用Phage88快速检测结核分枝杆菌
作者：吕斌 徐顺清 周宜开 陈志飞 符志军 李开赏
单位：吕斌(同济医科大学环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；徐顺清(同济医科大学环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；周宜开(同济医科大学环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；陈志飞(武汉市结核病防治所， 湖北 武汉 430020)；符志军(武汉市结核病防治所， 湖北 武汉 430020)；李开赏(武汉市结核病防治所， 湖北 武汉 430020)
关键词：Phage88噬菌体；结核分枝杆菌；检测
疾病控制杂志000107
【摘 要】 目的 建立一种特异性强、灵敏度高的致病性分枝杆菌的检测及药敏试验方法。方法 应用可表达荧光素酶的结核分枝杆菌噬菌体Phage88，采用生物发光方法对不同细菌的发光反应和药敏试验进行检测。结果 Phage88特异地对各种分枝杆菌发光，对非分枝杆菌发光值很低，两者差异有显著性，不同的分枝杆菌发光值有差异：卡介苗的发光值最高，结核杆菌的发光值最低；在含抗结核药物的培养基中，耐药结核杆菌的发光强度比非耐药结核杆菌强，其强度有明显差异。结论 用Phage88噬菌体检测结核分枝杆菌是一种快速、敏感的检测和药敏试验方法。
, http://www.100md.com
【分类号】 R378.91； R446.5 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(2000)01-0023-04
Detection of mycobacterium by using temperate mycobacteriophage
LU Bin XU Shun-qing ZHOU Yi-kai
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China)
CHEN Zhi-fei FU Zhi-jun LI Kai-shang
(Wuhan Institute of Tuberculosis Prevention, Wuhan 430020, China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To set up a fast, sensitive and correct method to detect mycobacterium and drug sensitivity of mycobacterium by using recombinant mycobacteriophages and bioluminescent method. Methods Luciferase activity was detected in different bacteria by using a recombinant temperate mycobacteriophage (Phage88). Then drug susceptibilities of different mycobacterium were assessed by using phage88. Finally the sensitivity and correction rate was compared between luciferase assay and L-J medium culture. Results Phage88 has high light production in mycobacterium specifically and only has very low light production in E.coli, and the difference is significant. Among different mycobacterium, BCG has the highest light production and mycobacterium tuberculosis has the lowest light production. The light production of drug-resistant mycobacterium strains is much higher than that of drug-sensitive strains in culture with antituberculosis drugs, including rifampicin, isoniazid and streptomycin. The duration of drug resistance test is 72 hours, which took much less time than the normal L-J method. Conclusions This assay shows a fast, sensitive and correct method to detect mycobacterium strains and their drug sensitivity.
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【Key words】 mycobacteriophage (Phage88); mycobacterium tuberculosis; detection
结核病的发病率及死亡率在全球范围内均有上升的趋势，同时耐药菌株的感染增加，给结核病的防治带来了很大的困难。由于常规结核杆菌检测和药物敏感试验方法须6～12周，无法给临床提供及时、准确的用药参考。因此，缩短结核杆菌检测和药物敏
