人骨肉瘤中p21waf1/cip1基因的表达
作者：李月白 秦国斌 王义生 李甲振 吴学建
单位：李月白(450052 郑州，河南医科大学基础医学院生化教研室)；秦国斌(安阳市第一人民医院骨科)；王义生 李甲振 吴学建(河南医科大学第一附属医院骨科)
关键词：骨肉瘤；基因，抑制，肿瘤；细胞周期蛋白质类；基因表达；原位杂交；免疫组织化学
中华骨科杂志000107
【摘要】目的 探讨p21waf1/cip1基因在人骨肉瘤中的作用，了解其在骨肉瘤、骨软骨瘤和正常骨组织中的表达。方法 应用免疫组化LSAB法和原位杂交方法，检测了p21waf1/cip1蛋白及p21waf1/cip1基因在40例骨肉瘤、20例骨软骨瘤和20例正常骨组织中的表达。并通过近4年的临床随访，观察了骨肉瘤患者p21waf1/cip1表达水平与临床预后之间的关系。结果 骨肉瘤组织中p21waf1/cip1蛋白的阳性反应率和阳性反应强度均明显高于骨软骨瘤和正常骨组织，其差异有显著性意义(P<0.05)。骨肉瘤组织中p21waf1/cip1基因的总体表达趋势与免疫组化基本一致，其阳性反应的41.2%为中度和强阳性表达，二者的阳性反应存在显著相关性(P<0.01)。骨软骨瘤和正常骨组织在p21基因水平的阳性率比蛋白水平明显增高，但全部是弱或微弱的阳性表达，说明正常p21waf1/cip1蛋白受多途径和多种因素的修饰。临床随访中，p21基因高表达型患者与低表达型患者之间，在复发转移和生存时间方面差异有显著性意义(P<0.05)，高表达患者的生存时间短。结论 人骨肉瘤中存在p21waf1/cip1蛋白的积聚和p21waf1/cip1基因的过表达，并且这种蛋白的积聚和过表达与临床预后可能有关。
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The expression of p21waf1/cip1 gene in human osteosarcoma
LI Yuebai QIN Guobin WANG Yisheng
(Department of Biochemistry, Henan Medical University, Zhengzhou 450052,China)
【Abstract】 Objective To study the action of p21waf1/cip1 gene in human osteosarcoma and compare its expression conditions in the osteosarcoma, osteochondroma and normal osseous tissues. Methods The expression of p21waf1/cip1 protein and gene were observed in 40 cases of osteosarcoma， 20 cases of osteochondroma and 20 cases of normal osseous tissues with LSAB immunohistochemical method and cDNA in situ hybridization technique. The samples of osteosarcoma and osteochondroma had been procured from the resected tumor immediately after surgery, and normal osseous tissues for control study were collected from surgical cases without tumor or inflammation. Results In immunohistochemical observation, thirty one of forty osteosarcomas showed positive reaction of p21waf1/cip1protein, giving a positive rate of 77.5% . However the positive rates of p2waf1/cip1 protein in osteochondroma and normal osseous tissues were only 60% and 50% respectively. The positive reaction rate and intensity of p21waf1/cip1 protein specimens were significantly higher in osteosarcoma than osteochondroma and normal osseous tissues (P<0.05). The positive expression rate of p21waf1/cip1 gene in osteosarcoma was 85% and lower than that of osteochondroma (90% ) and normal osseous tissues (100% ) with in situ hybridization examination;41.2% (7/17) had moderate or strong positive expression. Conclusion There is an accumulation of p21waf1/cip1 protein and over expression of p21 gene in osteosarcoma, which may play an important role in the development of human osteosarcoma.
