大鼠脾细胞DNA含量与早期死亡时间关系的图像分析研究
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法医学杂志 2000年第1期第16卷 论著
作者：刘良 林乐泉 刘艳 刘亚玲 张力 邓伟年
单位：刘良(同济医科大学法医病理学教研室，湖北武汉 430030)；林乐泉(长春市中级人民法院技术室,吉林 130062)；刘艳(同济医科大学法医病理学教研室，湖北武汉 430030)；刘亚玲(同济医科大学附属协和医院儿科，湖北武汉 430022)；张力(黑龙江省高级人民法院技术室，黑龙江哈尔滨 150040)；邓伟年(同济医科大学法医病理学教研室，湖北武汉 430030)
关键词：早期死亡时间；DNA；图像分析；大鼠；脾
法医学杂志000103
[摘要]选择15只大鼠，处死后，在24h内每隔1h进行脾细胞学涂片、福尔马林液固定、Feulgen染色后，用自动图像分析仪测量细胞DNA的积分光密度、平均光密度、异形指数等指标，并对数据进行统计学处理。实验结果证明大鼠脾细胞DNA含量在死后24h内，随死亡时间的延长而呈较有规律的下降。其中积分光密度、平均光密度、异形指数是用来研究死亡24h内脾DNA降解规律，并准确推断死亡时间的较好指标。
, 百拇医药
[中图分类号]DF795.1[文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)01-0008-02
An experimental study on the relationship between early postmortem intervals and DNA content of spleen cells in rats by computerized image analysis
Liu Liang ,et al.
(Department of Forensic Pathology,TongJi medical university, Wuhan 340030,P.R.China)
15 rats were used in this experiment. After the rats were executed,spleen cells were collected and smeared in every hour within 24 hours, then fixed with formalin solution and stained with Feulgen′ s method. Mean and integral optical density and abnormal index of cell DNA were measured with a auto- TV- image system, and the data were statistically analyzed. Results showed that the DNA degeneration rate of rat spleen cells had a linear relationship with early postmortem intervals.
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Key words: early postmortem period;DNA; auto- TV- image system;spleen;rat
1 材料和方法
1.1 实验动物
取健康品系大鼠15只，体重250g±15g(由校医学动物部提供)，适应性饲养3天，颈椎错位处死后，24h内每隔1h取脾组织块进行细胞学涂片(操作要求规范,室温在22～28℃)，福尔马林液固定2h。
1.2 福尔根染色法染色
试剂配制及步骤，参考芮菊生[1]方法，略加改进进行染色。
1.3 图像分析
用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统(同济清平影像工程公司提供)对染色后的涂片进行分析。
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(1)图像摄入：20倍光镜下，每张涂片上随机取5个视野，每个视野至少有5个以上的细胞。由彩色CCD摄像机以彩色模式将细胞图像摄入，通过模数转换通道将图像数字化后，系统自动生成扩展名为img的图像文件，存入计算机硬盘内。
(2)图像测量：测量前，测背底，即图像分析系统自动对每张涂片进行减背底处理，扣除显微镜照明不一致对测量结果的影响。在选定测量参数为DNA后，再对积分光密度、异形指数、形状因子、圆形度指标进行选定，测量定标为200倍，每象素点为0.389μm，然后进行圆测量、滤波处理后编辑自动批处理程序，令系统自动按图像摄入顺序调入图像,获得对图像的测量数据。
