骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞的诱导及其抗肿瘤特性的研究
作者：姜文学 董天华 吴士良 马文雄
单位：董天华 姜文学(苏州医学院附属第一医院骨科 215006)；姜文学(现调入天津市第一中心医院骨科，300192)；吴士良(苏州医学院附属第一医院生化教研室 215006)；马文雄(苏州医学院附属第一医院脑研室 215006)
关键词：骨肉瘤；CD8阳性T淋巴细胞；抗原；免疫疗法
中华骨科杂志000103
【摘要】目的 诱导骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(osteosarcoma specific cytotoxic Tlymphocyte, OSS-CTL)，观察其体内外的抗肿瘤特性。方法通过生化方法从HOS-8603细胞系中提取纯化骨肉瘤相关抗原(osteosarcoma associated antigen,OSAA)，并与低剂量IL-2、CD3单抗协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞诱导产生OSS-CTL。结果OSS-CTL表型特征为CD3+87.6%±6.3%,CD4+21.7%±4.1%,CD8+94.7%±5.3%,CD11b+1.9%±0.7%,HLA+79.3%±8.7%,即以CD8+T细胞为主的异质细胞群，对OSAA相关的自体骨肉瘤细胞和HOS-8603细胞显示高亲和杀伤活性。体内实验表明，OSS-CTL明显抑制裸鼠皮下骨肉瘤的生长。结论OSS-CTL是一种新的高效免疫效应细胞。
, 百拇医药
Induction of tumor specific cytotoxic T lymphocyte in osteosarcoma and study on its anti-tumor effects
JIANG Wenxue DONG Tianhua WU Shiliang
(Department of Orthopaedics, Tianjin First Central Hospital , Tianjin 300192, China)
【 Abstract】 Objective To induce osteosarcoma specific cytotoxic T Lymphocyte (OSS- CTL) in order to observe its anti tumor effects and specificity of OSS- CTL in vitro and in vivo. Methods Osteosarcoma associated antigen (OSAA) was separated and purified from human osteosarcoma 8603 (HOS- 8603) cell line by biochemical means. The osteosarcoma specific CTL were harvested from the peripheral blood lymphocytes (PBL) of the patient suffering from osteosarcoma, which were activated by combining stimulation effects of OSAA, low dose IL- 2 and anti- CD 3 monoclonal antibody. The anti tumor effect and specificity of OSS- CTL were measured with 3H- TdR method by killing HOS- 8603 and autogenous osteosarcoma cell, as well as the cell line of K 562 and SHG- 44. The TNF, IL- 2, IL- 8 expressions of OSS- CTL, TIL and PBL were examined with ELLSA assessment in order to explore the cytotoxic mechanism of OSS- CTL. Results The osteosarcoma specific CTL were mainly composed of CD8+ CTL heterogenous cell groups, which included CD 3+ 87.6% ± 6.3% , CD 4+ 21.7% ± 4.1% , CD 8+ 94.7% ± 5.3% and CD 11b+ 1.9% ± 0.7% . The osteosarcoma specific CTL showed highly specific killing activity to HOS- 8603 and autogenous osteosarcoma cells. In vivo, the suppressing effects of the osteosarcoma specific CTL on nude mice subcutaneous osteosarcoma were more obvious than TIL. Conclusion The osteosarcoma specific CTL could be served as a new type of immune cell with high cytotoxic effect for immunotherapy.