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【Key words】 Osteosarcoma； Genes, suppressor, tumor； Cell cycle proteins; Gene expression; In situ hybridization； Immunohistochemistry
近年来，细胞周期调控已成为肿瘤研究的热点，而抑癌基因的负性调节作用更加受到国内外学者的高度重视。p21waf1/cip1基因就是近年来发现的一个新的抑癌基因，此基因自从1993年被学者们[1,2]从不同的角度发现以来，已成为CKIs(cyclin-dependentkinaseinhibitors,CKIs)双重特异家族的首要成员。有研究发现p21在人体大多数组织中均有表达[3]，但在骨肉瘤组织中的作用，国内外研究不多，其转录水平的蛋白和基因表达情况还未见报道。本实验采用免疫组化和原位杂交方法分别检测了人骨肉瘤、骨软骨瘤和正常骨组织中p21waf1/cip1蛋白和p21基因mRNA的表达情况。
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材料与方法
一、标本
(一)病例和标本
在河南省各大医院收集到新鲜骨肉瘤标本40例，除1例伴有肺转移外，其余病例术前均未发现有远处转移。20例骨软骨瘤全部取自河南医科大学第一附属医院骨科的新鲜手术标本，手术时间为1996年4月～1997年7月。20例正常骨组织取自非炎症和非肿瘤患者的健康骨。全部标本均经河南医科大学病理教研室确定诊断，并对骨肉瘤标本做了病理分型。标本组织均经40g/L多聚甲醛固定，固定后含钙组织经0.2686mol/LEDTA(pH=7.4)脱钙4周左右，脱钙完成后，常规石蜡包埋，3μm连续超薄切片用于HE染色、免疫组化和原位杂交检测。
(二)主要试剂
鼠抗人单克隆抗体p21waf1/cip1(Ab-1)，为美国Oncogene科学公司产品，生物素标记p21cDNA探针(2kb，随机引物法标记)来自北京医科大学分子病理学实验室。LSAB免疫组化染色检测试剂盒(SP-9002)为美国ZYMED公司产品,原位杂交检测试剂为美国Promega公司产品，由河南医科大学分子细胞生物学研究中心提供。
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二、方法
(一)免疫组化染色：参考LSAB免疫组化染色法，全部切片染色在相同条件下进行，单抗稀释度为1∶70，生物素标记的二抗和HRP标记的三抗稀释度均为1∶200。免疫组化对照染色的组织切片分为两组，每组两片，一组与实验用切片平行操作，同样条件下进行，另一组免去过氧化氢孵育和微波修复两步，其它程序与实验用切片同条件进行；用已知p21waf1/cip1阳性的组织切片作为阳性对照；用PBS代替一抗孵育已知阳性的组织切片，作为空白对照；用相同浓度的正常山羊血清代替一抗孵育已知阳性的组织切片作为替代对照,具体操作步骤按免疫组化试剂盒说明进行。
(二)原位杂交：检测步骤参考吴景兰等“非放射性分子生物学实验技术”的操作程序进行，最后不进行复染。实验中以已知p21mRNA阳性的组织切片作为阳性对照；用同一已知阳性切片的连续切片，平行操作，以预杂交液代替杂交液作自身空白对照，用0.1mg/mlRNase预处理阳性的切片作为阴性对照。实验中随机选取2张切片，进行内源性碱性磷酸酶检测，以证明内源性碱性磷酸酶无活性，实验效果不受其影响。
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三、结果判定标准
(一)免疫组化中p21waf1/cip1蛋白以细胞核着色为主，在细胞核内出现棕黄色染色者为阳性细胞；p21waf1/cip1原位杂交的显色剂是NBT,其阳性信号是紫蓝色，主要位于细胞浆内。根据反应程度，染色也有强弱之分，观察不同病变的表达情况,统计检测指标的阳性表达率，参照Fromowitz等[4,5]方法计算免疫组化阳性细胞百分比，选择连续的10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，凡细胞核表现为棕黄色着色者，不论深浅均计为阳性细胞，按其中的阳性细胞数，计算出阳性细胞的平均百分比,作为该例标本的阳性细胞百分比进行计分，分值按小于等于5%、6%～15%、16%～25%、26%～50%和大于50%，分别计分为0、1、2、3、4。染色强度分为不着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色四个级别，计分分别为0、1、2、3。最后以阳性细胞百分比计分和染色强度计分之和作为总分进行结果判定。0分为阴性(-)，1分为微弱阳性(±)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，大于6分为强阳性(+++)。
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(二)p21原位杂交的结果判定按10个高倍视野下阳性细胞数的绝对值与阳性信号强度之和来计分。阳性细胞数小于10个为0分，10～25个为1分，26～50个为2分，51～75个为3分，大于75个为4分；阳性细胞颗粒信号强度按无、弱、较强、强、很强5个级别，分别将分值计为0、1、2、3、4。阳性强度的总分判定，其分值划分同上。
四、统计学处理
对检测结果用Ridit分析判断差异的显著性，对相关的判断使用Spearman等级相关分析进行统计学处理，α值取0.05，进行双侧检验。
五、临床随访
本组病例均行常规截肢手术和术后化疗，自1995年9月至今随访11例，按p21waf1/cip1表达水平分为高表达型(高于或等于++)和低表达型(低于++)。
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结果
