老年大鼠骨痂中转化生长因子-β1的表达
作者：董玉峰 戴克戎 汤亭亭 郭传友 廖文胜
单位：董玉峰(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；戴克戎(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；汤亭亭(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；郭传友(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；廖文胜(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)
关键词：骨痂；年龄因素；转化生长因子-β1；骨折愈合
临床骨科杂志000101
【摘要】 目的 探讨增龄对骨折愈合过程中转化生长因子-β1(TGF-β1 )表达的影响。方法 建立老年大鼠股骨骨折模型，于第1、2、4、8、12周取骨痂，进行组织学观察，并用免疫组织化学方法进行TGF-β1表达测定。结果 在2、4周TGF-β1主要在软骨细胞、间充质细胞而在8周新生类骨质中有TGF-β1表达。结论 增龄可引起成骨细胞功能降低，导致TGF-β1分泌减少，使骨折的愈合延缓。
, 百拇医药
【中图分类号】 R687.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-0287(2000)01-0001-03
Expression of transforming growth factor-β1 in aged rat fracture callus
Dong Yufeng,Dai Kerong,Tang Tingting, Guo Chuanyou,Liao Wensheng
(Dept of Orthopaedics,The 9th Peoples Hospital,Shanghai 2nd Medical University,Shanghai 200011)
【Abstract】 Objective To study the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) during aged rats fracture healing. Methods After the aged rat fracture model was established, the expression of TGF-β1 in callus was observed by means of immunohistochemistry method on 1,2,4,8 and 12 weeks. Results In 2,4 weeks, the positive expression of TGF-β1 was chondrocyte, fibroblast and matrix, only in 8 weeks the osteoblast showed positive expression. Conclusion Age can decrease the excretive function of osteoblast and result in the decline of local concentration of TGF-β1 and delay fracture healing.
, 百拇医药
【Key words】 callus;age factors；transforming growth factor-beta1；fracture healing
骨折的修复是一个十分复杂的过程，目前已知很多细胞介素和多肽生长因子在这一过程中起重要作用。其中转化生长因子-β1(TGF-β1)便是具有重要调节作用的因子之一，它不但可以诱导间充质细胞分泌特异性软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原，而且可刺激成骨细胞增殖和进行胶原合成〔1〕。以往研究发现，在非老年性骨折愈合过程中，TGF-β1在愈合的不同阶段表达部位和水平不同。但增龄对骨痂中TGF-β1表达影响的研究尚未见报道。本实验用老年大鼠骨折模型，研究增龄对骨痂内TGF-β1表达影响的规律，为探讨老年人骨折愈合迟缓的原因提供参考。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 动物模型及标本处理 22月龄老年大鼠40只，体重500～700 g，♀♂不拘，随机均分为5个时间组。在无菌条件下手术，将单侧股骨中段造成横断骨折，φ1.2 mm克氏针内固定。于第1、2、4、8、12周取材，取材包括骨折断端及其周围软骨痂。标本置入4%多聚甲醛中浸泡48 h后，用骨刀切成5 mm×5 mm×5 mm的小块，置入10% EDTA液(pH 7.2)脱钙，4℃，每周换脱钙液1次。待针可刺入骨皮质时停止脱钙，随后石蜡包埋(60℃)，制备4 μm厚度切片。
1.2 主要试剂 鼠抗TGF-β1抗原，生物素化山羊抗鼠IgG，复合消化液，SABC试剂盒为武汉博士德公司产品。其它试剂均采用分析纯。
1.3 组织学观察 切片经脱蜡至水、HE染色后，进行组织学观察。