, 百拇医药
【 Key words】 Osteosarcoma； CD 8- positive T- lymphocytes; Antigens; Immunotherapy
骨肉瘤术后远处转移是影响其外科疗效的首要问题。近年来免疫治疗在抗肿瘤转移中日益受到重视,其中体外诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(tumorspecificcytotoxicTlymphocyte,TS-CTL)作为新的免疫效应细胞的研究成为一个热点。新近的研究表明,TS-CTL前体的活化依赖于双信号学说，即抗原的持续刺激和共刺激因子的辅助作用[1]。鉴于此，本研究首先从骨肉瘤细胞系中提取纯化骨肉瘤相关抗原的基础上,与低剂量IL-2、CD3单抗协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞,可望诱导出高效的OSS-CTL。
材料与方法
一、主要试剂与材料
, 百拇医药
丙烯酰胺、双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、TEMED均为Sigma产品，TritonX-100、苯*****为Serva产品，DEAE-SephadeX、XG-75为phamacia产品，RPMI1640为GIBCO产品，CD3、CD4、CD8、CD11、HLA-DR单抗为北京军事医学科学院产品。K562和SHG-44细胞系及NC裸鼠由苏州医学院脑研室提供，HOS-8603细胞系及其单克隆抗体由第二军医大学病理教研室宝建中教授提供[2]。本组11例骨肉瘤患者均为苏州医学院附属第一医院骨科住院患者,均经手术治疗和病理证实。其中男7例,女4例；年龄14～51岁,平均23岁。
二、OSAA的提取及鉴定
将HOS-8603细胞系大量扩增至1×107时收取，以pH=7.2，0.2mol/LPBS洗2遍，离心后沉淀中加入含体积分数为2%的TritonX-100细胞裂解液20ml，剧烈振荡混匀1min，置4℃PBS液中透析48h，过滤除菌后加入4.4mol/L饱和硫酸铵溶液沉淀蛋白质，离心后取沉淀溶解同上PBS中，0.4μm滤膜过滤后做自动层析分离获得细胞膜粗提液，Folin酚试剂测得蛋白质含量为10mg/ml，对pH=6.5,0.1mol/L的PBS3L在4℃透析过夜，以相同的PBS平衡DEAE-SephadeX层析柱后上样层析，以pH=6.5，0.1mol/min，收集不同峰值下的洗脱液装透析袋对0.15mol/LNaCl,pH=7.2,0.02mol/L的PBS3L透析并吹干浓缩，以SDS-PAGE测定相对分子质量。Western-blot分析：样品以SDS-PAGE平板电泳4～5h，电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，然后将NC膜置0.2mol/LFCS-PBS缓冲液50ml中4℃封闭过夜，充分洗涤后置于HOS-8603细胞单抗稀释液中，37℃孵育2h，充分洗涤后加入联苯二胺(DAB)显色，15min后中止反应。
, http://www.100md.com
三、诱导OSS-CTL与肿瘤浸润淋巴细胞
以Ficoll-HyPaque新鲜分离骨肉瘤患者外周血淋巴细胞(periphrealbloodlymphocyte,PBL)，调整细胞浓度为5×105/ml后置于CD3单抗包被(10μg/ml)的培养瓶中，加入OSAA66(10μg/ml)刺激培养，3d后移至一般培养瓶中加入IL-2100u/ml，OSAA66保持原来浓度继续培养诱导;肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL)分离培养参照改良WhiteSide等[3]方法。
四、细胞毒活性检测
采用吴厚生等[4]3H-TdR释放法，效靶比为50∶1。细胞毒活性CI(%)=(实验组CPM-自然释放组CPM)/(最大释放组CPM-自然释放组CPM)×100%。
, 百拇医药
五、3H-TdR掺入增殖试验
待测细胞按每孔1×106个细胞数加入96孔板,置37℃体积分数为5%的CO2条件培养,24h后每孔再加入3H-TdR1.85×104Bq(10μl),16h后用多头细胞收集器将细胞收集于49型玻璃纤维滤膜上,液闪测定每孔细胞掺入3H-TdR的CPM值。每个梯度设三个复孔,以实验所得CPM平均值作为细胞增殖指数。
六、流式细胞仪检测细胞表型
取待测细胞2×106/ml加入“U”型孔内，再加入CD3、CD4、CD8、CD11、HLA-DR单抗各20μl/孔，4℃孵育30min，充分洗涤后加入FITC-羊抗鼠4℃30min，洗涤后上样分析。
, 百拇医药
七、细胞因子检测
1.细胞培养上清液制备:诱导培养21d的OSS-CTL、TIL及PBL调整细胞浓度为2×106/ml。用24孔培养板,每孔加入1ml,每组设三个梯度,再加入终浓度为20μg/mlPHA,置体积分数为5%的CO2于37℃条件下培养48h后离心收取上清液,4℃保存待测。
2.测定方法:采用ELISA双抗体夹心法。用法国ACoulter公司产品试剂盒测定IL-2、TNF-α及IL-8。
八、形态学观察OSS-CTL杀伤骨肉瘤细胞过程