一、对照染色
实验中阳性对照均为阳性染色，空白和替代对照均为阴性。
二、免疫组化染色结果
(一)骨肉瘤组织
40例骨肉瘤组织中有31例呈阳性反应，阳性率为77.5%，阳性细胞的分布35%呈局灶型分布，余为片状分布。阳性反应:强阳性(+++)4例，中度阳性(++)9例，弱阳性(+)12例，微弱阳性(±)6例(图1～3)。
图1 骨肉瘤组织对抗p21waf1/cip1蛋白单克隆抗体呈阳性反应，阳性细胞片状分布LSAB×200
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图2 骨软骨瘤中对抗p21waf1/cip1蛋白单克隆抗体呈弱阳性反应，阳性细胞散在分布LSAB×400
图3 正常骨组织对抗p21waf1/cip1蛋白单克隆抗体呈弱阳性反应，阳性细胞散在分布LSAB×400
(二)骨肉瘤、骨软骨瘤和正常骨组织阳性率及染色强度比较
40例骨肉瘤中阳性率为77.5%，20例骨软骨瘤的阳性率为60%，正常骨组织的阳性反应率为40%。三组间染色强度比较(Ridit分析)骨肉瘤组与正常骨组差异有显著性意义(P<0.01)，其染色反应强度的比较见表1。结果提示p21waf1/cip1在骨肉瘤组织中有高表达，其蛋白积聚的性质有待进一步研究。
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表1 骨肉瘤、骨软骨瘤和正常骨组织
之间p21waf1/cip1蛋白染色强度比较 组 别
例数
染色反应例数
阳性率(%)
-
±
+
++
+++
骨肉瘤(a)
40
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9
6
12
9
4
77.5
骨软骨瘤(b)
20
8
4
2
6
0
60.0
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正常骨(c)
20
12
8
0
0
0
40.0
注：Ridit分析:a与b比，U=1.9718,P=0.05；a与c比，U=3.9528,P<0.05， b与 c比 ， U=1.344 0,P>0.05
三、原位杂交结果
(一)骨肉瘤组织
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杂交检测20例骨肉瘤组织，呈阳性反应者17例，阳性率为85%，阳性细胞呈局灶型分布者8例，占阳性反应例数的47.1%，其余为片状分布(图4)。17例杂交阳性的骨肉瘤组织中，微弱阳性(±)4例，弱阳性(+)6例，中度阳性(++)4例，强阳性(+++)3例。
图4 骨肉瘤组织中有p21mRNA的高表达，阳性细胞片状分布ISHH×400
(二)骨肉瘤、骨软骨瘤、正常骨组织基因表达阳性率及染色强度比较
20例骨肉瘤组织中阳性率为85%，其中中度和强阳性表达占41.2%；10例骨软骨瘤中发现阳性杂交信号9例，阳性率90%，阳性细胞呈散在分布；原位杂交检测10例正常骨组织，全部有弱阳性杂交信号，但阳性细胞数少，阳性细胞为散在分布。骨肉瘤组织与骨软骨瘤和正常骨组织原位杂交阳性表达强度的比较见表2。
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表2 骨肉瘤、骨软骨瘤、正常骨组织中
p21waf1/cip1基因阳性表达强度的比较 组 别
例数
阳 性 表 达
阳性率(%)
-
±
+
++
+++
骨肉瘤
20
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3
4
6
4
3
85
骨软骨瘤
10
1
4
5
0
0
90
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正常骨
10
0
4
6
0
0
100
四、两种检测结果的相关性两种检测方法所得结果进行Spearman等级相关分析，二者在阳性反应程度上有正相关关系(rs=0.900，P<0.01)。两种检测方法之间的阳性反应关系见表3。表3 骨肉瘤中p21waf1/cip1蛋白和p21waf1/cip1基因
之间的阳性反应关系 p21waf1/cip1蛋白染色反应
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p21waf1/cip1基因染色反应
-
±
+
++
+++
-
3
0
0
0
1
±
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0
3
0
0
0
+
0
0
6
0
0
++
0
1
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0
4
0
+++
0
0
0
0
2
五、病例随访结果
本组随访病例，在骨肉瘤组内呈高表达型者，其复发转移和生存时间短，而低表达型者，其复发转移和生存时间有相对延长的趋势。p21waf1/cip1基因表达水平与骨肉瘤患者临床预后之间的可能关系见表4。表4 p21waf1/cip1基因表达水平
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与临床预后之间的关系 组 别
例数
术后存活时间
死亡原因
1年以内
1～2年
2～3年
3年以上
高表达组
6
2
3
1
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0
复发转移
低表达组
5
0
1
3
1
复发转移
注：Wilcoxon法:高表达组平均秩次3.83，低表达组平均秩次8.60，P<0.05
讨论
