低分子肝素协同aFGF促“自身血管搭桥”
作者：陈书艳 张建军 张爱兵 荣烨之 徐惠芬 赵美华 吕宝经
单位：陈书艳 荣烨之 徐惠芬 赵美华 吕宝经(200092 上海第二医科大学附属新华医院心内科)；张建军(上海市第一人民医院心内科)；张爱兵(海军医学研究所)
关键词：酸性成纤维细胞生长因子；低分子肝素；血管生成
中国介入心脏病学杂志000117
【摘要】 目的 探讨低分子肝素(LMWH)协同酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)促“自身血管搭桥”的可行性。方法 建立兔下肢缺血模型(28只兔)，平均分成4组：(1)盐水组；(2)LMWH组；(3)aFGF组；(4)aFGF+LMWH组。术后第28天，通过动脉造影数字减影、血管免疫组化等技术比较各组小血管数量及平滑肌厚度。结果 静脉给予低剂量的aFGF(200 μg)未见明显的促血管生成作用，当相同剂量的aFGF与LMWH(1 000 ICU)合用时显示出明显的促血管生成作用，各组间血管平滑肌厚度差异无明显性。结论 LMWH在体内能够协同aFGF促“自身血管搭桥”。
, 百拇医药
Cooperative effect of low molecular weight heparin and aFGF in acceleration of “Own bypass surgery"
Chen Shuyan, Zhang Jianjun, Zhang Aibing, et al.
(Department of Cardiology, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092)
【Abstract】 Objective To explore the potential possibility of lower molecular weight heparin (LMWH) cooperate with aFGF in accelerating “Own bypass surgery" in vivo. Methods Ischemia model was induced in one of the hinds limb of 28 new zealand white rabbits. Four group of animpal were studied equelly, group Ⅰ of saline, group Ⅱ of LMWH, group Ⅲ of aFGF, group Ⅳ of aFGF plus LMWH. Vessels density and thickness of the ischemic limb of each different group′s animal was compared each other on postoperative days 28 by angiography with DSA and standard immunoperoxidase techanique. Results Adiministered aFGF in low dosage by in venous infusion, no significant neovascularization were found. But, when the same dosage of aFGF plus LMWH were administered in vein, a significant neovascularization was found. Conclusion LMWH can cooperate with aFGF in accelerating “Own bypass surgery".
, 百拇医药
【Key words】 Acidic fibroblast growth factor Low molecular weight heparin Neovascularization
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)是一种主要的促血管生成因子，现已成为尝试“自身血管搭桥”的主要药物。然而，由于其半衰期短、有效剂量大、使用费用昂贵等限制了其应用研究。另外FGF在促血管生成的同时是否使平滑肌细胞过度地增殖也成为“自身血管搭桥”设想最终能否成为现实的一个重要问题。寻找与FGF有协同作用同时又能抑制平滑肌细胞过度增殖的药物将成为今后的研究热点。本研究在兔下肢缺血模型上观察了低分子肝素协同aFGF促“自身血管搭桥”的可行性。
材料和方法
1.兔下肢缺血模型的建立：取雄性新西兰种系家兔28只，体重2.0～3.0 kg。随机分为4组，每组7只。20%乌拉坦(2.5～3.0 ml/kg)经耳缘静脉麻醉后，暴露和分离股动脉，分别结扎股动脉起止端及其分支，切除股动脉。
, http://www.100md.com
2.分组及给药(表1)：低分子肝素(LMWH)由杭州赛诺菲民生制药有限公司提供；aFGF由牛脑中分离纯化(自备)。
表1 动物分组及给药 分 组
用 药
盐水组
生理盐水100 ml
LMWH组
生理盐水100 ml+LWMH 1 00 ICU
aFGF组
生理盐水100 ml+aFGF 200 μg
aFGF+LMWH组
, http://www.100md.com
生理盐水100 ml+aFGF 200 μg
LWMH 1 00 ICU
术后即刻将各组份药物分别经耳缘静脉输入，1次/隔2天，3次/周，共给药2周。术后第28天行髂动脉造影。处死动物，在髂外动脉与动脉连线的中点内侧2～3 cm处取0.5 cm×1.5 cm×2.0 cm组织块，微波生理盐水固定。