感性试验时间，提高检测的敏感性和特异性是十分必要的。本实验采用重组的可表达荧光素酶的结核杆菌温敏噬菌体，通过发光分析建立一种简便、快速的检测结核杆菌活力和耐药性的方法。
1 材料与方法
1.1 细菌培养和计数 本实验的卡介苗(BCG)购自卫生部上海生物制品研究所。结核分枝杆菌H37Ra(ATCC25177)和结核分枝杆菌H37Rv(ATCC36801)购自中国药品生物制品检定所。耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(ATCC19420)由同济医科大学分子生物学教研室提供。大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC25922)由同济医科大学微生物学教研室提供。临床分离株由武汉市结核病防治所提供。本实验的分枝杆菌噬菌体Phage88由Albert Einstein University的William Jacobs教授提供。BCG及慢长型分枝杆菌在M7H9培养基中培养，耻垢分枝杆菌在SUTON培养基中培养，大肠杆菌在普通琼脂培养基中培养。细菌浓度采用722分光光度计测量，OD=1的细菌数约为2×109个。
, 百拇医药
1.2 分枝杆菌噬菌体的增殖、分离和计数 按Jacobs等的方法进行[1]。
1.3 分枝杆菌活力的发光分析测定 在系列10倍稀释的卡介苗、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株1 ml菌液中加入噬菌体Phage88(PFU=4.8×103*ml-1)0.1 ml，置30℃孵育24 h，在最佳发光条件下(荧光素0.22 mmol*L-1 100 μl, ATP 0.1 mmol*L-1 100 μl，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液100 μl)，分别测定30 h内发光值。
1.4 细菌耐药性的发光分析测定 标准菌株及分离株采用Mcfarland 3.0浊度，洗后重浮于2 ml培养液中，加入不含Tween80的M7H9含药及不含药培养基中30℃培养24 h，然后加入103滴度的相应噬菌体孵育24 h后按上述的方法测量发光值。
, 百拇医药
1.5 罗氏细菌培养 所有菌株均在罗氏培养基上按常规进行药敏试验。记录各菌株药敏试验的结果和时间。各菌株做两管。
1.6 测量和统计方法 每个因素做3管测发光值，每个值重复两次，每次发光测量测6 s的积分发光值。结果取平均值±标准差(
±s)进行统计分析。
2 结果
2.1 噬菌体对不同细菌的发光分析(图1) 可见大肠杆菌的发光值与阴性对照无明显差异(P>0.05)；分枝杆菌的发光值明显高于阴性对照(P<0.001)，其中BCG的发光值最高，耻垢分枝杆菌次之，结核分枝杆菌最低(H37Ra和H37Rv的发光值无明显差别(P>0.05))。
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图1 Phage88对不同细菌的发光反应
Figure 1 Luciferse reaction of Phage88 in different bacteria
2.2 噬菌体Phage88对不同分枝杆菌活力的测定
2.2.1 噬菌体Phage88对卡介苗活力的影响(图2) BCG 每毫升4.2×102个时即可有较明显的发光值(4.2×102最高发光值为189.5)，表明Phage88对BCG的灵敏度为每毫升4.2×102个，反应开始12 h后达到最高发光值。
图2 Phage88对卡介苗的活力测定
, 百拇医药
Figure 2 Activity detection of Phage88 in BCG
2.2.2 Phage88对耻垢分枝杆菌活力的测定(图3) 在Phage88中，mc155每毫升9.3×102个时可有较明显的发光值(9.3×104个最高发光值为102.8)，表明Phage88对mc155的灵敏度为每毫升9.3×102个，反应开始12 h后达最高发光值。
图3 Phage88对耻垢分枝杆菌的活力测定
Figure 3 Activity detection of Phage88 in mc155
2.2.3 Phage88对结核分枝杆菌H37Ra活力的测定(图4) 可见H37Ra 每毫升6.4×104个即可有较明显的发光值(6.4×104个最高发光值为32.47)，表明Phage88对H37Ra的灵敏度为每毫升6.4×104个，反应开始14 h后达到最高发光值。
, 百拇医药
图4 Phage88对H37Ra活力测定
Figure 4 Activity detection of Phage88 in H37Ra
2.2.4 Phage88对结核分枝杆菌H37Rv活力的测定(图5) 可见H37Rv 每毫升7.6×104个即可有较明显的发光值(7.6×104个最高发光值为31.09)，表明Phage88对H37Rv的灵敏度为每毫升6.4×104个，反应开始14 h后达到最高发光值。
图5 Phage88对H37Rv活力测定
Figure 5 Activity detection of Phage88 in H37Rv
, 百拇医药
2.3 Phage88对不同分枝杆菌的药敏试验结果
2.3.1 Phage88对利福平的药敏试验结果(图6) 通过对系列药物浓度的筛选试验，得到最适于利福平药敏试验的浓度为2 μg.ml-1。采用该浓度对不同的噬菌体和分枝杆菌进行药敏试验，可见，H37Rv、分离株2、分离株4、分离株6是耐利福平株，H37Ra、分离株1、分离株3、分离株5是药敏株。
图6 Phage88对利福平的药敏试验
Figure 6 Rifampin sensitivity test of Phage88