1993年，El-Deiry等[1]和Harper等[2]从不同的研究角度各自发现了一种新的细胞生长分裂的抑制物，分别称作waf1(wildtypep53-activatedfragment1,waf1)和cip1(cdk-interactingprotein1，cip1)，后证明是同一种物质，定位于人类染色体6p21.2上，能编码相对分子质量为21×103的蛋白质，由于习惯上对CKIs(cyclin-dependentkinaseinhibitors)都以相对分子质量命名，故统一称之为p21基因，其编码蛋白称为p21蛋白，它属于一种核蛋白。在人体不同的组织中，表达情况差别很大，有的组织中(如胃肠道)在非增生区内有明显的阳性反应细胞，而有的组织中仅仅有很低的阳性表达，甚至看不到阳性反应细胞[3]，在正常骨组织中的表达还未见报道。p21waf1/cip1对CDKs(cyclin-dependentkinases)有广泛的抑制作用[6]，特别是对CDK2和CDK4抑制作用最强，而Cyclin-CDK复合物是细胞周期的正性调节因子，被称作细胞周期的发动机，能促使细胞迅速跨越细胞周期的检测点，其过表达可降低细胞质量，促进增生转化，p21waf1/cip1对Cyclin-CDK的抑制起到了关卡控制的作用。在p21waf1/cip1基因编码序列上游2.4kb处，有p53蛋白的结合位点[1]，受p53蛋白的介导；有研究发现，p21waf1/cip1也可以不依赖p53的诱导，在转录激活因子和肿瘤促进剂刺激下出现表达[3,7]，说明p21waf1/cip1的诱导在不同的生理条件下有不同的途径。另外，p21还能够抑制Cyclin-CDK复合物对pRb的磷酸化，使DRTF1/E2F不能与pRb解离，从而保证Rb抑制细胞增殖的作用[8]。在正常细胞，p21waf1/cip1和PCNA、Cyclin-CDK形成四聚体复合物，p21waf1/cip1蛋白N端结合并抑制Cyclin-CDK，而C端则结合并抑制PCNA,p21waf1/cip1只抑制DNA长链的复制，而对DNA填补修复的短片段复制无影响，但是在转化细胞中，这种结合与联系则被打破[9,10]。
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p21waf1/cip1在骨肉瘤中的作用，国内外研究不多，其转录水平蛋白和基因的表达情况还未见报道。本实验用免疫组化LSAB法检测40例骨肉瘤、20例良性骨肿瘤(骨软骨瘤)和20例正常骨组织,骨肉瘤的阳性率为77.5%，其中41.9%是中度和强阳性反应，而良性骨肿瘤无强阳性反应出现，正常骨组织全部是弱和微弱阳性反应。人骨肉瘤中p21waf1/cip1DNA探针原位杂交结果与免疫组化基本一致，阳性反应存在显著的相关性；但正常骨组织的微弱阳性表达率明显高于免疫组化，说明检测mRNA对生理的低水平表达更具灵敏性和客观性，同时说明正常p21waf1/cip1蛋白受多种因素的修饰；考虑到二者反应的敏感性和从mRNA到蛋白表达之间的其它影响因素，可以认为，p21waf1/cip1蛋白免疫组化阳性反应能够反映p21waf1/cip1基因在蛋白水平的表达状态。免疫组化方法简单，便于开展基因检测，以指导临床诊断和治疗。本实验结合近4年的随访结果，显示骨肉瘤患者中p21基因高表达型患者与低表达型患者之间的复发转移和生存时间存在的差异有显著性意义(P<0.05)，表明p21基因异常和高表达与骨肉瘤患者的预后有关，检测p21waf1/cip1的表达状态可作为判断其预后的一个指标。
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实验结果提示,p21waf1/cip1基因的表达与组织的增殖状态和恶性程度相关联，良性骨肿瘤(骨软骨瘤)组和正常骨组的表达经统计学处理差异无显著性意义，而这两组与骨肉瘤组相比，差异均有显著性意义，有质的区别。骨肉瘤组织中有p21waf1/cip1基因的过表达和蛋白的积聚，这种过表达和蛋白的积聚可以从三个方面去考虑。其一，有研究认为在增殖活性很低的受制约的组织中p21waf1/cip1是低表达或不表达的，而在增殖活性高又不断生长的组织中，p21waf1/cip1的表达是高的[11]。正常骨组织在骨形成过程中,分泌基质的成骨细胞由于其自身的活力下降而逐渐被基质包埋,随着钙化的深入，深埋于基质内的骨细胞,细胞器减少,胞浆体积缩小，代谢降低，成熟的骨细胞被骨的陷窝-小管网状结构包围，处于抑制状态，所以正常p21waf1/cip1的表达是很低的，甚至看不到蛋白的表达。而骨肉瘤组织是一种生长旺盛的增殖组织，受p53和生长激活因子等因素的多途径刺激，特别是积聚又保留复制活性的p53蛋白的刺激，使p21基因活性表达增强，蛋白水平增高。其二，在转化的细胞中，p21waf1/cip1与PCNA和Cyclin-CDK不能形成正常的四聚体结构[10]，难以正常发挥负性调节作用，因反馈作用的影响，p21waf1/cip1受到转录因子的持续介导，虽然出现了蛋白的积聚，却不能起到调节作用。其三，p21waf1/cip1的高表达也象p53基因的突变和高表达一样，是一种病理性的表现，其p21waf1/cip1蛋白丧失了正常的细胞周期抑制作用，不能在G1/S关卡阻止受损或异常的DNA复制，使细胞处于快速无限增殖状态。最近的相关研究表明[12]，p21基因在人成骨肉瘤中常有第二外显子的突变，以高表达方式参与骨肿瘤的发生和发展，本研究结果与其报告基本一致，表明p21waf1/cip1基因异常和蛋白的积聚在骨肉瘤的发生与发展中起着一定的作用，甚或是很关键的作用。但p21waf1/cip1基因异常的类型与部位，以及突变蛋白质生物特性的变化和相关作用，尚需进一步研究。
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基金项目：河南省教委自然科学基金(95470006)
参考文献
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12，崔大祥，范清宇，闫小君，等.骨恶性肿瘤中p21基因的改变及其预后意义.西南国防医药,1997,7:65-67.