用24孔培养板建立OSS-CTL与HOS-8603、自体骨肉瘤细胞共同反应体系,效靶比为50∶1,作用1、3、6h后在倒置显微镜下观察。
九、动物实验
, 百拇医药
将HOS-8603细胞按5×106/只接种NC裸鼠肩背部皮下，接种成功2周后随机分成三组,每组6只,通过尾静脉注射治疗，5d1次，连续5次。游标卡尺测量肿瘤的短径(W)和最大长径(L)观察肿瘤生长情况。计算公式：肿瘤体积=L×W2/Z[4]。治疗方法：生理盐水组：生理盐水0.2ml/只；TIL组：每只TIL2×107/0.2ml，IL-21×104u，肌内注射；OSS-CTL组：每只OSS-CTL2×107/0.2ml，IL-21×104u，肌内注射。
十、统计学方法
均采用t检验和χ2检验，α值取0.05。
结果
一、OSAA的纯化与鉴定
, 百拇医药
HOS-8603细胞膜粗提液经DEAE-SephadeX层析，获得5种不同峰值的洗脱液，再经SephadeXG-50浓缩脱盐获得5种膜蛋白组分，分别与骨肉瘤单抗进行Westernblot分析，结果：其中第3种膜蛋白组分显示阳性反应，而其他组分呈阴性反应，提示第3种膜蛋白组分是骨肉瘤单抗识别的OSAA，经SDS-PAGE分析为单一条带，相对分子质量为66×103。
二、OSS-CTL与TIL增殖活性的比较
动态观察两种效应细胞的增值活性,结果OSS-CTL增殖活性从第1周开始快速上升,至第4周达最高峰并维持两周,第6周开始缓慢下降。在7周的培养期间OSS-CTL的增殖活性始终明显高于TIL(图1)。
图1动态观察OSS-CTL组和TIL组的增殖活性
, http://www.100md.com
三、OSS-CTL组表型特征
流式细胞仪检测诱导培养14d的OSS-CTL表型，其中CD3+87.6%±6.3%，CD4+24.7%±4.1%，CD8+94.7%±5.3%，CD11b+1.9%±0.7%，HLA-DR+79.3%±8.7%。提示OSS-CTL是以CD3+CD8+CTL为主的异质细胞群(图2)。
图2培养14d的OSS-CTL组细胞表型
四、OSS-CTL组细胞毒活性检测
, http://www.100md.com
诱导培养21d的OSS-CTL对HOS-8603骨肉瘤细胞的杀伤活性为97.3%，对自体骨肉瘤细胞为92.6%，而对K562和SHG-44细胞的杀伤活性分别为11.5%和19.3%，其差异有非常显著性意义(P<0.01)。提示OSS-CTL对OSAA有关的肿瘤细胞显示高效特异杀伤活性(图3)。
图3OSS-CTL对骨肉瘤细胞的特异杀伤活性
五、OSS-CTL与TIL分泌细胞因子的类型和水平
OSS-CTL分泌TNF-α、IL-2的水平显著高于TIL和健康人PBL，差异有显著性意义(P<0.05),分泌IL-8的水平与TIL比较，差异无显著性意义(P>0.05),但高于健康人PBMC。提示OSS-CTL的杀伤活性可能与高水平分泌这些细胞因子有关(表1)。
, 百拇医药
表1OSS-CTL与TIL分泌细胞因子
水平的比较(
±s，n=11) 细胞分型
TNF-α(pg/ml)
IL-2(u/ml)
IL-8(pg/ml)
OSS-CTL
563±39*
127±11*
174±23▲
, http://www.100md.com TIL
238±42▲
67±8▲
112±19▲
PBL
<100
15±4
30±2
注：*P<0.05，与TIL、PBL比较；▲P<0.05，与PBL比较
六、形态学观察OSS-CTL杀伤骨肉瘤细胞过程
, 百拇医药
OSS-CTL与HOS-8603细胞或自体骨肉瘤细胞共同孵育1h后,OSS-CTL将靶细胞包围,并与之紧密接触呈花环状(图4)。孵育3h后可见被包围的靶细胞颜色变暗,无光泽,外形模糊,结构不完整,部分细胞飘浮于培养液中(图5)。孵育6h后,部分靶细胞破碎死亡,有的完全解体,外周图4效靶细胞反应1h，OSS-CTL围住骨肉瘤细胞并与之接触倒置显微镜×400图5效靶细胞反应3h，被包围的骨肉瘤细胞外形模糊，结构不完整倒置显微镜×400图6效靶细胞反应6h，骨肉瘤细胞破碎死亡，外周的OSS-CTL离散倒置显微镜×400OSS-CTL完整并逐渐离散(图6)。
图4 效靶细胞反应1h，OSS-CTL围住骨肉瘤细胞并与之接触 倒置显微镜×400
图5 效靶细胞反应3h，被乌黑的骨肉瘤细胞外形模糊，结构不完整 倒置显微镜×400
, 百拇医药
图6 效靶细胞反应6h，骨肉瘤细胞破碎死亡，外周的OSS-CTL离散 倒置显微镜×400
七、OSS-CTL与TIL对荷瘤裸鼠抑瘤作用
生理盐水对照组肿瘤结节生长较快，治疗结束时肿瘤体积达0.74cm3；TIL组肿瘤生长迟缓，治疗结束时肿瘤体积(0.38cm3)与生理盐水组相比,差异有显著性意义(t=97.3,P<0.05)；OSS-CTL组肿瘤生长明显受抑制，治疗结束时肿瘤体积(0.16cm3)显著小于生理盐水组(P<0.05)和TIL组(t=73.3,P<0.01)。说明OSS-CTL对荷瘤裸鼠的抑瘤作用显著优于TIL(图7)。
图7OSS-CTL与TIL对荷瘤裸鼠的抑瘤作用
, 百拇医药
讨论
