期细胞对放疗更为敏感，如果使用紫杉醇后联合放疗可能会使患者获得更好的治疗效果。
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细胞凋亡通常是在紫杉醇一定浓度和作用时间范围内发生，超出最高界限则表现为细胞坏死，这一现象提示如何更安全更有效地发挥其治疗作用，临床上大剂量使用化疗药常有严重的毒副作用，而小剂量作用所诱导的细胞凋亡同样是不可逆的改变，并受基因调控。
志谢 中国科学院上海细胞生物学研究所姚鑫院士在本课题设计及论文撰写方面予以指导■
基金项目：上海市领先医学基金资助项目(III-002)
参考文献：
[1]Long HJ. Paclitaxel (Taxol) : a novel anticancer chemotherapeutic drug. Mayo Clin Proc, 1994,69:341-345.
[2]Younes A, Sarris A, Melnyk A, et al. Three-hour palitaxel infusion in patients with refractory and relapsed non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol, 1995,13:583-587.
, 百拇医药
[3]Christopher GM, Kathryn AM, Nancy RH, et al. Relationship of mitotic arrest and apoptosis to antitumor effects of paclitaxel . J Natl Cancer Inst， 1996，88:1308-1314.
[4]Hickman JA.Apoposis and chemotherapy resistance. Eur J Cancer， 1996,32:921-926.
[5]Wyllie AH. Apoptosis: cell death in tissue regulation. J Pathol， 1987,153:133-138.
[6]Collins JA, Schandk CA,Young KK, et al. Major DNA fragmentation is a late event in apoptosis . J histo cytochem, 1997,45:923-933.
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[7]Milas L, Hunter NR, Kurdoglu B , et al. Kinetics of mitotic arrest and apoptosis in mammary and ovarian tumors treated with taxol. Cancer Chemother Pharmacol, 1995,35:297-303.
[8]Haldar S, Chintaplli J, Croce CM. Taxol induces bcl-2 phosphorylation and death of prostate cancer cells. Cancer Res, 1996,56:1253-1255.
[9]Bhalla K, Ibrado AM,Tourkina E, et al. Taxol induces internuleosoma; DNA fragmentation associated with programmed cell death in human myeloid leukemia cells. Leukemia， 1993,7:563-568.
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[10]Kerr JF, Winterford CM,Harmon BV. Apoptosis its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994;73:2013-2026.
[11]Fan S, EL-Detry W, Bael I, et al . p53 gene mutations are associated with decreased sensitivity of human lymphoma cells to DNA damaging agents. Cancer Res, 1994,54:5824-5830.
收稿日期：1999-01-11, 百拇医药
单位：周晓燕 许良中 朱伟萍 张太明 李小妹 金爱萍(200032 上海医科大学肿瘤医院病理科)；何开玲(上海医科大学生化教研室)
关键词：抗肿瘤药，植物；淋巴瘤；细胞系；脱噬作用
中华医学杂志000122 摘 要：目的 观察抗癌新药紫杉醇对不同类型淋巴瘤细胞的作用，探讨其应用价值。方法 应用倒置显微镜、显微镜、流式细胞术、DNA片段分析等方法，在体外观察了抗癌新药紫杉醇对3株不同类型淋巴瘤细胞株Jurkat (T细胞淋巴瘤)、BJAB ( B细胞淋巴瘤，EBV阴性)及Raji (B细胞淋巴瘤，EBV阳性)的作用。结果 紫杉醇对3株淋巴瘤细胞生长均有抑制作用，并可诱导细胞凋亡，但敏感性及程度不同。以Jurkat最为敏感，在一定剂量和作用时间范围内，主要表现为发生了细胞凋亡；BJAB次之，先发生G2/M期阻滞，继而发生细胞凋亡；Raji 最不敏感，主要表现为G2/M期阻滞，仅部分细胞进入细胞凋亡。结论 紫杉醇是淋巴瘤治疗有价值的化疗药，其敏感性可能随肿瘤类型、有无EB病毒感染和诱导细胞凋亡的程度而异。
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The effects of taxol on different types of lymphoma cell lines
ZHOU Xiaoyan, XU Liangzhong, HE Kailing, et al.