1.4 免疫组化染色 切片经脱蜡至水后，分别经0.3%双氧水封闭内源酶。按常规ABC法进行免疫组化染色，即切片经一抗(TGF-β1多克隆抗体)处理过夜后，依次经生物素化第二抗体、ABC复合物处理，DAB显色。苏木精复染。脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，用试剂盒内阳性切片作阳性对照。阳性细胞浆和(或)膜着色呈棕黄色。
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2 结果
2.1 术后系列组织学观察 术后1周骨折断端血肿内可见新生的肉芽组织，并有毛细血管长入，间充质细胞较多。术后2周，肉芽组织机化，软骨岛出现。术后4周，新生软骨增多，出现少量成骨细胞，并以软骨内成骨的方式形成网织骨。术后8周，大量骨小梁开始形成，小梁间隙内有丰富的毛细血管。仍可见许多肥大的软骨细胞。术后12周，有成熟板层骨形成，髓腔再通。
2.2 免疫组化 术后1周断端间的软组织血肿为阳性着色。术后2周阳性细胞主要是纤维组织内的成纤维样间充质细胞和软骨细胞(图1)。术后4周，软骨细胞及周围基质阳性着色(图2)。术后8周，成骨细胞及周围的类骨质为阳性着色，肥大的软骨细胞染色阴性(图3)。术后12周，成熟板层骨中的成骨细胞周围基质为阴性反应。
3 讨论
骨折愈合涉及一系列不同的细胞活动。而这些细胞功能又与多种生长因子有关。TGF-β1是一种对多种类型结缔组织细胞具有复杂生物学效应的生长因子，具有调节骨修复的作用。在骨组织中，骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞都可以分泌TGF-β1，骨组织中TGF-β1的浓度是其它组织的100倍〔2〕。在骨折修复的不同阶段其基因表达水平不同。Bolander等〔3〕认为，在非老年性骨折愈合过程中，TGF-β1在早期就有表达，但水平较低，即使用Northern-blot法，也很难检测到。而在骨折后2～4周即有软骨生成且软骨内成骨阶段表达水平达到高峰，此时成熟的软骨细胞、成骨细胞TGF-β1染色为强阳性，其后表达水平逐渐下降至正常。而在老年性骨折愈合过程中，由于其软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等的功能都有不同程度的改变，因此TGF-β1的表达也有其相应的特点。
, 百拇医药
本实验结果发现：(1)骨折后早期 即术后1周断端内的肉芽组织染色阳性，说明老年大鼠骨折后早期血肿内基质有TGF-β1表达。由于此时骨折断端血肿内主要是一些间充质细胞和血小板，因此TGF-β1除来源于血小板外，还来自于间充质细胞的分泌。术后2周间充质细胞染色阳性，也说明骨折后早期分泌TGF-β1的主要是间充质细胞。直到4周时，间充质细胞逐渐消失，软骨细胞才大量分泌TGF-β1。(2)骨折修复的第二阶段即软骨内成骨期，TGF-β1主要来源于软骨细胞分泌。术后2周，幼稚的软骨细胞出现TGF-β1阳性染色，开始分泌TGF-β1，4周时达到高峰。8周时软骨细胞则开始肥大，停止分泌TGF-β1，而成骨细胞开始分泌TGF-β1。随后成骨细胞功能开始下降，12周时成骨细胞着色阴性，仅剩周围基质内仍有TGF-β1表达。(3)成骨细胞功能有明显下降。整个骨折修复期，仅在8周时见成骨细胞内表达TGF-β1,而在非老年性骨折愈合过程中，从早期的软骨内成骨阶段，到后期的软骨骨化阶段，成骨细胞都分泌TGF-β1，免疫组织化学染色也呈阳性〔4〕。在本实验中，尽管新生成的类骨质阳性表达，但成骨细胞TGF-β1阳性表达较少，分泌的TGF-β1量较少，很难检测到。说明老年大鼠成骨细胞功能有明显下降，这可能与增龄导致的成骨细胞分泌功能降低有关。(4)软骨生成及软骨内成骨期明显延长。本研究发现，老龄大鼠骨折后8周，骨痂内仍可见大量的软骨细胞，这与一般的骨折愈合过程相比，软骨内成骨期明显延长。体外实验发现，TGF-β1可以诱导间充质细胞分化为软骨细胞并刺激Ⅱ型胶原和软骨糖蛋白的合成〔1〕。Joyce等〔5〕认为软骨内成骨时，新生骨区的TGF-β1主要由成骨细胞分泌。老年大鼠成骨细胞功能减退使TGF-β1的表达水平降低，影响了Ⅱ型胶原和软骨糖蛋白的合成，导致软骨向骨转变延迟。
, 百拇医药
图1 成纤维细胞、软骨细胞及周围基质TGF-β1阳性着色(黄染)ABC×100
图2 软骨细胞TGF-β1阳性着色(黄染) ABC×200
图3 成骨细胞及周围类骨质TGF-β1阳性着色(黄染) ABC×100
综上所述，TGF-β1是骨折愈合过程中与细胞增殖、分化和细胞外基质合成有关的一个重要因子。增龄可以影响骨痂内不同细胞对TGF-β1的表达，特别是可以明显降低成骨细胞的功能，导致其分泌TGF-β1能力的降低，引起整个骨折愈合过程时间的延长。进一步研究TGF-β1调节骨生理和骨愈合的机制对临床改进骨折治疗措施有十分重要的意义。
, 百拇医药
基金项目：上海市科学发展基金资助课题(编号：964119024)
作者简介：董玉峰(1970-)，男，博士研究生。研究方向：骨质疏松，创伤，骨折愈合
戴克戎(1935-)，男，教授，主任医师，博士生导师。研究方向：人工关节，创伤
参考文献