3.观察指标：(1)髂动脉造影：血管造影数字减影，定性观察血管生长情况。(2)血管免疫组化染色及血管计数：平滑肌肌动蛋白单克隆抗体标记血管平滑肌细胞后，光镜下进行血管计数，定量观察血管生长情况。(3)血管平滑肌层厚度测定：使用ZEISS公司的KS400计算机图象分析系统，将各组血管免疫组化病理片进行扫描，图象分析，测定各组横截面积约为25 μm2大小的血管平滑肌肌层的平均厚度。
4.统计学处理：数据用
±s表示，组间比较采用t检验。结 果
, 百拇医药
1.髂动脉造影所见：盐水组、LMWH组和aFGF组右下肢剔除血管的近端至远端有少量的侧支血管，三组差别不明显；而aFGF+LMWH组则显示较前三组明显增多的侧支血管。
2.血管免疫组化染色：兔下肢肌组织血管免疫组化染色所见：正常肌组织间隙中小血管极少；LMWH组、aFGF组与盐水组相似：肌组织呈波浪样坏死，肌组织间隙中有少量的稀疏分布的小血管；aFGF+LMWH组肌组织坏死较盐水组减轻，肌组织间隙中有较多的均匀分布的小血管。
3.血管计数：免疫组化病理切片的血管计数(个/视野)显示(图1)：aFGF+LMWH组37.71±7.91分别与盐水组9.14±2.91,P<0.01、LMWH组11.43±3.64,P<0.01及aFGF组9.86±3.29,P<0.01比较，差异极显著；后三组之间比较，无显著性差异(P值均大于0.05)。
, http://www.100md.com
图1 各组血管数的比较(+为与aFGF+LMHP组比较，P<0.01)
4.血管平滑肌厚度的测定(图2)：盐水组血管平滑肌厚度(1.04±0.22)μm分别与aFGF+LMWH组(1.12±0.30)μm,P>0.05、LMWH组(0.95±0.17)μm,P>0.05及aFGF组(1.08±0.28)μm,P>0.05，比较差异无显著性。
图2 各组血管血管平滑肌层的厚度(+为与盐水组比较，P<0.01)
讨 论
aFGF是体内主要的促血管生长因子之一，局部动脉内给药及肌肉注射均显示aFGF具有明显的促血管生成作用[1，2]。据报道，单剂量(3～60 μg)静注125I标记的aFGF，其从血浆中清除的初始半衰期为3～4分钟，随后出现一个缓慢的4～7小时的终末半衰期[3]。因此，要维持aFGF的有效作用时间需要较大的初始剂量。本研究静脉给予低剂量的aFGF(200 μg)后未见明显的促缺血区侧支血管生成作用，可能是由于我们给予的aFGF剂量偏小所致。但当相同剂量的aFGF(200 μg)与LMWH(1 000 ICU)合用时显示出明显的促血管生成作用，表明LMWH具有明显的协同aFGF促缺血区侧支血管生成的作用。其作用机制可能与普通肝素相似，通过以下二方面发挥其协同作用的：(1)通过调节细胞表面aFGF受体的构型而增强aFGF促细胞增殖的活性[4]，由于活性的增加，因此使aFGF促血管生成所需的有效剂量下降。(2)延长aFGF的半衰期：由于aFGF分子结构中缺少半胱氨酸残基，特别是二硫键，因此aFGF对变性条件高度敏感，易被酸和热失活，并容易被体内的蛋白水解酶降解[5]。LMWH与aFGF结合后可能使aFGF分子环化从而稳定了aFGF的三级结构，使aFGF对酸、热及蛋白水解酶等具有抵抗力，从而使其半衰期延长。另外，LMWH进入体内后，主要存在于内皮细胞表面和细胞外基质中，在肝素酶的作用下，不断降解。与LMWH结合的aFGF随着LMWH的降解而逐渐地从细胞外间质中释放出来。因此LMWH在体内又可起到aFGF贮藏器的作用，使aFGF的终末半衰期进一步延长。由于aFGF半衰期的延长，使得aFGF的有效作用时间也随之延长。
, http://www.100md.com
aFGF在体内是否引起血管平滑肌细胞的过度增生，现仍存有争议。本研究结果显示aFGF+LMWH组、aFGF组、LMWH组与盐水组之间血管平滑肌厚度差异均无显著性(P>0.05)。可能与我们给予的aFGF剂量小有关。
国外的研究表明[6]静脉给予碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)9周后，犬红细胞压积和血小板均减少，对犬肺、肝、脾、肾、骨髓等组织未见明显影响。本研究仅在非粥样硬化兔下肢上观察了aFGF及其与LMWH联合应用对缺血区血管生成的影响，未对aFGF及LMWH的副作用进行观察，这方面的工作有待于今后进一步研究。
参 考 文 献
1，Li Qunpu, Allan D, Sniderman FR, et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation, 1993,88:208-215.
, http://www.100md.com
2，Lopez JJ, Edelman ER, Stamler A, et al. Angiogenic potential of perivascularly delivered aFGF in a porcine model of chronic myocardial ischemia. Am J Physiol, 1998,274(3 Pt 2):H930-H936.
3，Hondermarck H, Courty J, Boilly B, et al. Distribution of intravenously administered acidic and basic fibroblast growth factor in the mouse. Experiention, 1990,46:973-974.
4，Johnson DE, Williams LT. Structural and functional diversity in the FGF receptor mutigene family. Adv Cancer Res, 1993,60:1-40.