2.3.2 Phage88对链霉素的药敏试验结果(图7) 通过对系列药物浓度的筛选试验，得到最适于链霉素药敏试验的浓度为6 μg.ml-1。采用该浓度对不同的噬菌体和分枝杆菌进行药敏试验，可见H37Rv、临床分离株1、临床分离株2、临床分离株3、临床分离株6是耐链霉素株，H37Ra、临床分离株4、临床分离株5是药敏株。
, 百拇医药
图7 Phage88对链霉素的药敏试验
Figure 7 Streptomycin sensitivity test of Phage88
2.3.3 Phage88对异烟肼的药敏试验结果(图8) 通过对系列药物浓度的筛选试验，得到最适于异烟肼药敏试验的浓度为1 μg.ml-1。采用该浓度不同的噬菌体和分枝杆菌进行药敏试验，可见H37Rv、临床分离株2、临床分离株3、临床分离株4是耐异烟肼株，H37Ra、临床分离株1、临床分离株5、临床分离株6是药敏株。
图8 Phage88对异烟肼的药敏试验
Figure 8 Isoniazid sensitivity test of Phage88
, 百拇医药
2.3.4 与罗氏培养基的结果比较 从表1中可见两种方法的药敏试验结果一致，符合率为100%。噬菌体生物发光技术进行药敏试验所需时间明显少于罗氏培养基的时间(P<0.01)。
表1 罗氏培养基与噬菌体生物发光方法结果比较
Table 1 Result comparison of Phage88 and L-J culture Strain
Culture result
Culture time (day)
L-J
culture
Phage88
, 百拇医药
L-J
culture
Phage88
H37Rv
R,S,I resistance
R,S,I resistance
20.7
3
H37Ra
Sensitive strain
Sensitive strain
28.0
, 百拇医药
3
Clinical
separation strain 1
S resistance
S resistance
27.4
3
separation strain 2
R，S，I resistance
R，S，I resistance
25.0
, http://www.100md.com
3
separation strain 3
S，I resistance
S，I resistance
23.5
3
separation strain 4
R，I resistance
R，I resistance
28.0
3
, http://www.100md.com separation strain 5
Sensitive strain
Sensitive strain
28.0
3
separation strain 6
R，S resistance
R，S resistance
22.6
3
3 讨论
, 百拇医药 3.1 Phage88可特异地用于分枝杆菌的快速测定 本实验所用Phage88的构建是在分枝杆菌噬菌体TM4的非必须区插入含虫荧光素酶表达基因Fflux与卡介苗hsp60启动子的融合体。它是一株温敏噬菌体，在37℃即停止增殖。重组噬菌体进入相应的分枝杆菌体内后，在活菌体内增殖，同时在hsp60启动子的作用下Fflux基因表达虫荧光素酶。重组噬菌体表达的虫荧光素酶在体外发光体系中与虫荧光素及一定的因子混合后，虫荧光素酶即可与荧光素作用而发光，发光强度与荧光素酶的含量成正比。通过检测发光的强度就可对噬菌体进行定性和定量分析，从而定性和定量地分析相应的分枝杆菌存活及其数量。这是用分枝杆菌噬菌体进行分枝杆菌检测和药敏试验的原因[1，2]。
由于噬菌体生物发光技术是检测活的噬菌体在活菌体内增殖后所表达的荧光素酶的含量，从理论来说应有较高的特异性和敏感性。实验结果证明Phage88的特异性和敏感性均很高：Phage88对大肠杆菌的发光值与阴性对照相比无明显区别，对各种分枝杆菌则有明显的发光反应，特异性很好；对卡介苗的检测灵敏度可达每毫升4.2×102个，对耻垢分枝杆菌可达9.3×102个；对H37Ra为6.4×102个，对H37Rv可达7.6×104个。
, 百拇医药
3.2 Phage88可特异地用于分枝杆菌的快速药敏试验检测 Phage88对利福平、异烟肼、链霉素药敏试验结果表明，在有抗结核药存在的条件下，敏感株与耐药株的发光特性有明显的区别。噬菌体对耐药株的发光值在同等药物浓度下比对敏感株的发光值要高，差异显著(P<0.01)，说明了抗结核药物可抑制相应的敏感株的荧光素酶表达，而对耐药株的荧光素酶表达无影响。由于抗结核药物直接或间接作用于细菌的转录和翻译过程，而在结核杆菌内增殖的噬菌体对荧光素酶的表达有赖于细菌的转录和翻译过程，当两个过程受抑制后，噬菌体的增殖和表达荧光素酶的能力受到影响，发光反应降低[1，2]。
本实验用Phage88对各分离株的药敏试验均得到明显的有统计意义的发光结果，药敏试验结果的时间仅72 h，与罗氏培养基药敏试验结果一致但时间明显减少。说明了分枝杆菌噬菌体用于结核杆菌的快速检测和药敏试验有较大的应用前景，在抗结核新物的筛选上也很有应用价值。
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39770679)
, 百拇医药
【作者简介】 吕斌(1967-)，女，广西人，在读博士研究生；
周宜开(1946-)，男，湖南人，教授，博士生导师，公共卫生学院院长，国务院学位委员会学科评审组成员，主要研究方向：环境医学监测。
【参考文献】
[1] Jacobs WR, Barletta RG, Udani R, et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter phages [J]. Science, 1993,260:819～822.