1，Harrs SE, Bonewald LF,Harris MA et al. Effects of transforming growth factor-beta on bone nodule formation and expression of morphogenetic protein 2,osteocalcin,osteopontin,alkalin phosphatase,and type Ⅰcollagen mRNA on long term cultures of fetal rat calvarial osteoblasts[J].Bone Miner Res,1994;270(2):376～382
, http://www.100md.com
2，Massaque H,Ichijo H,Heldin CH et al. The transforming growth factor-beta family[J]. Ann Rev Cell Biol ,1990;6(3):597～609
3，Bolander ME. Regulation of fracture repair by growth factors[J]. Proc Soc Exp Biol Med,1992;200(1):165～170
4，Sandberg MM, Aro HT, Vuorio EL et al. Gene expression during fracture repair[J]. Clin Orthop, 1993;(289):292～312
5，Joyce ME, Jingushi S, Sporn MB et al. Role of growth factors in fracture healing[J]. Prog Clin Biol Res, 1991;365(2):391～416
1999-12-17收稿，2000-01-31修回, 百拇医药
单位：董玉峰(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；戴克戎(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；汤亭亭(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；郭传友(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)；廖文胜(上海第二医科大学附属第九人民医院骨科，上海 200011)
关键词：骨痂；年龄因素；转化生长因子-β1；骨折愈合
临床骨科杂志000101
【摘要】 目的 探讨增龄对骨折愈合过程中转化生长因子-β1(TGF-β1 )表达的影响。方法 建立老年大鼠股骨骨折模型，于第1、2、4、8、12周取骨痂，进行组织学观察，并用免疫组织化学方法进行TGF-β1表达测定。结果 在2、4周TGF-β1主要在软骨细胞、间充质细胞而在8周新生类骨质中有TGF-β1表达。结论 增龄可引起成骨细胞功能降低，导致TGF-β1分泌减少，使骨折的愈合延缓。
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【中图分类号】 R687.3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1008-0287(2000)01-0001-03
Expression of transforming growth factor-β1 in aged rat fracture callus
Dong Yufeng,Dai Kerong,Tang Tingting, Guo Chuanyou,Liao Wensheng
(Dept of Orthopaedics,The 9th Peoples Hospital,Shanghai 2nd Medical University,Shanghai 200011)
【Abstract】 Objective To study the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) during aged rats fracture healing. Methods After the aged rat fracture model was established, the expression of TGF-β1 in callus was observed by means of immunohistochemistry method on 1,2,4,8 and 12 weeks. Results In 2,4 weeks, the positive expression of TGF-β1 was chondrocyte, fibroblast and matrix, only in 8 weeks the osteoblast showed positive expression. Conclusion Age can decrease the excretive function of osteoblast and result in the decline of local concentration of TGF-β1 and delay fracture healing.