体外诱导TS-CTL作为新的免疫效应细胞的特异性过继免疫治疗，成为近年来肿瘤免疫治疗研究中的一个热点。TS-CTL过去常用淋巴-肿瘤细胞混合培养方法(mixedlymphocytetumorcellculture,MLTC)诱导，但该方法需要获得肿瘤组织及建立稳定的细胞系，从而耗费大量的时间,又因诱导出的TS-CTL中带有一定量的肿瘤细胞，回输给患者有可能形成新转移灶的危险，故不宜在临床上推广应用。近年来，随着抗原递呈和T细胞活化机制的进一步阐明，肿瘤抗原替代肿瘤细胞激活CTL成为可能，从而避免MLTC的缺陷。一般认为细胞内抗原由MHC-Ⅰ类分子提呈给CD8CTL，细胞外抗原由MHC-Ⅱ类分子提呈给CD4CTL。而Siliciano等[5]新近研究表明，外源性肿瘤抗原被抗原递呈细胞(antigenpresentingcell,APC)吞噬加工后也可由MHC-Ⅰ类分子提呈给CD8+CTL。国内陈毓仙等[6]研究也证实了上述观点。其次,CTL前体的活化依赖于双信号学说已被确立，即CTL活化除了抗原的刺激外还需要IL-2、CD3单抗等共刺激因子的辅助作用[1]。业已研究表明，肿瘤患者外周血淋巴细胞大部分已被肿瘤细胞致敏，其中含有丰富的CTL前体。由于外周血中存在一些免疫抑制因子(如TGF-β)及缺乏共刺激因子，抑制了这些CTL前体的活化，但经IL-2等细胞因子激活后便具有很强的抗肿瘤效应。据上述理论，本研究以生化方法提取的OSAA66与低剂量IL-2、CD3单抗协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞以期诱导对骨肉瘤细胞特异的高效杀伤细胞。
, 百拇医药
实验结果表明，该方法诱导活化的细胞群对OSAA相关的HOS-8603细胞和新鲜骨肉瘤细胞显示高亲和杀伤活性，而对OSAA无关的K562和SHG-44细胞显示微弱的非特异杀伤活性，这可能与OSAA提取过程中污染的细胞内毒素激活了非特异性杀伤细胞有关。检测其细胞表型为以CD8+T细胞为主的异质细胞群。说明该方法可诱导出OSS-CTL,达到了预期目的。目前肿瘤相关抗原能否诱导TS-CTL尚有争议,而本实验结果再次肯定了上述观点。实验表明,OSS-CTL培养上清液中IL-2和TNF-α的含量明显高于TIL,IL-8的含量与TIL差异无显著性意义,但明显高于健康人PBL。我们在光镜下观察到OSS-CTL杀伤骨肉瘤细胞过程须经历三个阶段：(1)识别阶段，(2)攻击阶段，(3)靶细胞溶解死亡阶段。Heusel等[7]认为CTL接触靶细胞时分泌细胞因子并通过穿孔蛋白形成的孔道进入靶细胞使其溶解、死亡，而IL-8具有使免疫效应细胞向肿瘤病灶聚集的“趋化”作用。实验还表明，OSS-CTL在体外增殖能力和杀瘤活性及对荷人骨肉瘤裸鼠模型的抑瘤作用显著强于TIL。这可能与OSS-CTL高水平分泌IL-2和TNF-α等抗癌细胞因子有关。总之，本实验方法成功地诱导了高效的OSS-CTL，弥补了MLTC的不足，可望成为骨肉瘤免疫治疗的新途径。
, 百拇医药
参考文献
1，Guo YJ， Wu M, Chen H, et al. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994,264:518- 520.
2，宝健中，陈永裕，吴存忠,等.分泌抗骨肉瘤单克隆抗体杂交瘤细胞株研究.上海免疫学杂志,1991，11：6-83.
3，Whiteside TL， Miescher S, Macoonald HR, et al. Separation of tumor- infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors: a comparison between velocity sedimentation and discontinuous density gradients. J Immunol Methods,1986,90:221- 233.
, http://www.100md.com
4，吴厚生,谢棋,姜小玲,等.3H-TdR释放法测量细胞毒介导的细胞毒功能.上海免疫学杂志,1987，7：230-232.
5，Siliciano RF, Soloski MJ. MHC class Ⅰ - restricted processing of transmembrane proteins: mechanism and biologic significance. J Immunol,1995, 155： 2- 5.
6，陈毓仙,石卫,万云霞,等.可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同诱导的杀瘤细胞T-AK细胞.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15：293-296.
7，Heusel JW, Wesselschmidt RL, Shresta S, et al. Cytotoxic lymphocytes require granzyme B for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in allogeneic target cells. Cell,1994,76:977- 987.