(Department of Pathology, Cancer Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032，China)
Abstract：Objective To observe the effects of new anticancer drug taxol on different types of lymphoma cells and to explore the value of its clinical application. Methods Inverted microscope, light microscope, electron microscope, FCM and DNA gel electrophoresis were used to observe the effects of taxol on three different types of lymphoma cell lines, including Jurkat (T cell lymphoma), BJAB (B cell lymphoma, EBV negative) and Raji (B cell lymphoma, EBV positive). Results Taxol can inhibit the growth and induce the apoptosis of all the three cell lines, while different sensitivities and apoptosis extent. Jurkat cells were most sensitive, mainly showing apoptosis; BJAB cells were last sensitive, showing G2/M arrest before apoptosis; Raji cells were last sensitive, mainly showing G2/M arrest and only part of cells going to apoptosis. Conclusion Taxol is a valuable chemotherapeutic agent for lymphoma. Its sensitivity differed with the types of lymphoma, EBV infection and the extent of induced apoptosis.
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Key Words：Antineoplastic Agents, phytogenic; Lymphoma； Cell line； Apoptosis▲
紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是从紫杉树皮中提取的一种抗癌新药[1]，它对晚期卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤有效，但有关淋巴瘤的研究较少，有报道紫杉醇对复发的中度恶性淋巴瘤较为敏感[2]，对种植于小鼠的同种同基因淋巴瘤有明显的抑制作用[3]。但紫杉醇对不同类型淋巴瘤细胞的作用及其机制尚少有研究。故我们选用3株代表性的淋巴瘤细胞株，即Jurkat (T细胞淋巴瘤)、BJAB(B细胞淋巴瘤，EBV阴性)及Raji (B细胞淋巴瘤，EBV阳性)，在体外观察了紫杉醇对他们的作用。
材料和方法
一、细胞株
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Jurkat为人T细胞淋巴瘤细胞株，由上海第二医科大学瑞金医院血液研究所提供；BJAB为人EB病毒阴性Burkitt′s淋巴瘤细胞株，由日本大阪大学医学院病理科Aozasa教授惠赠；Raji为人EB病毒阳性Burkitt′s淋巴瘤细胞株，从中国科学院细胞库购得。
二、细胞培养及紫杉醇处理
细胞在含体积分数10%的灭活小牛血清(杭州四季青生物工程研究所产品)、100U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640(美国GIBCO公司产品)培养液中生长，常规条件下培养，2～3天传代1次。取指数生长期约3×105/ml细胞传代于培养瓶及接种于24孔板中，培养12 h后加入不同浓度紫杉醇[Bristol-Myers squibb company (princeton,NJ)]，继续培养不同时间，观察其生长，用4×10-3kg/L台盼蓝染色计数，计算细胞生长抑制率。
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三、研究方法及指标