(收稿日期：1998-12-21), http://www.100md.com
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关键词：骨肉瘤；基因，抑制，肿瘤；细胞周期蛋白质类；基因表达；原位杂交；免疫组织化学
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The expression of p21waf1/cip1 gene in human osteosarcoma
LI Yuebai QIN Guobin WANG Yisheng
(Department of Biochemistry, Henan Medical University, Zhengzhou 450052,China)
【Abstract】 Objective To study the action of p21waf1/cip1 gene in human osteosarcoma and compare its expression conditions in the osteosarcoma, osteochondroma and normal osseous tissues. Methods The expression of p21waf1/cip1 protein and gene were observed in 40 cases of osteosarcoma， 20 cases of osteochondroma and 20 cases of normal osseous tissues with LSAB immunohistochemical method and cDNA in situ hybridization technique. The samples of osteosarcoma and osteochondroma had been procured from the resected tumor immediately after surgery, and normal osseous tissues for control study were collected from surgical cases without tumor or inflammation. Results In immunohistochemical observation, thirty one of forty osteosarcomas showed positive reaction of p21waf1/cip1protein, giving a positive rate of 77.5% . However the positive rates of p2waf1/cip1 protein in osteochondroma and normal osseous tissues were only 60% and 50% respectively. The positive reaction rate and intensity of p21waf1/cip1 protein specimens were significantly higher in osteosarcoma than osteochondroma and normal osseous tissues (P<0.05). The positive expression rate of p21waf1/cip1 gene in osteosarcoma was 85% and lower than that of osteochondroma (90% ) and normal osseous tissues (100% ) with in situ hybridization examination;41.2% (7/17) had moderate or strong positive expression. Conclusion There is an accumulation of p21waf1/cip1 protein and over expression of p21 gene in osteosarcoma, which may play an important role in the development of human osteosarcoma.
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【Key words】 Osteosarcoma； Genes, suppressor, tumor； Cell cycle proteins; Gene expression; In situ hybridization； Immunohistochemistry
近年来，细胞周期调控已成为肿瘤研究的热点，而抑癌基因的负性调节作用更加受到国内外学者的高度重视。p21waf1/cip1基因就是近年来发现的一个新的抑癌基因，此基因自从1993年被学者们[1,2]从不同的角度发现以来，已成为CKIs(cyclin-dependentkinaseinhibitors,CKIs)双重特异家族的首要成员。有研究发现p21在人体大多数组织中均有表达[3]，但在骨肉瘤组织中的作用，国内外研究不多，其转录水平的蛋白和基因表达情况还未见报道。本实验采用免疫组化和原位杂交方法分别检测了人骨肉瘤、骨软骨瘤和正常骨组织中p21waf1/cip1蛋白和p21基因mRNA的表达情况。