[2] Riska PF, Su Y, Bardarov S, et al. Rapid film-based determination of antibiotic susceptibilities of mycobacterium tuberculosis strains by using a luciferase reporter phage and bronx box [J]. J Clin Microbiol, 1999,37(4):1144～1149.
(收稿日期 1999-11-16), 百拇医药
单位：吕斌(同济医科大学环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；徐顺清(同济医科大学环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；周宜开(同济医科大学环境医学研究所， 湖北 武汉 430030)；陈志飞(武汉市结核病防治所， 湖北 武汉 430020)；符志军(武汉市结核病防治所， 湖北 武汉 430020)；李开赏(武汉市结核病防治所， 湖北 武汉 430020)
关键词：Phage88噬菌体；结核分枝杆菌；检测
疾病控制杂志000107
【摘 要】 目的 建立一种特异性强、灵敏度高的致病性分枝杆菌的检测及药敏试验方法。方法 应用可表达荧光素酶的结核分枝杆菌噬菌体Phage88，采用生物发光方法对不同细菌的发光反应和药敏试验进行检测。结果 Phage88特异地对各种分枝杆菌发光，对非分枝杆菌发光值很低，两者差异有显著性，不同的分枝杆菌发光值有差异：卡介苗的发光值最高，结核杆菌的发光值最低；在含抗结核药物的培养基中，耐药结核杆菌的发光强度比非耐药结核杆菌强，其强度有明显差异。结论 用Phage88噬菌体检测结核分枝杆菌是一种快速、敏感的检测和药敏试验方法。
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【分类号】 R378.91； R446.5 【文献标识码】 A
【文章编号】 1008-6013(2000)01-0023-04
Detection of mycobacterium by using temperate mycobacteriophage
LU Bin XU Shun-qing ZHOU Yi-kai
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China)
CHEN Zhi-fei FU Zhi-jun LI Kai-shang
(Wuhan Institute of Tuberculosis Prevention, Wuhan 430020, China)
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【Abstract】 Objective To set up a fast, sensitive and correct method to detect mycobacterium and drug sensitivity of mycobacterium by using recombinant mycobacteriophages and bioluminescent method. Methods Luciferase activity was detected in different bacteria by using a recombinant temperate mycobacteriophage (Phage88). Then drug susceptibilities of different mycobacterium were assessed by using phage88. Finally the sensitivity and correction rate was compared between luciferase assay and L-J medium culture. Results Phage88 has high light production in mycobacterium specifically and only has very low light production in E.coli, and the difference is significant. Among different mycobacterium, BCG has the highest light production and mycobacterium tuberculosis has the lowest light production. The light production of drug-resistant mycobacterium strains is much higher than that of drug-sensitive strains in culture with antituberculosis drugs, including rifampicin, isoniazid and streptomycin. The duration of drug resistance test is 72 hours, which took much less time than the normal L-J method. Conclusions This assay shows a fast, sensitive and correct method to detect mycobacterium strains and their drug sensitivity.