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【Key words】 callus;age factors；transforming growth factor-beta1；fracture healing
骨折的修复是一个十分复杂的过程，目前已知很多细胞介素和多肽生长因子在这一过程中起重要作用。其中转化生长因子-β1(TGF-β1)便是具有重要调节作用的因子之一，它不但可以诱导间充质细胞分泌特异性软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原，而且可刺激成骨细胞增殖和进行胶原合成〔1〕。以往研究发现，在非老年性骨折愈合过程中，TGF-β1在愈合的不同阶段表达部位和水平不同。但增龄对骨痂中TGF-β1表达影响的研究尚未见报道。本实验用老年大鼠骨折模型，研究增龄对骨痂内TGF-β1表达影响的规律，为探讨老年人骨折愈合迟缓的原因提供参考。
1 材料与方法
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1.1 动物模型及标本处理 22月龄老年大鼠40只，体重500～700 g，♀♂不拘，随机均分为5个时间组。在无菌条件下手术，将单侧股骨中段造成横断骨折，φ1.2 mm克氏针内固定。于第1、2、4、8、12周取材，取材包括骨折断端及其周围软骨痂。标本置入4%多聚甲醛中浸泡48 h后，用骨刀切成5 mm×5 mm×5 mm的小块，置入10% EDTA液(pH 7.2)脱钙，4℃，每周换脱钙液1次。待针可刺入骨皮质时停止脱钙，随后石蜡包埋(60℃)，制备4 μm厚度切片。
1.2 主要试剂 鼠抗TGF-β1抗原，生物素化山羊抗鼠IgG，复合消化液，SABC试剂盒为武汉博士德公司产品。其它试剂均采用分析纯。
1.3 组织学观察 切片经脱蜡至水、HE染色后，进行组织学观察。
1.4 免疫组化染色 切片经脱蜡至水后，分别经0.3%双氧水封闭内源酶。按常规ABC法进行免疫组化染色，即切片经一抗(TGF-β1多克隆抗体)处理过夜后，依次经生物素化第二抗体、ABC复合物处理，DAB显色。苏木精复染。脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，用试剂盒内阳性切片作阳性对照。阳性细胞浆和(或)膜着色呈棕黄色。
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2 结果
2.1 术后系列组织学观察 术后1周骨折断端血肿内可见新生的肉芽组织，并有毛细血管长入，间充质细胞较多。术后2周，肉芽组织机化，软骨岛出现。术后4周，新生软骨增多，出现少量成骨细胞，并以软骨内成骨的方式形成网织骨。术后8周，大量骨小梁开始形成，小梁间隙内有丰富的毛细血管。仍可见许多肥大的软骨细胞。术后12周，有成熟板层骨形成，髓腔再通。
2.2 免疫组化 术后1周断端间的软组织血肿为阳性着色。术后2周阳性细胞主要是纤维组织内的成纤维样间充质细胞和软骨细胞(图1)。术后4周，软骨细胞及周围基质阳性着色(图2)。术后8周，成骨细胞及周围的类骨质为阳性着色，肥大的软骨细胞染色阴性(图3)。术后12周，成熟板层骨中的成骨细胞周围基质为阴性反应。
3 讨论
骨折愈合涉及一系列不同的细胞活动。而这些细胞功能又与多种生长因子有关。TGF-β1是一种对多种类型结缔组织细胞具有复杂生物学效应的生长因子，具有调节骨修复的作用。在骨组织中，骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞都可以分泌TGF-β1，骨组织中TGF-β1的浓度是其它组织的100倍〔2〕。在骨折修复的不同阶段其基因表达水平不同。Bolander等〔3〕认为，在非老年性骨折愈合过程中，TGF-β1在早期就有表达，但水平较低，即使用Northern-blot法，也很难检测到。而在骨折后2～4周即有软骨生成且软骨内成骨阶段表达水平达到高峰，此时成熟的软骨细胞、成骨细胞TGF-β1染色为强阳性，其后表达水平逐渐下降至正常。而在老年性骨折愈合过程中，由于其软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等的功能都有不同程度的改变，因此TGF-β1的表达也有其相应的特点。