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材料与方法
一、标本
(一)病例和标本
在河南省各大医院收集到新鲜骨肉瘤标本40例，除1例伴有肺转移外，其余病例术前均未发现有远处转移。20例骨软骨瘤全部取自河南医科大学第一附属医院骨科的新鲜手术标本，手术时间为1996年4月～1997年7月。20例正常骨组织取自非炎症和非肿瘤患者的健康骨。全部标本均经河南医科大学病理教研室确定诊断，并对骨肉瘤标本做了病理分型。标本组织均经40g/L多聚甲醛固定，固定后含钙组织经0.2686mol/LEDTA(pH=7.4)脱钙4周左右，脱钙完成后，常规石蜡包埋，3μm连续超薄切片用于HE染色、免疫组化和原位杂交检测。
(二)主要试剂
鼠抗人单克隆抗体p21waf1/cip1(Ab-1)，为美国Oncogene科学公司产品，生物素标记p21cDNA探针(2kb，随机引物法标记)来自北京医科大学分子病理学实验室。LSAB免疫组化染色检测试剂盒(SP-9002)为美国ZYMED公司产品,原位杂交检测试剂为美国Promega公司产品，由河南医科大学分子细胞生物学研究中心提供。
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二、方法
(一)免疫组化染色：参考LSAB免疫组化染色法，全部切片染色在相同条件下进行，单抗稀释度为1∶70，生物素标记的二抗和HRP标记的三抗稀释度均为1∶200。免疫组化对照染色的组织切片分为两组，每组两片，一组与实验用切片平行操作，同样条件下进行，另一组免去过氧化氢孵育和微波修复两步，其它程序与实验用切片同条件进行；用已知p21waf1/cip1阳性的组织切片作为阳性对照；用PBS代替一抗孵育已知阳性的组织切片，作为空白对照；用相同浓度的正常山羊血清代替一抗孵育已知阳性的组织切片作为替代对照,具体操作步骤按免疫组化试剂盒说明进行。
(二)原位杂交：检测步骤参考吴景兰等“非放射性分子生物学实验技术”的操作程序进行，最后不进行复染。实验中以已知p21mRNA阳性的组织切片作为阳性对照；用同一已知阳性切片的连续切片，平行操作，以预杂交液代替杂交液作自身空白对照，用0.1mg/mlRNase预处理阳性的切片作为阴性对照。实验中随机选取2张切片，进行内源性碱性磷酸酶检测，以证明内源性碱性磷酸酶无活性，实验效果不受其影响。
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三、结果判定标准
(一)免疫组化中p21waf1/cip1蛋白以细胞核着色为主，在细胞核内出现棕黄色染色者为阳性细胞；p21waf1/cip1原位杂交的显色剂是NBT,其阳性信号是紫蓝色，主要位于细胞浆内。根据反应程度，染色也有强弱之分，观察不同病变的表达情况,统计检测指标的阳性表达率，参照Fromowitz等[4,5]方法计算免疫组化阳性细胞百分比，选择连续的10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，凡细胞核表现为棕黄色着色者，不论深浅均计为阳性细胞，按其中的阳性细胞数，计算出阳性细胞的平均百分比,作为该例标本的阳性细胞百分比进行计分，分值按小于等于5%、6%～15%、16%～25%、26%～50%和大于50%，分别计分为0、1、2、3、4。染色强度分为不着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色四个级别，计分分别为0、1、2、3。最后以阳性细胞百分比计分和染色强度计分之和作为总分进行结果判定。0分为阴性(-)，1分为微弱阳性(±)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(++)，大于6分为强阳性(+++)。
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(二)p21原位杂交的结果判定按10个高倍视野下阳性细胞数的绝对值与阳性信号强度之和来计分。阳性细胞数小于10个为0分，10～25个为1分，26～50个为2分，51～75个为3分，大于75个为4分；阳性细胞颗粒信号强度按无、弱、较强、强、很强5个级别，分别将分值计为0、1、2、3、4。阳性强度的总分判定，其分值划分同上。
四、统计学处理
对检测结果用Ridit分析判断差异的显著性，对相关的判断使用Spearman等级相关分析进行统计学处理，α值取0.05，进行双侧检验。
五、临床随访
本组病例均行常规截肢手术和术后化疗，自1995年9月至今随访11例，按p21waf1/cip1表达水平分为高表达型(高于或等于++)和低表达型(低于++)。
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结果
一、对照染色
实验中阳性对照均为阳性染色，空白和替代对照均为阴性。
二、免疫组化染色结果
(一)骨肉瘤组织
40例骨肉瘤组织中有31例呈阳性反应，阳性率为77.5%，阳性细胞的分布35%呈局灶型分布，余为片状分布。阳性反应:强阳性(+++)4例，中度阳性(++)9例，弱阳性(+)12例，微弱阳性(±)6例(图1～3)。
图1 骨肉瘤组织对抗p21waf1/cip1蛋白单克隆抗体呈阳性反应，阳性细胞片状分布LSAB×200
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图2 骨软骨瘤中对抗p21waf1/cip1蛋白单克隆抗体呈弱阳性反应，阳性细胞散在分布LSAB×400