(3)参考陈心广等[2]介绍的方法，将图像分析仪测出的数据用SAS、EXCEL软件进行统计学分析及做图。并对所获得数据进行有关统计学处理,计算出一元回归方程。
2 实验结果
, 百拇医药
2.1 大鼠脾细胞异形指数图像分析
大鼠脾细胞异形指数在死后前14h内缓慢上升，而后上升趋势加速，在20h后上升斜率变大(见图1)。
图1 大鼠脾细胞异形指数
2.2 大鼠脾细胞平均光密度图像分析
大鼠脾细胞平均光密度在死后4h内下降相对较慢(下降不到1个百分点)，5至14h内每2h约下降1个百分点,15至24h,每h下降约1个百分点，24h内DNA含量下降约17%(见图2)。
图2 大鼠脾细胞平均光密度
, 百拇医药
2.3 大鼠脾细胞积分光密度图像分析
同平均光密度类似，大鼠脾细胞积分光密度在死后4h内下降相对较慢，后呈逐渐下降的趋势，24h内DNA含量下降约17%(图3)。
图3 大鼠脾细胞积分光密度
2.4 回归分析
为确定以上参数是否与死亡时间有线性关系，用SAS的GLM过程对脾各指标进行回归分析结果如下:
Y=-77.152499+21.94690626X1
R-Square=0.811242
, http://www.100md.com Y=124.2671942-718.3665993X2
R-Square=0.954582
Y=125.027924-3.9540942X3
R-Square=0.954310
Y为死亡时间；X1为异形指数均数；X2为平均光密度均数；X3为积分光密度均数；R-Square为决定系数。
3 讨论
死亡时间是法医学研究的一个重要课题，寻找一种较为准确的推断方法一直是法医病理学研究的一个重要内容。以往研究，多依靠尸体现象来进行。但其准确性受到许多外界因素的影响，如环境温度、体态、衣着、尸体接触物体的导热率、死亡前体温(几乎是不可知的)等因素，都会使判断的死亡时间出现较大误差[3-5]。而尸僵[6]、尸斑等尸体现象只能对死亡时间的范围进行粗略推测，且也有较大的误差。尸体化学成分变化曾是死亡时间研究的一个热点，特别是关于玻璃体K+含量与死亡时间的相关性方面，不少学者都建立了自己的直线方程[7]。但其准确性也受诸如死亡机制、环境温度、濒死期长短、死亡发生时在血液中是否含有酒精[8]等外界因素的影响。因此，这种方法在死后的12h以后就变得较不准确[9]。随着分子生物学及计算机技术，尤其是自动图像分析系统的不断发展，其给法医病理学的研究，其中也包括死亡时间的研究带来了巨大的机遇。本实验就是利用计算机图像分析技术，选择积分光密度、平均光密度、异形指数、圆形度等指标，测量出它们在大鼠死后24h内的连续变化，并统计各指标与死亡时间的关系曲线，筛选出有反应线性关系的指标，为进一步的研究工作打基础。
, 百拇医药
本实验选择了5个技术指标，其中三种参数，即异形指数、平均光密度和积分光密度的变化，统计学处理显示较有意义。研究表明，平均光密度和积分光密度与死亡时间呈负相关，而异形指数呈正相关。
1989年齐凤英[10]等用流氏细胞仪对5只大鼠死后不同时段的心、肝、肾组织细胞的DNA含量检测分析。本实验的结果与齐凤英的实验大致相同(见表1)。
表1 本实验与齐凤英实验结果比较(DNA%)
死亡时间(h)
齐凤英实验
本实验(脾细胞积分光密度)
0
100.00
, 百拇医药
100.00
6
99.50
98.29
12
91.30
94.85
18
87.10
87.88
24
81.30
82.40
, 百拇医药
Nunzio[11]认为脾组织由于自溶的速度非常快，因此不适合于进行DNA降解方面的研究。徐俊杰[12]等1990年利用DNA荧光法测定兔死亡后短时间搁置过程中,器官内DNA含量变化，发现在死后7h内,脾组织中DNA随时间变化而增加(解释为核膜自溶的结果,并认为心、肝、肾、骨骼肌的核膜更稳定)。但本实验结果看，总体上脾细胞DNA呈较有规律的下降，也就是说，在使用图像分析仪进行DNA降解的研究方面，脾组织是很好的研究材料。
本实验首次将图像分析技术用于死亡时间的研究。并得到令人满意的初步结果。
经统计学处理，本实验得出脾细胞DNA降解的线性回归方程：
Y=-77.152499+21.94690626X1(异形指数均数)
Y=124.267194-718.3665993X2(平均光密度均数)
, 百拇医药
Y=125.027924-3.9540942X3(积分光密度均数)
实验表明进一步的多指标，多器官或组织，同时考虑其它影响因素的研究既十分必要，又颇有前景。
参考文献:
[1]芮菊生,杜懋芩,陈海明,等.组织切片技术[M].第1版.北京：北京人民卫生出版社,1980.213.
