肝毒清对小鼠急性肝损伤保护作用的药理研究★
作者：张小山 李宏春 古宇环 陆永和 刘英亮
单位：张小山 李宏春 古宇环 陆永和 刘英亮(广东省梅州市梅松路 514011)
关键词：＠肝毒清；药理学；肝炎；化学诱导；CCl4；毒性；小鼠▲
新中医000122摘 要：分别用四氯化碳(CCl4)和扑热息痛(AAP)复制了2种小鼠急性肝损伤模型，观察肝毒清对急性实验性肝损伤的保护作用。结果表明：肝毒清高、低剂量均能明显降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST(P<0.05，P<0.01)，减少肝脏指数(P<0.05)，改善病理变化，肝毒清高、低剂量对CCl4所致小鼠急性肝损伤的ALT、AST、肝脏指数及病理变化等指标有改善趋势，但差异无显著性意义(P>0.05)。
肝毒清为我院生产的纯中药制剂，具有清热解毒、扶正益气的作用，临床上应用于治疗HBsAg阳性者及慢性乙型肝炎。为证实其疗效，我们对肝毒清保护急性肝损伤的作用进行了药理研究。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 实验动物 NIH小鼠共100只，雌雄各半，体重18～22g，购自广东省卫生厅实验动物养殖场，合格证号：98A017。
1.2 药物 肝毒清糖衣片：梅州市中医院制剂，批号：980509。联苯双酯滴丸：浙江新昌制药股分有限公司出品，批号：980215-1。对乙酰氨基酚片：汕头金石制药总厂出品，批号：970520。
1.3 试剂 CCl4：AR，广州化学试剂厂出品，批号：980707-2。ALT测定试剂盒：卫生部上海生物制品研究所、卫生部临床诊断试剂实验中心出品，批号：980604。AST测定试剂盒：卫生部上海生物制品研究所、卫生部临床诊断试剂实验中心出品，批号：980801。
1.4 阳性药物选择及剂量设置 选择临床保肝、降酶作用确切的常用药物联苯双酯作为阳性对照药，所用剂量为成人临床用量(0.7 mg/kg体重)的20倍；肝毒清高、低剂量分别是临床用量(0.84 g/kg体重)的20倍、10倍。
, 百拇医药
1.5 统计方法 用t检验统计。
2 实验方法与结果
2.1 对扑热息痛所致小鼠急性肝损伤的影响 取NIH健康小鼠共50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，每组10只，灌胃给药，正常组与模型组给予等容积的蒸馏水，每天1次，连续5天，末次给药后1小时，除正常组外，各组灌胃给予扑热息痛500mg/kg，正常组给予等容积蒸馏水，禁食12小时，眼眶取血，以速率法测定ALT、AST，并取肝脏称重，每组取8只送病检。结果见表1、表2。
表1结果表明：模型组与正常组的ALT、AST比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量组均能显著降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤血清A L T、AST(P<0.05)。联苯双酯也有同样作用(P<0.01)。模型组与正常组之肝脏指数比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量均能显著降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤肝脏指数(P<0.05)。联苯双酯也有同样作用(P<0.05)。
, 百拇医药
病理检查：正常组大部分镜下显示肝小叶结构正常，未见肝细胞变性、坏死或纤维化等病理变化。其中2例可见脂肪空泡及浊肿改变。模型组镜下见程度不等的肝细胞坏死伴炎细胞浸润，部分可伴有浊肿。联苯双酯组、肝毒清高、低剂量组与模型组比较，肝细胞变性、坏死等损伤性变化有一定减轻，尤其在肝毒清高、低剂量组各有1例恢复正常。见表2。
2.2 对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响 取NIH健康小鼠共50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，每组10只，灌胃给药，正常组与模型组给予等容积的蒸馏水，每天1次，连续5天，末次给药后1小时，除正常组外，各组腹腔注射0.05%CCl4花生油溶液10 ml/kg体重，正常组注射等容积花生油，4小时后再灌胃给药1次，禁食12小时，眼眶取血，以速率法测定ALT、AST，并取肝脏称重，每组取8只送病检。结果见表3、表4。表1
扑热息痛所致小鼠急性肝损伤ALT、AST及肝脏指数的影响(