图3 正常骨组织对抗p21waf1/cip1蛋白单克隆抗体呈弱阳性反应，阳性细胞散在分布LSAB×400
(二)骨肉瘤、骨软骨瘤和正常骨组织阳性率及染色强度比较
40例骨肉瘤中阳性率为77.5%，20例骨软骨瘤的阳性率为60%，正常骨组织的阳性反应率为40%。三组间染色强度比较(Ridit分析)骨肉瘤组与正常骨组差异有显著性意义(P<0.01)，其染色反应强度的比较见表1。结果提示p21waf1/cip1在骨肉瘤组织中有高表达，其蛋白积聚的性质有待进一步研究。
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表1 骨肉瘤、骨软骨瘤和正常骨组织
之间p21waf1/cip1蛋白染色强度比较 组 别
例数
染色反应例数
阳性率(%)
-
±
+
++
+++
骨肉瘤(a)
40
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9
6
12
9
4
77.5
骨软骨瘤(b)
20
8
4
2
6
0
60.0
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正常骨(c)
20
12
8
0
0
0
40.0
注：Ridit分析:a与b比，U=1.9718,P=0.05；a与c比，U=3.9528,P<0.05， b与 c比 ， U=1.344 0,P>0.05
三、原位杂交结果
(一)骨肉瘤组织
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杂交检测20例骨肉瘤组织，呈阳性反应者17例，阳性率为85%，阳性细胞呈局灶型分布者8例，占阳性反应例数的47.1%，其余为片状分布(图4)。17例杂交阳性的骨肉瘤组织中，微弱阳性(±)4例，弱阳性(+)6例，中度阳性(++)4例，强阳性(+++)3例。
图4 骨肉瘤组织中有p21mRNA的高表达，阳性细胞片状分布ISHH×400
(二)骨肉瘤、骨软骨瘤、正常骨组织基因表达阳性率及染色强度比较
20例骨肉瘤组织中阳性率为85%，其中中度和强阳性表达占41.2%；10例骨软骨瘤中发现阳性杂交信号9例，阳性率90%，阳性细胞呈散在分布；原位杂交检测10例正常骨组织，全部有弱阳性杂交信号，但阳性细胞数少，阳性细胞为散在分布。骨肉瘤组织与骨软骨瘤和正常骨组织原位杂交阳性表达强度的比较见表2。
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表2 骨肉瘤、骨软骨瘤、正常骨组织中
p21waf1/cip1基因阳性表达强度的比较 组 别
例数
阳 性 表 达
阳性率(%)
-
±
+
++
+++
骨肉瘤
20
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3
4
6
4
3
85
骨软骨瘤
10
1
4
5
0
0
90
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正常骨
10
0
4
6
0
0
100
四、两种检测结果的相关性两种检测方法所得结果进行Spearman等级相关分析，二者在阳性反应程度上有正相关关系(rs=0.900，P<0.01)。两种检测方法之间的阳性反应关系见表3。表3 骨肉瘤中p21waf1/cip1蛋白和p21waf1/cip1基因
之间的阳性反应关系 p21waf1/cip1蛋白染色反应
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p21waf1/cip1基因染色反应
-
±
+
++
+++
-
3
0
0
0
1
±
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0
3
0
0
0
+
0
0
6
0
0
++
0
1
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0
4
0
+++
0
0
0
0
2
五、病例随访结果
本组随访病例，在骨肉瘤组内呈高表达型者，其复发转移和生存时间短，而低表达型者，其复发转移和生存时间有相对延长的趋势。p21waf1/cip1基因表达水平与骨肉瘤患者临床预后之间的可能关系见表4。表4 p21waf1/cip1基因表达水平
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与临床预后之间的关系 组 别
例数
术后存活时间
死亡原因
1年以内
1～2年
2～3年
3年以上
高表达组
6
2
3
1
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0
复发转移
低表达组
5
0
1
3
1
复发转移
注：Wilcoxon法:高表达组平均秩次3.83，低表达组平均秩次8.60，P<0.05
讨论