(收稿日期：1999-03-26), http://www.100md.com
单位：董天华 姜文学(苏州医学院附属第一医院骨科 215006)；姜文学(现调入天津市第一中心医院骨科，300192)；吴士良(苏州医学院附属第一医院生化教研室 215006)；马文雄(苏州医学院附属第一医院脑研室 215006)
关键词：骨肉瘤；CD8阳性T淋巴细胞；抗原；免疫疗法
中华骨科杂志000103
【摘要】目的 诱导骨肉瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(osteosarcoma specific cytotoxic Tlymphocyte, OSS-CTL)，观察其体内外的抗肿瘤特性。方法通过生化方法从HOS-8603细胞系中提取纯化骨肉瘤相关抗原(osteosarcoma associated antigen,OSAA)，并与低剂量IL-2、CD3单抗协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞诱导产生OSS-CTL。结果OSS-CTL表型特征为CD3+87.6%±6.3%,CD4+21.7%±4.1%,CD8+94.7%±5.3%,CD11b+1.9%±0.7%,HLA+79.3%±8.7%,即以CD8+T细胞为主的异质细胞群，对OSAA相关的自体骨肉瘤细胞和HOS-8603细胞显示高亲和杀伤活性。体内实验表明，OSS-CTL明显抑制裸鼠皮下骨肉瘤的生长。结论OSS-CTL是一种新的高效免疫效应细胞。
, 百拇医药
Induction of tumor specific cytotoxic T lymphocyte in osteosarcoma and study on its anti-tumor effects
JIANG Wenxue DONG Tianhua WU Shiliang
(Department of Orthopaedics, Tianjin First Central Hospital , Tianjin 300192, China)
【 Abstract】 Objective To induce osteosarcoma specific cytotoxic T Lymphocyte (OSS- CTL) in order to observe its anti tumor effects and specificity of OSS- CTL in vitro and in vivo. Methods Osteosarcoma associated antigen (OSAA) was separated and purified from human osteosarcoma 8603 (HOS- 8603) cell line by biochemical means. The osteosarcoma specific CTL were harvested from the peripheral blood lymphocytes (PBL) of the patient suffering from osteosarcoma, which were activated by combining stimulation effects of OSAA, low dose IL- 2 and anti- CD 3 monoclonal antibody. The anti tumor effect and specificity of OSS- CTL were measured with 3H- TdR method by killing HOS- 8603 and autogenous osteosarcoma cell, as well as the cell line of K 562 and SHG- 44. The TNF, IL- 2, IL- 8 expressions of OSS- CTL, TIL and PBL were examined with ELLSA assessment in order to explore the cytotoxic mechanism of OSS- CTL. Results The osteosarcoma specific CTL were mainly composed of CD8+ CTL heterogenous cell groups, which included CD 3+ 87.6% ± 6.3% , CD 4+ 21.7% ± 4.1% , CD 8+ 94.7% ± 5.3% and CD 11b+ 1.9% ± 0.7% . The osteosarcoma specific CTL showed highly specific killing activity to HOS- 8603 and autogenous osteosarcoma cells. In vivo, the suppressing effects of the osteosarcoma specific CTL on nude mice subcutaneous osteosarcoma were more obvious than TIL. Conclusion The osteosarcoma specific CTL could be served as a new type of immune cell with high cytotoxic effect for immunotherapy.