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【Key words】 mycobacteriophage (Phage88); mycobacterium tuberculosis; detection
结核病的发病率及死亡率在全球范围内均有上升的趋势，同时耐药菌株的感染增加，给结核病的防治带来了很大的困难。由于常规结核杆菌检测和药物敏感试验方法须6～12周，无法给临床提供及时、准确的用药参考。因此，缩短结核杆菌检测和药物敏
感性试验时间，提高检测的敏感性和特异性是十分必要的。本实验采用重组的可表达荧光素酶的结核杆菌温敏噬菌体，通过发光分析建立一种简便、快速的检测结核杆菌活力和耐药性的方法。
1 材料与方法
1.1 细菌培养和计数 本实验的卡介苗(BCG)购自卫生部上海生物制品研究所。结核分枝杆菌H37Ra(ATCC25177)和结核分枝杆菌H37Rv(ATCC36801)购自中国药品生物制品检定所。耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(ATCC19420)由同济医科大学分子生物学教研室提供。大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC25922)由同济医科大学微生物学教研室提供。临床分离株由武汉市结核病防治所提供。本实验的分枝杆菌噬菌体Phage88由Albert Einstein University的William Jacobs教授提供。BCG及慢长型分枝杆菌在M7H9培养基中培养，耻垢分枝杆菌在SUTON培养基中培养，大肠杆菌在普通琼脂培养基中培养。细菌浓度采用722分光光度计测量，OD=1的细菌数约为2×109个。
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1.2 分枝杆菌噬菌体的增殖、分离和计数 按Jacobs等的方法进行[1]。
1.3 分枝杆菌活力的发光分析测定 在系列10倍稀释的卡介苗、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株1 ml菌液中加入噬菌体Phage88(PFU=4.8×103*ml-1)0.1 ml，置30℃孵育24 h，在最佳发光条件下(荧光素0.22 mmol*L-1 100 μl, ATP 0.1 mmol*L-1 100 μl，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液100 μl)，分别测定30 h内发光值。
1.4 细菌耐药性的发光分析测定 标准菌株及分离株采用Mcfarland 3.0浊度，洗后重浮于2 ml培养液中，加入不含Tween80的M7H9含药及不含药培养基中30℃培养24 h，然后加入103滴度的相应噬菌体孵育24 h后按上述的方法测量发光值。
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1.5 罗氏细菌培养 所有菌株均在罗氏培养基上按常规进行药敏试验。记录各菌株药敏试验的结果和时间。各菌株做两管。
1.6 测量和统计方法 每个因素做3管测发光值，每个值重复两次，每次发光测量测6 s的积分发光值。结果取平均值±标准差(
±s)进行统计分析。2 结果
2.1 噬菌体对不同细菌的发光分析(图1) 可见大肠杆菌的发光值与阴性对照无明显差异(P>0.05)；分枝杆菌的发光值明显高于阴性对照(P<0.001)，其中BCG的发光值最高，耻垢分枝杆菌次之，结核分枝杆菌最低(H37Ra和H37Rv的发光值无明显差别(P>0.05))。
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图1 Phage88对不同细菌的发光反应
Figure 1 Luciferse reaction of Phage88 in different bacteria
2.2 噬菌体Phage88对不同分枝杆菌活力的测定
2.2.1 噬菌体Phage88对卡介苗活力的影响(图2) BCG 每毫升4.2×102个时即可有较明显的发光值(4.2×102最高发光值为189.5)，表明Phage88对BCG的灵敏度为每毫升4.2×102个，反应开始12 h后达到最高发光值。
图2 Phage88对卡介苗的活力测定
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Figure 2 Activity detection of Phage88 in BCG