1993年，El-Deiry等[1]和Harper等[2]从不同的研究角度各自发现了一种新的细胞生长分裂的抑制物，分别称作waf1(wildtypep53-activatedfragment1,waf1)和cip1(cdk-interactingprotein1，cip1)，后证明是同一种物质，定位于人类染色体6p21.2上，能编码相对分子质量为21×103的蛋白质，由于习惯上对CKIs(cyclin-dependentkinaseinhibitors)都以相对分子质量命名，故统一称之为p21基因，其编码蛋白称为p21蛋白，它属于一种核蛋白。在人体不同的组织中，表达情况差别很大，有的组织中(如胃肠道)在非增生区内有明显的阳性反应细胞，而有的组织中仅仅有很低的阳性表达，甚至看不到阳性反应细胞[3]，在正常骨组织中的表达还未见报道。p21waf1/cip1对CDKs(cyclin-dependentkinases)有广泛的抑制作用[6]，特别是对CDK2和CDK4抑制作用最强，而Cyclin-CDK复合物是细胞周期的正性调节因子，被称作细胞周期的发动机，能促使细胞迅速跨越细胞周期的检测点，其过表达可降低细胞质量，促进增生转化，p21waf1/cip1对Cyclin-CDK的抑制起到了关卡控制的作用。在p21waf1/cip1基因编码序列上游2.4kb处，有p53蛋白的结合位点[1]，受p53蛋白的介导；有研究发现，p21waf1/cip1也可以不依赖p53的诱导，在转录激活因子和肿瘤促进剂刺激下出现表达[3,7]，说明p21waf1/cip1的诱导在不同的生理条件下有不同的途径。另外，p21还能够抑制Cyclin-CDK复合物对pRb的磷酸化，使DRTF1/E2F不能与pRb解离，从而保证Rb抑制细胞增殖的作用[8]。在正常细胞，p21waf1/cip1和PCNA、Cyclin-CDK形成四聚体复合物，p21waf1/cip1蛋白N端结合并抑制Cyclin-CDK，而C端则结合并抑制PCNA,p21waf1/cip1只抑制DNA长链的复制，而对DNA填补修复的短片段复制无影响，但是在转化细胞中，这种结合与联系则被打破[9,10]。
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p21waf1/cip1在骨肉瘤中的作用，国内外研究不多，其转录水平蛋白和基因的表达情况还未见报道。本实验用免疫组化LSAB法检测40例骨肉瘤、20例良性骨肿瘤(骨软骨瘤)和20例正常骨组织,骨肉瘤的阳性率为77.5%，其中41.9%是中度和强阳性反应，而良性骨肿瘤无强阳性反应出现，正常骨组织全部是弱和微弱阳性反应。人骨肉瘤中p21waf1/cip1DNA探针原位杂交结果与免疫组化基本一致，阳性反应存在显著的相关性；但正常骨组织的微弱阳性表达率明显高于免疫组化，说明检测mRNA对生理的低水平表达更具灵敏性和客观性，同时说明正常p21waf1/cip1蛋白受多种因素的修饰；考虑到二者反应的敏感性和从mRNA到蛋白表达之间的其它影响因素，可以认为，p21waf1/cip1蛋白免疫组化阳性反应能够反映p21waf1/cip1基因在蛋白水平的表达状态。免疫组化方法简单，便于开展基因检测，以指导临床诊断和治疗。本实验结合近4年的随访结果，显示骨肉瘤患者中p21基因高表达型患者与低表达型患者之间的复发转移和生存时间存在的差异有显著性意义(P<0.05)，表明p21基因异常和高表达与骨肉瘤患者的预后有关，检测p21waf1/cip1的表达状态可作为判断其预后的一个指标。
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实验结果提示,p21waf1/cip1基因的表达与组织的增殖状态和恶性程度相关联，良性骨肿瘤(骨软骨瘤)组和正常骨组的表达经统计学处理差异无显著性意义，而这两组与骨肉瘤组相比，差异均有显著性意义，有质的区别。骨肉瘤组织中有p21waf1/cip1基因的过表达和蛋白的积聚，这种过表达和蛋白的积聚可以从三个方面去考虑。其一，有研究认为在增殖活性很低的受制约的组织中p21waf1/cip1是低表达或不表达的，而在增殖活性高又不断生长的组织中，p21waf1/cip1的表达是高的[11]。正常骨组织在骨形成过程中,分泌基质的成骨细胞由于其自身的活力下降而逐渐被基质包埋,随着钙化的深入，深埋于基质内的骨细胞,细胞器减少,胞浆体积缩小，代谢降低，成熟的骨细胞被骨的陷窝-小管网状结构包围，处于抑制状态，所以正常p21waf1/cip1的表达是很低的，甚至看不到蛋白的表达。而骨肉瘤组织是一种生长旺盛的增殖组织，受p53和生长激活因子等因素的多途径刺激，特别是积聚又保留复制活性的p53蛋白的刺激，使p21基因活性表达增强，蛋白水平增高。其二，在转化的细胞中，p21waf1/cip1与PCNA和Cyclin-CDK不能形成正常的四聚体结构[10]，难以正常发挥负性调节作用，因反馈作用的影响，p21waf1/cip1受到转录因子的持续介导，虽然出现了蛋白的积聚，却不能起到调节作用。其三，p21waf1/cip1的高表达也象p53基因的突变和高表达一样，是一种病理性的表现，其p21waf1/cip1蛋白丧失了正常的细胞周期抑制作用，不能在G1/S关卡阻止受损或异常的DNA复制，使细胞处于快速无限增殖状态。最近的相关研究表明[12]，p21基因在人成骨肉瘤中常有第二外显子的突变，以高表达方式参与骨肿瘤的发生和发展，本研究结果与其报告基本一致，表明p21waf1/cip1基因异常和蛋白的积聚在骨肉瘤的发生与发展中起着一定的作用，甚或是很关键的作用。但p21waf1/cip1基因异常的类型与部位，以及突变蛋白质生物特性的变化和相关作用，尚需进一步研究。
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基金项目：河南省教委自然科学基金(95470006)
参考文献
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(收稿日期：1998-12-21), http://www.100md.com