±s) 组 别
, 百拇医药
剂量(g/kg)
n
ALT(U/L)
AST(U/L)
肝脏指数(g/10g体重)
正常组
-
10
28.54±1.50※※
107.07±16.49※※
0.396±0.0481※※
, 百拇医药
模型组
-
10
190.78±92.11
218.39±89.98
0.4908±0.0816
联苯双酯组
15mg/kg
10
79.24±39.28※※
105.10±77.48※※
, 百拇医药
0.4110±0.0849※
肝毒清组
8.4
10
102.81±49.76※
130.23±68.70※
0.3835±0.1064※
16.8
10
98.89±64.51※※
112.30±75.41
, http://www.100md.com
0.4132±0.0809※
注：与模型组比较：※P<0.05，※※P<0.01(下同)
表2
扑热息痛所致小鼠急性肝损伤病理变化的影响(例) 组 别
n
剂量(g/kg)
肝细胞变性
肝细胞坏死
-
+
++
, http://www.100md.com +++
-
+
++
+++
++++
正常组
8
-
6
2
0
0
8
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0
0
0
0
模型组
8
-
0
2
3
3
0
1
1
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3
3
联苯双酯组
8
15mg/kg
0
3
4
1
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0
2
3
, 百拇医药
肝毒清组
8
8.4
1
3
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1
1
3
2
1
1
8
16.8
, 百拇医药
1
4
3
0
1
4
2
0
1
注：肝细胞变性程度：- 肝细胞无变性；+ 变性占肝小叶<1/3；++ 变性占肝小叶1/3～2/3；+++ 变性占肝小叶>2/3。
肝细胞坏死程度：- 肝细胞无坏死；+ 坏死占肝小叶<1/4；++ 坏死占肝小叶1/4～1/3；+++ 1/3<坏死占肝小叶≤1/2；++++ 坏死占肝小叶>1/2。(下同)
, 百拇医药
表3
CCl4所致小鼠急性肝损伤ALT、AST及肝脏指数的影响(x±s) 组别
剂量(g/kg)
n
ALT(U/L)
AST(U/L)
肝脏指数(g/10g体重)
正常组
-
10
28.54±1.50※※
, 百拇医药
107.07±16.49※※
0.3961±0.0481※※
模型组
-
10
242.07±32.95
252.56±48.49
0.4670±0.0566
联苯双酯组
15mg/kg
10
, 百拇医药
127.02±33.92※※
163.41±36.25※※
0.4431±0.0425
肝毒清组
8.4
10
228.40±35.99
214.83±61.60
0.4589±0.0587
16.8
10
, 百拇医药
223.11±22.17
204.71±68.11
0.4491±0.0556
表4CCl4所致小鼠急性肝损伤病理变化的影响(例) 组 别
n
剂量(g/kg)
肝细胞变性
肝细胞坏死
-
+
++
+++
, 百拇医药
-
+
++
+++
++++
正常组
8
-
6
2
0
0
8
0
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0
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0
模型组
8
-
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0
3
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2
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6
联苯双酯组
8
15mg/kg
0
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0
1
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2
5
肝毒清组
, 百拇医药
8
8.4
0
3
3
2
0
0
1
1
6
8
16.8
0
, 百拇医药
5
2
1
0
1
1
0
6