2.2.2 Phage88对耻垢分枝杆菌活力的测定(图3) 在Phage88中，mc155每毫升9.3×102个时可有较明显的发光值(9.3×104个最高发光值为102.8)，表明Phage88对mc155的灵敏度为每毫升9.3×102个，反应开始12 h后达最高发光值。
图3 Phage88对耻垢分枝杆菌的活力测定
Figure 3 Activity detection of Phage88 in mc155
2.2.3 Phage88对结核分枝杆菌H37Ra活力的测定(图4) 可见H37Ra 每毫升6.4×104个即可有较明显的发光值(6.4×104个最高发光值为32.47)，表明Phage88对H37Ra的灵敏度为每毫升6.4×104个，反应开始14 h后达到最高发光值。
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图4 Phage88对H37Ra活力测定
Figure 4 Activity detection of Phage88 in H37Ra
2.2.4 Phage88对结核分枝杆菌H37Rv活力的测定(图5) 可见H37Rv 每毫升7.6×104个即可有较明显的发光值(7.6×104个最高发光值为31.09)，表明Phage88对H37Rv的灵敏度为每毫升6.4×104个，反应开始14 h后达到最高发光值。
图5 Phage88对H37Rv活力测定
Figure 5 Activity detection of Phage88 in H37Rv
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2.3 Phage88对不同分枝杆菌的药敏试验结果
2.3.1 Phage88对利福平的药敏试验结果(图6) 通过对系列药物浓度的筛选试验，得到最适于利福平药敏试验的浓度为2 μg.ml-1。采用该浓度对不同的噬菌体和分枝杆菌进行药敏试验，可见，H37Rv、分离株2、分离株4、分离株6是耐利福平株，H37Ra、分离株1、分离株3、分离株5是药敏株。
图6 Phage88对利福平的药敏试验
Figure 6 Rifampin sensitivity test of Phage88
2.3.2 Phage88对链霉素的药敏试验结果(图7) 通过对系列药物浓度的筛选试验，得到最适于链霉素药敏试验的浓度为6 μg.ml-1。采用该浓度对不同的噬菌体和分枝杆菌进行药敏试验，可见H37Rv、临床分离株1、临床分离株2、临床分离株3、临床分离株6是耐链霉素株，H37Ra、临床分离株4、临床分离株5是药敏株。
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图7 Phage88对链霉素的药敏试验
Figure 7 Streptomycin sensitivity test of Phage88
2.3.3 Phage88对异烟肼的药敏试验结果(图8) 通过对系列药物浓度的筛选试验，得到最适于异烟肼药敏试验的浓度为1 μg.ml-1。采用该浓度不同的噬菌体和分枝杆菌进行药敏试验，可见H37Rv、临床分离株2、临床分离株3、临床分离株4是耐异烟肼株，H37Ra、临床分离株1、临床分离株5、临床分离株6是药敏株。
图8 Phage88对异烟肼的药敏试验
Figure 8 Isoniazid sensitivity test of Phage88
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2.3.4 与罗氏培养基的结果比较 从表1中可见两种方法的药敏试验结果一致，符合率为100%。噬菌体生物发光技术进行药敏试验所需时间明显少于罗氏培养基的时间(P<0.01)。
表1 罗氏培养基与噬菌体生物发光方法结果比较
Table 1 Result comparison of Phage88 and L-J culture Strain
Culture result
Culture time (day)
L-J
culture
Phage88
, 百拇医药
L-J
culture
Phage88
H37Rv
R,S,I resistance
R,S,I resistance
20.7
3
H37Ra
Sensitive strain
Sensitive strain
28.0
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3
Clinical
separation strain 1
S resistance