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本实验结果发现：(1)骨折后早期 即术后1周断端内的肉芽组织染色阳性，说明老年大鼠骨折后早期血肿内基质有TGF-β1表达。由于此时骨折断端血肿内主要是一些间充质细胞和血小板，因此TGF-β1除来源于血小板外，还来自于间充质细胞的分泌。术后2周间充质细胞染色阳性，也说明骨折后早期分泌TGF-β1的主要是间充质细胞。直到4周时，间充质细胞逐渐消失，软骨细胞才大量分泌TGF-β1。(2)骨折修复的第二阶段即软骨内成骨期，TGF-β1主要来源于软骨细胞分泌。术后2周，幼稚的软骨细胞出现TGF-β1阳性染色，开始分泌TGF-β1，4周时达到高峰。8周时软骨细胞则开始肥大，停止分泌TGF-β1，而成骨细胞开始分泌TGF-β1。随后成骨细胞功能开始下降，12周时成骨细胞着色阴性，仅剩周围基质内仍有TGF-β1表达。(3)成骨细胞功能有明显下降。整个骨折修复期，仅在8周时见成骨细胞内表达TGF-β1,而在非老年性骨折愈合过程中，从早期的软骨内成骨阶段，到后期的软骨骨化阶段，成骨细胞都分泌TGF-β1，免疫组织化学染色也呈阳性〔4〕。在本实验中，尽管新生成的类骨质阳性表达，但成骨细胞TGF-β1阳性表达较少，分泌的TGF-β1量较少，很难检测到。说明老年大鼠成骨细胞功能有明显下降，这可能与增龄导致的成骨细胞分泌功能降低有关。(4)软骨生成及软骨内成骨期明显延长。本研究发现，老龄大鼠骨折后8周，骨痂内仍可见大量的软骨细胞，这与一般的骨折愈合过程相比，软骨内成骨期明显延长。体外实验发现，TGF-β1可以诱导间充质细胞分化为软骨细胞并刺激Ⅱ型胶原和软骨糖蛋白的合成〔1〕。Joyce等〔5〕认为软骨内成骨时，新生骨区的TGF-β1主要由成骨细胞分泌。老年大鼠成骨细胞功能减退使TGF-β1的表达水平降低，影响了Ⅱ型胶原和软骨糖蛋白的合成，导致软骨向骨转变延迟。
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图1 成纤维细胞、软骨细胞及周围基质TGF-β1阳性着色(黄染)ABC×100
图2 软骨细胞TGF-β1阳性着色(黄染) ABC×200
图3 成骨细胞及周围类骨质TGF-β1阳性着色(黄染) ABC×100
综上所述，TGF-β1是骨折愈合过程中与细胞增殖、分化和细胞外基质合成有关的一个重要因子。增龄可以影响骨痂内不同细胞对TGF-β1的表达，特别是可以明显降低成骨细胞的功能，导致其分泌TGF-β1能力的降低，引起整个骨折愈合过程时间的延长。进一步研究TGF-β1调节骨生理和骨愈合的机制对临床改进骨折治疗措施有十分重要的意义。
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基金项目：上海市科学发展基金资助课题(编号：964119024)
作者简介：董玉峰(1970-)，男，博士研究生。研究方向：骨质疏松，创伤，骨折愈合
戴克戎(1935-)，男，教授，主任医师，博士生导师。研究方向：人工关节，创伤
参考文献
1，Harrs SE, Bonewald LF,Harris MA et al. Effects of transforming growth factor-beta on bone nodule formation and expression of morphogenetic protein 2,osteocalcin,osteopontin,alkalin phosphatase,and type Ⅰcollagen mRNA on long term cultures of fetal rat calvarial osteoblasts[J].Bone Miner Res,1994;270(2):376～382
, http://www.100md.com
2，Massaque H,Ichijo H,Heldin CH et al. The transforming growth factor-beta family[J]. Ann Rev Cell Biol ,1990;6(3):597～609
3，Bolander ME. Regulation of fracture repair by growth factors[J]. Proc Soc Exp Biol Med,1992;200(1):165～170
4，Sandberg MM, Aro HT, Vuorio EL et al. Gene expression during fracture repair[J]. Clin Orthop, 1993;(289):292～312
5，Joyce ME, Jingushi S, Sporn MB et al. Role of growth factors in fracture healing[J]. Prog Clin Biol Res, 1991;365(2):391～416
1999-12-17收稿，2000-01-31修回, 百拇医药