表3结果表明：模型组与正常组的ALT、AST比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量组虽然有降低CCl4所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的趋势，但差异无显著性意义(P>0.05)。联苯双酯能明显降低CCl4所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST (P<0.01)。模型组与正常组之肝脏指数比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量对CCl4所致小鼠急性肝损伤肝脏指数升高无明显影响(P>0.05)。联苯双酯作用亦不明显(P>0.05)。
, 百拇医药
病理检查：正常组同试验1。模型组肝细胞镜下均显示凝固性坏死，并各占50%左右，坏死主要分布在小叶的中央部，部分呈桥接坏死。肝毒清高、低剂量组肝细胞变性坏死仍很严重，与模型组比较，仅有1～2例坏死程度略有减轻。联苯双酯组变性、坏死程度与模型组比较，略有减轻。见表4。
3 讨论
本实验分别用CCl4和AAP复制了2种小鼠急性肝损伤模型，观察肝毒清糖衣片对急性肝损伤的保护作用。结果表明：肝毒清高、低剂量组均能明显降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST，减少肝脏指数，改善病理变化。肝毒清高、低剂量对CCl4所致小鼠急性肝损伤的ALT、AST、肝脏指数及病理变化等指标有改善趋势，但差异无显著性意义。
AAP为一种常用的研究药物代谢、药物相互作用和筛选抗肝炎药的急性肝损伤造模型药，药理上，治疗量AAP主要的代谢途径是与葡萄糖醛酸或硫酸结合，少量在细胞色素P450催化下氧化形成芳香化的毒性中间代谢产物，该产物通过与谷胱甘肽(GSH)结合而解毒。给予大剂量后，因结合代谢途径饱和，肝GSH耗竭，毒性代谢产物与肝内生物大分子结合，导致肝细胞坏死。凡能减少毒性代谢产物形成，促进其解毒，或直接保护肝细胞受损害的药物均能减轻AAP的毒性。据报道，一些药物可作为GSH前体物，或直接与毒性代谢物结合；或诱导GSH合成，因而促进毒性代谢产物解毒，或抑制P450，使足够的硫酸盐把AAP引向代谢途径，从而减少毒性代谢物形成，保护肝细胞的结构和功能。肝毒清对AAP致小鼠急性肝损伤有保护作用，提示可能是通过上述途径实现的。
, 百拇医药
CCl4可诱发小鼠急性肝损伤，其代谢途径是在肝脏经P450作用转变成CCl3。CCl3为自由基，可攻击肝细胞膜，引起脂质过氧化，破坏肝细胞的结构和功能。本研究发现肝毒清对CCl4所致小鼠急性肝损伤无明显影响，提示肝毒清对肝细胞的保护作用，可能不是通过抗脂质过氧化来实现的。
(本项目药理实验研究在广州中医药大学中药研究所中药药理毒理研究室协助下完成，特此致谢)。■
★广东省中医药管理局课题(97297)
(修回日期：1999-07-14), 百拇医药
单位：张小山 李宏春 古宇环 陆永和 刘英亮(广东省梅州市梅松路 514011)
关键词：＠肝毒清；药理学；肝炎；化学诱导；CCl4；毒性；小鼠▲
新中医000122摘 要：分别用四氯化碳(CCl4)和扑热息痛(AAP)复制了2种小鼠急性肝损伤模型，观察肝毒清对急性实验性肝损伤的保护作用。结果表明：肝毒清高、低剂量均能明显降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST(P<0.05，P<0.01)，减少肝脏指数(P<0.05)，改善病理变化，肝毒清高、低剂量对CCl4所致小鼠急性肝损伤的ALT、AST、肝脏指数及病理变化等指标有改善趋势，但差异无显著性意义(P>0.05)。
肝毒清为我院生产的纯中药制剂，具有清热解毒、扶正益气的作用，临床上应用于治疗HBsAg阳性者及慢性乙型肝炎。为证实其疗效，我们对肝毒清保护急性肝损伤的作用进行了药理研究。
, http://www.100md.com
1 实验材料
1.1 实验动物 NIH小鼠共100只，雌雄各半，体重18～22g，购自广东省卫生厅实验动物养殖场，合格证号：98A017。
1.2 药物 肝毒清糖衣片：梅州市中医院制剂，批号：980509。联苯双酯滴丸：浙江新昌制药股分有限公司出品，批号：980215-1。对乙酰氨基酚片：汕头金石制药总厂出品，批号：970520。
1.3 试剂 CCl4：AR，广州化学试剂厂出品，批号：980707-2。ALT测定试剂盒：卫生部上海生物制品研究所、卫生部临床诊断试剂实验中心出品，批号：980604。AST测定试剂盒：卫生部上海生物制品研究所、卫生部临床诊断试剂实验中心出品，批号：980801。