, 百拇医药
【 Key words】 Osteosarcoma； CD 8- positive T- lymphocytes; Antigens; Immunotherapy
骨肉瘤术后远处转移是影响其外科疗效的首要问题。近年来免疫治疗在抗肿瘤转移中日益受到重视,其中体外诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(tumorspecificcytotoxicTlymphocyte,TS-CTL)作为新的免疫效应细胞的研究成为一个热点。新近的研究表明,TS-CTL前体的活化依赖于双信号学说，即抗原的持续刺激和共刺激因子的辅助作用[1]。鉴于此，本研究首先从骨肉瘤细胞系中提取纯化骨肉瘤相关抗原的基础上,与低剂量IL-2、CD3单抗协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞,可望诱导出高效的OSS-CTL。
材料与方法
一、主要试剂与材料
, 百拇医药
丙烯酰胺、双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、TEMED均为Sigma产品，TritonX-100、苯*****为Serva产品，DEAE-SephadeX、XG-75为phamacia产品，RPMI1640为GIBCO产品，CD3、CD4、CD8、CD11、HLA-DR单抗为北京军事医学科学院产品。K562和SHG-44细胞系及NC裸鼠由苏州医学院脑研室提供，HOS-8603细胞系及其单克隆抗体由第二军医大学病理教研室宝建中教授提供[2]。本组11例骨肉瘤患者均为苏州医学院附属第一医院骨科住院患者,均经手术治疗和病理证实。其中男7例,女4例；年龄14～51岁,平均23岁。
二、OSAA的提取及鉴定
将HOS-8603细胞系大量扩增至1×107时收取，以pH=7.2，0.2mol/LPBS洗2遍，离心后沉淀中加入含体积分数为2%的TritonX-100细胞裂解液20ml，剧烈振荡混匀1min，置4℃PBS液中透析48h，过滤除菌后加入4.4mol/L饱和硫酸铵溶液沉淀蛋白质，离心后取沉淀溶解同上PBS中，0.4μm滤膜过滤后做自动层析分离获得细胞膜粗提液，Folin酚试剂测得蛋白质含量为10mg/ml，对pH=6.5,0.1mol/L的PBS3L在4℃透析过夜，以相同的PBS平衡DEAE-SephadeX层析柱后上样层析，以pH=6.5，0.1mol/min，收集不同峰值下的洗脱液装透析袋对0.15mol/LNaCl,pH=7.2,0.02mol/L的PBS3L透析并吹干浓缩，以SDS-PAGE测定相对分子质量。Western-blot分析：样品以SDS-PAGE平板电泳4～5h，电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，然后将NC膜置0.2mol/LFCS-PBS缓冲液50ml中4℃封闭过夜，充分洗涤后置于HOS-8603细胞单抗稀释液中，37℃孵育2h，充分洗涤后加入联苯二胺(DAB)显色，15min后中止反应。
, http://www.100md.com
三、诱导OSS-CTL与肿瘤浸润淋巴细胞
以Ficoll-HyPaque新鲜分离骨肉瘤患者外周血淋巴细胞(periphrealbloodlymphocyte,PBL)，调整细胞浓度为5×105/ml后置于CD3单抗包被(10μg/ml)的培养瓶中，加入OSAA66(10μg/ml)刺激培养，3d后移至一般培养瓶中加入IL-2100u/ml，OSAA66保持原来浓度继续培养诱导;肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte,TIL)分离培养参照改良WhiteSide等[3]方法。
四、细胞毒活性检测
采用吴厚生等[4]3H-TdR释放法，效靶比为50∶1。细胞毒活性CI(%)=(实验组CPM-自然释放组CPM)/(最大释放组CPM-自然释放组CPM)×100%。
, 百拇医药
五、3H-TdR掺入增殖试验
待测细胞按每孔1×106个细胞数加入96孔板,置37℃体积分数为5%的CO2条件培养,24h后每孔再加入3H-TdR1.85×104Bq(10μl),16h后用多头细胞收集器将细胞收集于49型玻璃纤维滤膜上,液闪测定每孔细胞掺入3H-TdR的CPM值。每个梯度设三个复孔,以实验所得CPM平均值作为细胞增殖指数。
六、流式细胞仪检测细胞表型
取待测细胞2×106/ml加入“U”型孔内，再加入CD3、CD4、CD8、CD11、HLA-DR单抗各20μl/孔，4℃孵育30min，充分洗涤后加入FITC-羊抗鼠4℃30min，洗涤后上样分析。
, 百拇医药
七、细胞因子检测
1.细胞培养上清液制备:诱导培养21d的OSS-CTL、TIL及PBL调整细胞浓度为2×106/ml。用24孔培养板,每孔加入1ml,每组设三个梯度,再加入终浓度为20μg/mlPHA,置体积分数为5%的CO2于37℃条件下培养48h后离心收取上清液,4℃保存待测。