[2]陈心广,尹平,叶方立,等.医学研究设计与数据分析[M].第1版.武汉武汉大学出版社,1997.
[3] Brown A ,Marshall T. Body temperature as a means of estimating the time of death[J]. Forensic Sci. Int,1974,4:125- 133.
, 百拇医药
[4] Joseph A,Schiedele A. A general method for assessing factors controlling post- mortem cooling[J]. J Forensic Sci,1970,164- 191.
[5] Claus Henssge . The estimation of the time since death in the early postmortem period[M]. London,The Bath Press,Avon.1995.32- 33.
[6] Krompecher T. Effect of various causes of death on the evolution of rigor mortis[J]. Forensic Sci Int, 1983,22:1- 9.
[7] Gamero Lucas JJ,Romero JL,Ramos HM,et al. Precision estimating time of death by vitreous potassium - comparison of various equations[J]. Forensic Sci Int ,1992,56:137- 145
, 百拇医药
[8] Coe JI.Vitreous potassium as a measure of the postmortem interval. A historical review and critical evaluation[J]. Forensic Sci Int,1989,42:201- 213.
[9] Coe JI. La chimica post- mortale del sangue ,del liquore dell'umor vitreo[M].In:Piccin, ed. Trattato di medicina forense, 1994,vol 2.Padova.
[10]齐凤英，许树棠，刘汝俊,等.死后不同时间的组织细胞DNA含量分析[J].中国法医学杂志,1989,(4)4：213-215.
[11] Nunzio R,Di Nunno,Fulvio MD,et al.Is flow cytometric evaluation of DNA degradation a reliable method to investigate the early postmortem period[J].Am J Med and Pathol,1998,19(1):50- 53.
[12]徐俊杰，阙庭志.荧光法测定兔死后组织中DNA含量变化[J].法医学杂志,1990,5(2)：11-14.
(收稿日期：1999-07-05), http://www.100md.com
单位：刘良(同济医科大学法医病理学教研室，湖北武汉 430030)；林乐泉(长春市中级人民法院技术室,吉林 130062)；刘艳(同济医科大学法医病理学教研室，湖北武汉 430030)；刘亚玲(同济医科大学附属协和医院儿科，湖北武汉 430022)；张力(黑龙江省高级人民法院技术室，黑龙江哈尔滨 150040)；邓伟年(同济医科大学法医病理学教研室，湖北武汉 430030)
关键词：早期死亡时间；DNA；图像分析；大鼠；脾
法医学杂志000103
[摘要]选择15只大鼠，处死后，在24h内每隔1h进行脾细胞学涂片、福尔马林液固定、Feulgen染色后，用自动图像分析仪测量细胞DNA的积分光密度、平均光密度、异形指数等指标，并对数据进行统计学处理。实验结果证明大鼠脾细胞DNA含量在死后24h内，随死亡时间的延长而呈较有规律的下降。其中积分光密度、平均光密度、异形指数是用来研究死亡24h内脾DNA降解规律，并准确推断死亡时间的较好指标。
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[中图分类号]DF795.1[文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)01-0008-02
An experimental study on the relationship between early postmortem intervals and DNA content of spleen cells in rats by computerized image analysis
Liu Liang ,et al.
(Department of Forensic Pathology,TongJi medical university, Wuhan 340030,P.R.China)
15 rats were used in this experiment. After the rats were executed,spleen cells were collected and smeared in every hour within 24 hours, then fixed with formalin solution and stained with Feulgen′ s method. Mean and integral optical density and abnormal index of cell DNA were measured with a auto- TV- image system, and the data were statistically analyzed. Results showed that the DNA degeneration rate of rat spleen cells had a linear relationship with early postmortem intervals.