1. 细胞形态学观察：对3株未处理及紫杉醇处理的淋巴瘤细胞作以下对比观察：(1)倒置显微镜下细胞形态改变，台盼蓝染色观察细胞膜通透性；(2)细胞均匀涂片，丙酮固定10 min, HE染色，光镜下观察；(3)电镜观察：将5×106的细胞按要求常规处理，超薄切片，在透射电镜JEM-1200EX下观察。
2.流式细胞术分析(FCM)：2×106的细胞用0.1 mol/L PBS洗涤 3次；体积分数为70%冷酒精固定30 min；体积分数1%的Triton X-100 10 ml处理10 min；1×10-4 kg/L的RNA酶1 ml处理10 min；2.5×10-3 kg/L 的碘化丙锭染色20 min；流式细胞仪分析。
3.DNA裂解分析：2×106的细胞用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，离心后弃上清，加60 μl PBS重新悬浮细胞；加等体积2×buffer(50 mmol/L Tris,40 mmol/L依地酸钠,1.6×10-2 kg/L Sarcoyl)充分混匀，RNase 1×10-4kg/L 50℃孵育30 min；蛋白酶K(美国Promega公司)1×10-3kg/L，50℃孵育4～24 h，70℃加热10 min；取上述细胞裂解产物30 μl，加6 μl 6x凝胶加样缓冲液，在1.5×10-2kg/L的琼脂糖凝胶上电泳，40v,4 h左右；紫外灯下观察并拍照。
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结果
一、紫杉醇对 3株淋巴瘤细胞生长的抑制及细胞凋亡的诱导
紫杉醇对Jurkat、BJAB和Raji细胞的生长均具有明显的抑制作用，Jurkat细胞对紫杉醇的反应最为敏感，用较小的剂量(1 ng/ ml)在短时间内(3～6 h)即可见抑制作用，BJAB、Raji细胞则需较高的浓度和较长时间，BJAB细胞比Raji细胞稍为敏感。在一定作用时间和剂量范围内，这种抑制作用具有时间效应和剂量效应(图1)，并表现为不同程度的细胞凋亡和G2/M期阻滞。紫杉醇诱导Jurkat细胞凋亡的浓度范围为：1～200 ng/ml, 时间为3～30 h；诱导BJAB、Raji细胞凋亡的浓度为40～4 000 ng/ml, 时间为12～36 h。如果超出该范围，细胞出现以细胞膜破裂、细胞溶解为特征的细胞坏死。下述内容均为在此剂量和时间范围内的观察结果。
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图1 紫杉醇在体外对Jurkat(A)、BJAB(B)、Raji(C)淋巴瘤细胞的生长抑制作用(各抑制率为5次重复实验的平均值)
二、紫杉醇作用后的细胞形态学改变
1. 倒置显微镜下观察:可见Jurkat和BJAB细胞在紫杉醇作用后部分细胞变长，膜鼓起或起泡，逐渐脱离细胞形成小体，而Raji细胞的主要改变为细胞透亮性下降，并见颗粒。台盼蓝染色均为阴性，表明细胞在紫杉醇作用后细胞膜完整，通透性未见明显改变。
2. 显微镜下观察：以Jurkat细胞的形态改变最为明显，1 ng/ ml紫杉醇作用 3 h即可见核浓缩、染色质靠核周边凝聚呈新月形、核裂解连同细胞膜、细胞浆形成凋亡小体。这种细胞的数量随时间和剂量的增加而增加(图2～5)，还可见少量核分裂期细胞。BJAB细胞在作用12 h时主要表现为核分裂期细胞，随着作用时间的延长，染色质浓缩靠边的细胞逐渐增多，并出现核裂解形成凋亡小体(图6～9)。而Raji细胞在紫杉醇作用后大部分为核分裂细胞，少部分细胞表现为染色质浓缩或断裂成多个致密小体(图10～13)。
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图2～5 Jurkat细胞100 ng/ml Taxol作用不同时间后光镜下观察显示细胞凋亡逐渐增加。图2.未处理组， 图3.处理6 h, 图4. 处理12 h, 图5. 处理24 h。HE ×100
图6～9 BJAB细胞在1 000 ng/ml Taxol作用不同时间后的光镜下观察结果。图6 未处理组， 图7 处理12 h(大部分细胞阻滞于分裂期), 图8 处理24 h(凋亡细胞逐渐增加), 图9 处理36 h(大部分细胞表现为细胞凋亡)HE ×100。
图10～13 Raji细胞在1 000 ng/ml Taxol作用不同时间后的光镜下观察结果。图10未处理组， 图11 处理12 h(大部分细胞阻滞于分裂期), 图12处理24 h，图13处理36 h, 图12，13均显示很少的细胞为细胞凋亡HE ×100
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三、流式细胞术分析
Jurkat细胞在紫杉醇作用后早期可见 S期细胞增多，同时在G1峰前出现亚二倍体峰，即凋亡小峰(Ap峰)，随后AP峰逐渐增高，并具有时间和剂量相关性。BJAB细胞在紫杉醇作用后首先表现为G2/M期的阻滞，在G1峰前出现AP小峰，随后G2/M逐渐降低，Ap逐渐增高。而Raji细胞主要表现为G2/M期阻滞，代表细胞凋亡的AP峰大多数小于10%。
四、 DNA片段分析