1.4 阳性药物选择及剂量设置 选择临床保肝、降酶作用确切的常用药物联苯双酯作为阳性对照药，所用剂量为成人临床用量(0.7 mg/kg体重)的20倍；肝毒清高、低剂量分别是临床用量(0.84 g/kg体重)的20倍、10倍。
, 百拇医药
1.5 统计方法 用t检验统计。
2 实验方法与结果
2.1 对扑热息痛所致小鼠急性肝损伤的影响 取NIH健康小鼠共50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，每组10只，灌胃给药，正常组与模型组给予等容积的蒸馏水，每天1次，连续5天，末次给药后1小时，除正常组外，各组灌胃给予扑热息痛500mg/kg，正常组给予等容积蒸馏水，禁食12小时，眼眶取血，以速率法测定ALT、AST，并取肝脏称重，每组取8只送病检。结果见表1、表2。
表1结果表明：模型组与正常组的ALT、AST比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量组均能显著降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤血清A L T、AST(P<0.05)。联苯双酯也有同样作用(P<0.01)。模型组与正常组之肝脏指数比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量均能显著降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤肝脏指数(P<0.05)。联苯双酯也有同样作用(P<0.05)。
, 百拇医药
病理检查：正常组大部分镜下显示肝小叶结构正常，未见肝细胞变性、坏死或纤维化等病理变化。其中2例可见脂肪空泡及浊肿改变。模型组镜下见程度不等的肝细胞坏死伴炎细胞浸润，部分可伴有浊肿。联苯双酯组、肝毒清高、低剂量组与模型组比较，肝细胞变性、坏死等损伤性变化有一定减轻，尤其在肝毒清高、低剂量组各有1例恢复正常。见表2。
2.2 对CCl4所致小鼠急性肝损伤的影响 取NIH健康小鼠共50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，每组10只，灌胃给药，正常组与模型组给予等容积的蒸馏水，每天1次，连续5天，末次给药后1小时，除正常组外，各组腹腔注射0.05%CCl4花生油溶液10 ml/kg体重，正常组注射等容积花生油，4小时后再灌胃给药1次，禁食12小时，眼眶取血，以速率法测定ALT、AST，并取肝脏称重，每组取8只送病检。结果见表3、表4。表1
扑热息痛所致小鼠急性肝损伤ALT、AST及肝脏指数的影响(
±s) 组 别, 百拇医药
剂量(g/kg)
n
ALT(U/L)
AST(U/L)
肝脏指数(g/10g体重)
正常组
-
10
28.54±1.50※※
107.07±16.49※※
0.396±0.0481※※
, 百拇医药
模型组
-
10
190.78±92.11
218.39±89.98
0.4908±0.0816
联苯双酯组
15mg/kg
10
79.24±39.28※※
105.10±77.48※※
, 百拇医药
0.4110±0.0849※
肝毒清组
8.4
10
102.81±49.76※
130.23±68.70※
0.3835±0.1064※
16.8
10
98.89±64.51※※
112.30±75.41
, http://www.100md.com
0.4132±0.0809※
注：与模型组比较：※P<0.05，※※P<0.01(下同)
表2
扑热息痛所致小鼠急性肝损伤病理变化的影响(例) 组 别
n
剂量(g/kg)
肝细胞变性
肝细胞坏死
-
+
++
, http://www.100md.com +++
-
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++++
正常组
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联苯双酯组
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注：肝细胞变性程度：- 肝细胞无变性；+ 变性占肝小叶<1/3；++ 变性占肝小叶1/3～2/3；+++ 变性占肝小叶>2/3。
肝细胞坏死程度：- 肝细胞无坏死；+ 坏死占肝小叶<1/4；++ 坏死占肝小叶1/4～1/3；+++ 1/3<坏死占肝小叶≤1/2；++++ 坏死占肝小叶>1/2。(下同)