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Key words: early postmortem period;DNA; auto- TV- image system;spleen;rat
1 材料和方法
1.1 实验动物
取健康品系大鼠15只，体重250g±15g(由校医学动物部提供)，适应性饲养3天，颈椎错位处死后，24h内每隔1h取脾组织块进行细胞学涂片(操作要求规范,室温在22～28℃)，福尔马林液固定2h。
1.2 福尔根染色法染色
试剂配制及步骤，参考芮菊生[1]方法，略加改进进行染色。
1.3 图像分析
用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统(同济清平影像工程公司提供)对染色后的涂片进行分析。
, http://www.100md.com
(1)图像摄入：20倍光镜下，每张涂片上随机取5个视野，每个视野至少有5个以上的细胞。由彩色CCD摄像机以彩色模式将细胞图像摄入，通过模数转换通道将图像数字化后，系统自动生成扩展名为img的图像文件，存入计算机硬盘内。
(2)图像测量：测量前，测背底，即图像分析系统自动对每张涂片进行减背底处理，扣除显微镜照明不一致对测量结果的影响。在选定测量参数为DNA后，再对积分光密度、异形指数、形状因子、圆形度指标进行选定，测量定标为200倍，每象素点为0.389μm，然后进行圆测量、滤波处理后编辑自动批处理程序，令系统自动按图像摄入顺序调入图像,获得对图像的测量数据。
(3)参考陈心广等[2]介绍的方法，将图像分析仪测出的数据用SAS、EXCEL软件进行统计学分析及做图。并对所获得数据进行有关统计学处理,计算出一元回归方程。
2 实验结果
, 百拇医药
2.1 大鼠脾细胞异形指数图像分析
大鼠脾细胞异形指数在死后前14h内缓慢上升，而后上升趋势加速，在20h后上升斜率变大(见图1)。
图1 大鼠脾细胞异形指数
2.2 大鼠脾细胞平均光密度图像分析
大鼠脾细胞平均光密度在死后4h内下降相对较慢(下降不到1个百分点)，5至14h内每2h约下降1个百分点,15至24h,每h下降约1个百分点，24h内DNA含量下降约17%(见图2)。
图2 大鼠脾细胞平均光密度
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2.3 大鼠脾细胞积分光密度图像分析
同平均光密度类似，大鼠脾细胞积分光密度在死后4h内下降相对较慢，后呈逐渐下降的趋势，24h内DNA含量下降约17%(图3)。
图3 大鼠脾细胞积分光密度
2.4 回归分析
为确定以上参数是否与死亡时间有线性关系，用SAS的GLM过程对脾各指标进行回归分析结果如下:
Y=-77.152499+21.94690626X1
R-Square=0.811242
, http://www.100md.com Y=124.2671942-718.3665993X2
R-Square=0.954582
Y=125.027924-3.9540942X3
R-Square=0.954310
Y为死亡时间；X1为异形指数均数；X2为平均光密度均数；X3为积分光密度均数；R-Square为决定系数。
3 讨论
死亡时间是法医学研究的一个重要课题，寻找一种较为准确的推断方法一直是法医病理学研究的一个重要内容。以往研究，多依靠尸体现象来进行。但其准确性受到许多外界因素的影响，如环境温度、体态、衣着、尸体接触物体的导热率、死亡前体温(几乎是不可知的)等因素，都会使判断的死亡时间出现较大误差[3-5]。而尸僵[6]、尸斑等尸体现象只能对死亡时间的范围进行粗略推测，且也有较大的误差。尸体化学成分变化曾是死亡时间研究的一个热点，特别是关于玻璃体K+含量与死亡时间的相关性方面，不少学者都建立了自己的直线方程[7]。但其准确性也受诸如死亡机制、环境温度、濒死期长短、死亡发生时在血液中是否含有酒精[8]等外界因素的影响。因此，这种方法在死后的12h以后就变得较不准确[9]。随着分子生物学及计算机技术，尤其是自动图像分析系统的不断发展，其给法医病理学的研究，其中也包括死亡时间的研究带来了巨大的机遇。本实验就是利用计算机图像分析技术，选择积分光密度、平均光密度、异形指数、圆形度等指标，测量出它们在大鼠死后24h内的连续变化，并统计各指标与死亡时间的关系曲线，筛选出有反应线性关系的指标，为进一步的研究工作打基础。
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本实验选择了5个技术指标，其中三种参数，即异形指数、平均光密度和积分光密度的变化，统计学处理显示较有意义。研究表明，平均光密度和积分光密度与死亡时间呈负相关，而异形指数呈正相关。
1989年齐凤英[10]等用流氏细胞仪对5只大鼠死后不同时段的心、肝、肾组织细胞的DNA含量检测分析。本实验的结果与齐凤英的实验大致相同(见表1)。
表1 本实验与齐凤英实验结果比较(DNA%)
死亡时间(h)
齐凤英实验
本实验(脾细胞积分光密度)