在紫杉醇作用后出现典型的DNA裂解片段梯形图谱(图14)，以Jurkat细胞最为明显。
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1.未处理组，2、3、4、5、6：分别为1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、 100 ng/ml及200 ng/ ml处理30 h
图14 Jurkat细胞在Taxol处理后出现DNA梯形图谱
讨论
研究表明，许多化疗药均能不同程度地诱导细胞凋亡，肿瘤细胞凋亡敏感性可能是化疗效果的关键因素[4]，因此能否诱导凋亡已成为筛选抗癌药物的标准之一，如何诱导凋亡也已成为新的化疗目标。
细胞凋亡时细胞、细胞核、DNA电泳、FCM分析均有特征性变化[5,6]，本研究通过对上述指标观察，清晰地显示了紫杉醇对3株淋巴瘤细胞的凋亡诱导作用及其发生的时间和程度。紫杉醇在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中已有应用，其作用机制是与微管结合使微管稳定性增强，抑制微管解聚，使细胞周期阻滞于分裂期[7]；并促进细胞凋亡[8,9]，本研究显示，紫杉醇对淋巴瘤细胞同样有这两方面的作用，其细胞凋亡的诱导作用表明紫杉醇将是淋巴瘤治疗中有价值的药物。
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不同类型的淋巴瘤细胞对紫杉醇诱发细胞凋亡的敏感性不同，它可能与细胞的表型及细胞内在基因如p53、bcl-2等的表达状态有关[10]，有报道造血系统的肿瘤比上皮来源的肿瘤易发生细胞凋亡[4]，p53野生型的细胞比p53突变型的细胞易诱发细胞凋亡[11]。本研究表明T淋巴瘤细胞比B淋巴瘤细胞易引起细胞凋亡，但这一结论是否带有普遍性尚需对更多的细胞株作进一步深入研究。另有研究表明EB病毒感染是影响细胞凋亡敏感性的因素，因此EB病毒感染可能是Raji细胞比EBV阴性的BJAB细胞不易发生细胞凋亡的原因。由于EB病毒感染是淋巴瘤发生的重要原因，而细胞凋亡的敏感性与药物抑制作用具有相关性，因此临床上用紫杉醇治疗淋巴瘤时，应注意到患者的肿瘤类型以及是否有EB病毒的感染,这些都可能是影响药物疗效的重要因素。
紫杉醇对淋巴瘤细胞的另一作用G2/M期阻滞均出现于细胞凋亡发生以前，提示分裂期阻滞可能是紫杉醇诱发细胞凋亡的重要因素。但Jurkat细胞出现很短时间的G2/M期阻滞后迅速进入细胞凋亡，而Raji细胞则主要表现为G2/M期阻滞，不易进入凋亡，因此不同类型的淋巴瘤细胞进入G2/M期阻滞的时间、从G2/M期阻滞到细胞凋亡的时间及进入细胞凋亡的能力是各不相同的。G2/M期阻滞可能与诱导细胞凋亡有关，但它并不是启动细胞凋亡的前提，细胞凋亡的发生也不是G2/M期阻滞的必然结果。小鼠体内研究表明分裂期阻滞与肿瘤生长的抑制无明显相关，而细胞凋亡与生长抑制明显相关，诱导细胞凋亡的能力是药物作用疗效的有用指标[3]。但处于分裂期的细胞比其它期细胞对放疗更为敏感，如果使用紫杉醇后联合放疗可能会使患者获得更好的治疗效果。
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细胞凋亡通常是在紫杉醇一定浓度和作用时间范围内发生，超出最高界限则表现为细胞坏死，这一现象提示如何更安全更有效地发挥其治疗作用，临床上大剂量使用化疗药常有严重的毒副作用，而小剂量作用所诱导的细胞凋亡同样是不可逆的改变，并受基因调控。
志谢 中国科学院上海细胞生物学研究所姚鑫院士在本课题设计及论文撰写方面予以指导■
基金项目：上海市领先医学基金资助项目(III-002)
参考文献：
[1]Long HJ. Paclitaxel (Taxol) : a novel anticancer chemotherapeutic drug. Mayo Clin Proc, 1994,69:341-345.
[2]Younes A, Sarris A, Melnyk A, et al. Three-hour palitaxel infusion in patients with refractory and relapsed non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol, 1995,13:583-587.
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[3]Christopher GM, Kathryn AM, Nancy RH, et al. Relationship of mitotic arrest and apoptosis to antitumor effects of paclitaxel . J Natl Cancer Inst， 1996，88:1308-1314.
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收稿日期：1999-01-11, 百拇医药