2.测定方法:采用ELISA双抗体夹心法。用法国ACoulter公司产品试剂盒测定IL-2、TNF-α及IL-8。
八、形态学观察OSS-CTL杀伤骨肉瘤细胞过程
用24孔培养板建立OSS-CTL与HOS-8603、自体骨肉瘤细胞共同反应体系,效靶比为50∶1,作用1、3、6h后在倒置显微镜下观察。
九、动物实验
, 百拇医药
将HOS-8603细胞按5×106/只接种NC裸鼠肩背部皮下，接种成功2周后随机分成三组,每组6只,通过尾静脉注射治疗，5d1次，连续5次。游标卡尺测量肿瘤的短径(W)和最大长径(L)观察肿瘤生长情况。计算公式：肿瘤体积=L×W2/Z[4]。治疗方法：生理盐水组：生理盐水0.2ml/只；TIL组：每只TIL2×107/0.2ml，IL-21×104u，肌内注射；OSS-CTL组：每只OSS-CTL2×107/0.2ml，IL-21×104u，肌内注射。
十、统计学方法
均采用t检验和χ2检验，α值取0.05。
结果
一、OSAA的纯化与鉴定
, 百拇医药
HOS-8603细胞膜粗提液经DEAE-SephadeX层析，获得5种不同峰值的洗脱液，再经SephadeXG-50浓缩脱盐获得5种膜蛋白组分，分别与骨肉瘤单抗进行Westernblot分析，结果：其中第3种膜蛋白组分显示阳性反应，而其他组分呈阴性反应，提示第3种膜蛋白组分是骨肉瘤单抗识别的OSAA，经SDS-PAGE分析为单一条带，相对分子质量为66×103。
二、OSS-CTL与TIL增殖活性的比较
动态观察两种效应细胞的增值活性,结果OSS-CTL增殖活性从第1周开始快速上升,至第4周达最高峰并维持两周,第6周开始缓慢下降。在7周的培养期间OSS-CTL的增殖活性始终明显高于TIL(图1)。
图1动态观察OSS-CTL组和TIL组的增殖活性
, http://www.100md.com
三、OSS-CTL组表型特征
流式细胞仪检测诱导培养14d的OSS-CTL表型，其中CD3+87.6%±6.3%，CD4+24.7%±4.1%，CD8+94.7%±5.3%，CD11b+1.9%±0.7%，HLA-DR+79.3%±8.7%。提示OSS-CTL是以CD3+CD8+CTL为主的异质细胞群(图2)。
图2培养14d的OSS-CTL组细胞表型
四、OSS-CTL组细胞毒活性检测
, http://www.100md.com
诱导培养21d的OSS-CTL对HOS-8603骨肉瘤细胞的杀伤活性为97.3%，对自体骨肉瘤细胞为92.6%，而对K562和SHG-44细胞的杀伤活性分别为11.5%和19.3%，其差异有非常显著性意义(P<0.01)。提示OSS-CTL对OSAA有关的肿瘤细胞显示高效特异杀伤活性(图3)。
图3OSS-CTL对骨肉瘤细胞的特异杀伤活性
五、OSS-CTL与TIL分泌细胞因子的类型和水平
OSS-CTL分泌TNF-α、IL-2的水平显著高于TIL和健康人PBL，差异有显著性意义(P<0.05),分泌IL-8的水平与TIL比较，差异无显著性意义(P>0.05),但高于健康人PBMC。提示OSS-CTL的杀伤活性可能与高水平分泌这些细胞因子有关(表1)。
, 百拇医药
表1OSS-CTL与TIL分泌细胞因子
水平的比较(
±s，n=11) 细胞分型TNF-α(pg/ml)
IL-2(u/ml)
IL-8(pg/ml)
OSS-CTL
563±39*
127±11*
174±23▲
, http://www.100md.com TIL
238±42▲
67±8▲
112±19▲
PBL
<100
15±4
30±2
注：*P<0.05，与TIL、PBL比较；▲P<0.05，与PBL比较
六、形态学观察OSS-CTL杀伤骨肉瘤细胞过程
, 百拇医药
OSS-CTL与HOS-8603细胞或自体骨肉瘤细胞共同孵育1h后,OSS-CTL将靶细胞包围,并与之紧密接触呈花环状(图4)。孵育3h后可见被包围的靶细胞颜色变暗,无光泽,外形模糊,结构不完整,部分细胞飘浮于培养液中(图5)。孵育6h后,部分靶细胞破碎死亡,有的完全解体,外周图4效靶细胞反应1h，OSS-CTL围住骨肉瘤细胞并与之接触倒置显微镜×400图5效靶细胞反应3h，被包围的骨肉瘤细胞外形模糊，结构不完整倒置显微镜×400图6效靶细胞反应6h，骨肉瘤细胞破碎死亡，外周的OSS-CTL离散倒置显微镜×400OSS-CTL完整并逐渐离散(图6)。
图4 效靶细胞反应1h，OSS-CTL围住骨肉瘤细胞并与之接触 倒置显微镜×400
图5 效靶细胞反应3h，被乌黑的骨肉瘤细胞外形模糊，结构不完整 倒置显微镜×400
, 百拇医药
图6 效靶细胞反应6h，骨肉瘤细胞破碎死亡，外周的OSS-CTL离散 倒置显微镜×400
七、OSS-CTL与TIL对荷瘤裸鼠抑瘤作用
生理盐水对照组肿瘤结节生长较快，治疗结束时肿瘤体积达0.74cm3；TIL组肿瘤生长迟缓，治疗结束时肿瘤体积(0.38cm3)与生理盐水组相比,差异有显著性意义(t=97.3,P<0.05)；OSS-CTL组肿瘤生长明显受抑制，治疗结束时肿瘤体积(0.16cm3)显著小于生理盐水组(P<0.05)和TIL组(t=73.3,P<0.01)。说明OSS-CTL对荷瘤裸鼠的抑瘤作用显著优于TIL(图7)。
图7OSS-CTL与TIL对荷瘤裸鼠的抑瘤作用
, 百拇医药
讨论