, 百拇医药
表3
CCl4所致小鼠急性肝损伤ALT、AST及肝脏指数的影响(x±s) 组别
剂量(g/kg)
n
ALT(U/L)
AST(U/L)
肝脏指数(g/10g体重)
正常组
-
10
28.54±1.50※※
, 百拇医药
107.07±16.49※※
0.3961±0.0481※※
模型组
-
10
242.07±32.95
252.56±48.49
0.4670±0.0566
联苯双酯组
15mg/kg
10
, 百拇医药
127.02±33.92※※
163.41±36.25※※
0.4431±0.0425
肝毒清组
8.4
10
228.40±35.99
214.83±61.60
0.4589±0.0587
16.8
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, 百拇医药
223.11±22.17
204.71±68.11
0.4491±0.0556
表4CCl4所致小鼠急性肝损伤病理变化的影响(例) 组 别
n
剂量(g/kg)
肝细胞变性
肝细胞坏死
-
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++++
正常组
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6
联苯双酯组
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肝毒清组
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表3结果表明：模型组与正常组的ALT、AST比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量组虽然有降低CCl4所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST的趋势，但差异无显著性意义(P>0.05)。联苯双酯能明显降低CCl4所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST (P<0.01)。模型组与正常组之肝脏指数比较差异有非常显著性意义(P<0.01)，说明造模成功。肝毒清高、低剂量对CCl4所致小鼠急性肝损伤肝脏指数升高无明显影响(P>0.05)。联苯双酯作用亦不明显(P>0.05)。
, 百拇医药
病理检查：正常组同试验1。模型组肝细胞镜下均显示凝固性坏死，并各占50%左右，坏死主要分布在小叶的中央部，部分呈桥接坏死。肝毒清高、低剂量组肝细胞变性坏死仍很严重，与模型组比较，仅有1～2例坏死程度略有减轻。联苯双酯组变性、坏死程度与模型组比较，略有减轻。见表4。
3 讨论
本实验分别用CCl4和AAP复制了2种小鼠急性肝损伤模型，观察肝毒清糖衣片对急性肝损伤的保护作用。结果表明：肝毒清高、低剂量组均能明显降低扑热息痛所致小鼠急性肝损伤血清ALT、AST，减少肝脏指数，改善病理变化。肝毒清高、低剂量对CCl4所致小鼠急性肝损伤的ALT、AST、肝脏指数及病理变化等指标有改善趋势，但差异无显著性意义。
AAP为一种常用的研究药物代谢、药物相互作用和筛选抗肝炎药的急性肝损伤造模型药，药理上，治疗量AAP主要的代谢途径是与葡萄糖醛酸或硫酸结合，少量在细胞色素P450催化下氧化形成芳香化的毒性中间代谢产物，该产物通过与谷胱甘肽(GSH)结合而解毒。给予大剂量后，因结合代谢途径饱和，肝GSH耗竭，毒性代谢产物与肝内生物大分子结合，导致肝细胞坏死。凡能减少毒性代谢产物形成，促进其解毒，或直接保护肝细胞受损害的药物均能减轻AAP的毒性。据报道，一些药物可作为GSH前体物，或直接与毒性代谢物结合；或诱导GSH合成，因而促进毒性代谢产物解毒，或抑制P450，使足够的硫酸盐把AAP引向代谢途径，从而减少毒性代谢物形成，保护肝细胞的结构和功能。肝毒清对AAP致小鼠急性肝损伤有保护作用，提示可能是通过上述途径实现的。
, 百拇医药
CCl4可诱发小鼠急性肝损伤，其代谢途径是在肝脏经P450作用转变成CCl3。CCl3为自由基，可攻击肝细胞膜，引起脂质过氧化，破坏肝细胞的结构和功能。本研究发现肝毒清对CCl4所致小鼠急性肝损伤无明显影响，提示肝毒清对肝细胞的保护作用，可能不是通过抗脂质过氧化来实现的。
(本项目药理实验研究在广州中医药大学中药研究所中药药理毒理研究室协助下完成，特此致谢)。■
★广东省中医药管理局课题(97297)
(修回日期：1999-07-14), 百拇医药