0
100.00
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100.00
6
99.50
98.29
12
91.30
94.85
18
87.10
87.88
24
81.30
82.40
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Nunzio[11]认为脾组织由于自溶的速度非常快，因此不适合于进行DNA降解方面的研究。徐俊杰[12]等1990年利用DNA荧光法测定兔死亡后短时间搁置过程中,器官内DNA含量变化，发现在死后7h内,脾组织中DNA随时间变化而增加(解释为核膜自溶的结果,并认为心、肝、肾、骨骼肌的核膜更稳定)。但本实验结果看，总体上脾细胞DNA呈较有规律的下降，也就是说，在使用图像分析仪进行DNA降解的研究方面，脾组织是很好的研究材料。
本实验首次将图像分析技术用于死亡时间的研究。并得到令人满意的初步结果。
经统计学处理，本实验得出脾细胞DNA降解的线性回归方程：
Y=-77.152499+21.94690626X1(异形指数均数)
Y=124.267194-718.3665993X2(平均光密度均数)
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Y=125.027924-3.9540942X3(积分光密度均数)
实验表明进一步的多指标，多器官或组织，同时考虑其它影响因素的研究既十分必要，又颇有前景。
参考文献:
[1]芮菊生,杜懋芩,陈海明,等.组织切片技术[M].第1版.北京：北京人民卫生出版社,1980.213.
[2]陈心广,尹平,叶方立,等.医学研究设计与数据分析[M].第1版.武汉武汉大学出版社,1997.
[3] Brown A ,Marshall T. Body temperature as a means of estimating the time of death[J]. Forensic Sci. Int,1974,4:125- 133.
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[4] Joseph A,Schiedele A. A general method for assessing factors controlling post- mortem cooling[J]. J Forensic Sci,1970,164- 191.
[5] Claus Henssge . The estimation of the time since death in the early postmortem period[M]. London,The Bath Press,Avon.1995.32- 33.
[6] Krompecher T. Effect of various causes of death on the evolution of rigor mortis[J]. Forensic Sci Int, 1983,22:1- 9.
[7] Gamero Lucas JJ,Romero JL,Ramos HM,et al. Precision estimating time of death by vitreous potassium - comparison of various equations[J]. Forensic Sci Int ,1992,56:137- 145
, 百拇医药
[8] Coe JI.Vitreous potassium as a measure of the postmortem interval. A historical review and critical evaluation[J]. Forensic Sci Int,1989,42:201- 213.
[9] Coe JI. La chimica post- mortale del sangue ,del liquore dell'umor vitreo[M].In:Piccin, ed. Trattato di medicina forense, 1994,vol 2.Padova.
[10]齐凤英，许树棠，刘汝俊,等.死后不同时间的组织细胞DNA含量分析[J].中国法医学杂志,1989,(4)4：213-215.
[11] Nunzio R,Di Nunno,Fulvio MD,et al.Is flow cytometric evaluation of DNA degradation a reliable method to investigate the early postmortem period[J].Am J Med and Pathol,1998,19(1):50- 53.
[12]徐俊杰，阙庭志.荧光法测定兔死后组织中DNA含量变化[J].法医学杂志,1990,5(2)：11-14.
(收稿日期：1999-07-05), http://www.100md.com