体外诱导TS-CTL作为新的免疫效应细胞的特异性过继免疫治疗，成为近年来肿瘤免疫治疗研究中的一个热点。TS-CTL过去常用淋巴-肿瘤细胞混合培养方法(mixedlymphocytetumorcellculture,MLTC)诱导，但该方法需要获得肿瘤组织及建立稳定的细胞系，从而耗费大量的时间,又因诱导出的TS-CTL中带有一定量的肿瘤细胞，回输给患者有可能形成新转移灶的危险，故不宜在临床上推广应用。近年来，随着抗原递呈和T细胞活化机制的进一步阐明，肿瘤抗原替代肿瘤细胞激活CTL成为可能，从而避免MLTC的缺陷。一般认为细胞内抗原由MHC-Ⅰ类分子提呈给CD8CTL，细胞外抗原由MHC-Ⅱ类分子提呈给CD4CTL。而Siliciano等[5]新近研究表明，外源性肿瘤抗原被抗原递呈细胞(antigenpresentingcell,APC)吞噬加工后也可由MHC-Ⅰ类分子提呈给CD8+CTL。国内陈毓仙等[6]研究也证实了上述观点。其次,CTL前体的活化依赖于双信号学说已被确立，即CTL活化除了抗原的刺激外还需要IL-2、CD3单抗等共刺激因子的辅助作用[1]。业已研究表明，肿瘤患者外周血淋巴细胞大部分已被肿瘤细胞致敏，其中含有丰富的CTL前体。由于外周血中存在一些免疫抑制因子(如TGF-β)及缺乏共刺激因子，抑制了这些CTL前体的活化，但经IL-2等细胞因子激活后便具有很强的抗肿瘤效应。据上述理论，本研究以生化方法提取的OSAA66与低剂量IL-2、CD3单抗协同刺激骨肉瘤致敏的淋巴细胞以期诱导对骨肉瘤细胞特异的高效杀伤细胞。
, 百拇医药
实验结果表明，该方法诱导活化的细胞群对OSAA相关的HOS-8603细胞和新鲜骨肉瘤细胞显示高亲和杀伤活性，而对OSAA无关的K562和SHG-44细胞显示微弱的非特异杀伤活性，这可能与OSAA提取过程中污染的细胞内毒素激活了非特异性杀伤细胞有关。检测其细胞表型为以CD8+T细胞为主的异质细胞群。说明该方法可诱导出OSS-CTL,达到了预期目的。目前肿瘤相关抗原能否诱导TS-CTL尚有争议,而本实验结果再次肯定了上述观点。实验表明,OSS-CTL培养上清液中IL-2和TNF-α的含量明显高于TIL,IL-8的含量与TIL差异无显著性意义,但明显高于健康人PBL。我们在光镜下观察到OSS-CTL杀伤骨肉瘤细胞过程须经历三个阶段：(1)识别阶段，(2)攻击阶段，(3)靶细胞溶解死亡阶段。Heusel等[7]认为CTL接触靶细胞时分泌细胞因子并通过穿孔蛋白形成的孔道进入靶细胞使其溶解、死亡，而IL-8具有使免疫效应细胞向肿瘤病灶聚集的“趋化”作用。实验还表明，OSS-CTL在体外增殖能力和杀瘤活性及对荷人骨肉瘤裸鼠模型的抑瘤作用显著强于TIL。这可能与OSS-CTL高水平分泌IL-2和TNF-α等抗癌细胞因子有关。总之，本实验方法成功地诱导了高效的OSS-CTL，弥补了MLTC的不足，可望成为骨肉瘤免疫治疗的新途径。
, 百拇医药
参考文献
1，Guo YJ， Wu M, Chen H, et al. Effective tumor vaccine generated by fusion of hepatoma cells with activated B cells. Science, 1994,264:518- 520.
2，宝健中，陈永裕，吴存忠,等.分泌抗骨肉瘤单克隆抗体杂交瘤细胞株研究.上海免疫学杂志,1991，11：6-83.
3，Whiteside TL， Miescher S, Macoonald HR, et al. Separation of tumor- infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors: a comparison between velocity sedimentation and discontinuous density gradients. J Immunol Methods,1986,90:221- 233.
, http://www.100md.com
4，吴厚生,谢棋,姜小玲,等.3H-TdR释放法测量细胞毒介导的细胞毒功能.上海免疫学杂志,1987，7：230-232.
5，Siliciano RF, Soloski MJ. MHC class Ⅰ - restricted processing of transmembrane proteins: mechanism and biologic significance. J Immunol,1995, 155： 2- 5.
6，陈毓仙,石卫,万云霞,等.可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同诱导的杀瘤细胞T-AK细胞.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15：293-296.
7，Heusel JW, Wesselschmidt RL, Shresta S, et al. Cytotoxic lymphocytes require granzyme B for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in allogeneic target cells. Cell,1994,76:977- 987.
(收稿日期：1999-03-26), http://www.100md.com