S resistance
27.4
3
separation strain 2
R，S，I resistance
R，S，I resistance
25.0
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3
separation strain 3
S，I resistance
S，I resistance
23.5
3
separation strain 4
R，I resistance
R，I resistance
28.0
3
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Sensitive strain
Sensitive strain
28.0
3
separation strain 6
R，S resistance
R，S resistance
22.6
3
3 讨论
, 百拇医药 3.1 Phage88可特异地用于分枝杆菌的快速测定 本实验所用Phage88的构建是在分枝杆菌噬菌体TM4的非必须区插入含虫荧光素酶表达基因Fflux与卡介苗hsp60启动子的融合体。它是一株温敏噬菌体，在37℃即停止增殖。重组噬菌体进入相应的分枝杆菌体内后，在活菌体内增殖，同时在hsp60启动子的作用下Fflux基因表达虫荧光素酶。重组噬菌体表达的虫荧光素酶在体外发光体系中与虫荧光素及一定的因子混合后，虫荧光素酶即可与荧光素作用而发光，发光强度与荧光素酶的含量成正比。通过检测发光的强度就可对噬菌体进行定性和定量分析，从而定性和定量地分析相应的分枝杆菌存活及其数量。这是用分枝杆菌噬菌体进行分枝杆菌检测和药敏试验的原因[1，2]。
由于噬菌体生物发光技术是检测活的噬菌体在活菌体内增殖后所表达的荧光素酶的含量，从理论来说应有较高的特异性和敏感性。实验结果证明Phage88的特异性和敏感性均很高：Phage88对大肠杆菌的发光值与阴性对照相比无明显区别，对各种分枝杆菌则有明显的发光反应，特异性很好；对卡介苗的检测灵敏度可达每毫升4.2×102个，对耻垢分枝杆菌可达9.3×102个；对H37Ra为6.4×102个，对H37Rv可达7.6×104个。
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3.2 Phage88可特异地用于分枝杆菌的快速药敏试验检测 Phage88对利福平、异烟肼、链霉素药敏试验结果表明，在有抗结核药存在的条件下，敏感株与耐药株的发光特性有明显的区别。噬菌体对耐药株的发光值在同等药物浓度下比对敏感株的发光值要高，差异显著(P<0.01)，说明了抗结核药物可抑制相应的敏感株的荧光素酶表达，而对耐药株的荧光素酶表达无影响。由于抗结核药物直接或间接作用于细菌的转录和翻译过程，而在结核杆菌内增殖的噬菌体对荧光素酶的表达有赖于细菌的转录和翻译过程，当两个过程受抑制后，噬菌体的增殖和表达荧光素酶的能力受到影响，发光反应降低[1，2]。
本实验用Phage88对各分离株的药敏试验均得到明显的有统计意义的发光结果，药敏试验结果的时间仅72 h，与罗氏培养基药敏试验结果一致但时间明显减少。说明了分枝杆菌噬菌体用于结核杆菌的快速检测和药敏试验有较大的应用前景，在抗结核新物的筛选上也很有应用价值。
【基金项目】 国家自然科学基金资助项目(39770679)
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【作者简介】 吕斌(1967-)，女，广西人，在读博士研究生；
周宜开(1946-)，男，湖南人，教授，博士生导师，公共卫生学院院长，国务院学位委员会学科评审组成员，主要研究方向：环境医学监测。
【参考文献】
[1] Jacobs WR, Barletta RG, Udani R, et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reporter phages [J]. Science, 1993,260:819～822.
[2] Riska PF, Su Y, Bardarov S, et al. Rapid film-based determination of antibiotic susceptibilities of mycobacterium tuberculosis strains by using a luciferase reporter phage and bronx box [J]. J Clin Microbiol, 1999,37(4):1144～1149.
(收稿日期 1999-11-16), 百拇医药