, 百拇医药
5，Gospodarowcz D, Cheng L. Heparin Protects acidic and basic fibroblast growth factor from inactivation. J Cell Physiol, 1987,128:475.
6，Daisy F, Lazarous MS, Matie S, et al. Effects of chronic Systemic adiministration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart. Circulation, 1995,91:145-153.
(收稿:1999-02-27)
, http://www.100md.com
单位：陈书艳 荣烨之 徐惠芬 赵美华 吕宝经(200092 上海第二医科大学附属新华医院心内科)；张建军(上海市第一人民医院心内科)；张爱兵(海军医学研究所)
关键词：酸性成纤维细胞生长因子；低分子肝素；血管生成
中国介入心脏病学杂志000117
【摘要】 目的 探讨低分子肝素(LMWH)协同酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)促“自身血管搭桥”的可行性。方法 建立兔下肢缺血模型(28只兔)，平均分成4组：(1)盐水组；(2)LMWH组；(3)aFGF组；(4)aFGF+LMWH组。术后第28天，通过动脉造影数字减影、血管免疫组化等技术比较各组小血管数量及平滑肌厚度。结果 静脉给予低剂量的aFGF(200 μg)未见明显的促血管生成作用，当相同剂量的aFGF与LMWH(1 000 ICU)合用时显示出明显的促血管生成作用，各组间血管平滑肌厚度差异无明显性。结论 LMWH在体内能够协同aFGF促“自身血管搭桥”。
, 百拇医药
Cooperative effect of low molecular weight heparin and aFGF in acceleration of “Own bypass surgery"
Chen Shuyan, Zhang Jianjun, Zhang Aibing, et al.
(Department of Cardiology, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092)
【Abstract】 Objective To explore the potential possibility of lower molecular weight heparin (LMWH) cooperate with aFGF in accelerating “Own bypass surgery" in vivo. Methods Ischemia model was induced in one of the hinds limb of 28 new zealand white rabbits. Four group of animpal were studied equelly, group Ⅰ of saline, group Ⅱ of LMWH, group Ⅲ of aFGF, group Ⅳ of aFGF plus LMWH. Vessels density and thickness of the ischemic limb of each different group′s animal was compared each other on postoperative days 28 by angiography with DSA and standard immunoperoxidase techanique. Results Adiministered aFGF in low dosage by in venous infusion, no significant neovascularization were found. But, when the same dosage of aFGF plus LMWH were administered in vein, a significant neovascularization was found. Conclusion LMWH can cooperate with aFGF in accelerating “Own bypass surgery".
, 百拇医药
【Key words】 Acidic fibroblast growth factor Low molecular weight heparin Neovascularization
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)是一种主要的促血管生成因子，现已成为尝试“自身血管搭桥”的主要药物。然而，由于其半衰期短、有效剂量大、使用费用昂贵等限制了其应用研究。另外FGF在促血管生成的同时是否使平滑肌细胞过度地增殖也成为“自身血管搭桥”设想最终能否成为现实的一个重要问题。寻找与FGF有协同作用同时又能抑制平滑肌细胞过度增殖的药物将成为今后的研究热点。本研究在兔下肢缺血模型上观察了低分子肝素协同aFGF促“自身血管搭桥”的可行性。
材料和方法
1.兔下肢缺血模型的建立：取雄性新西兰种系家兔28只，体重2.0～3.0 kg。随机分为4组，每组7只。20%乌拉坦(2.5～3.0 ml/kg)经耳缘静脉麻醉后，暴露和分离股动脉，分别结扎股动脉起止端及其分支，切除股动脉。
, http://www.100md.com
2.分组及给药(表1)：低分子肝素(LMWH)由杭州赛诺菲民生制药有限公司提供；aFGF由牛脑中分离纯化(自备)。
表1 动物分组及给药 分 组
用 药
盐水组
生理盐水100 ml
LMWH组
生理盐水100 ml+LWMH 1 00 ICU
aFGF组
生理盐水100 ml+aFGF 200 μg
aFGF+LMWH组
, http://www.100md.com
生理盐水100 ml+aFGF 200 μg
LWMH 1 00 ICU
术后即刻将各组份药物分别经耳缘静脉输入，1次/隔2天，3次/周，共给药2周。术后第28天行髂动脉造影。处死动物，在髂外动脉与动脉连线的中点内侧2～3 cm处取0.5 cm×1.5 cm×2.0 cm组织块，微波生理盐水固定。
3.观察指标：(1)髂动脉造影：血管造影数字减影，定性观察血管生长情况。(2)血管免疫组化染色及血管计数：平滑肌肌动蛋白单克隆抗体标记血管平滑肌细胞后，光镜下进行血管计数，定量观察血管生长情况。(3)血管平滑肌层厚度测定：使用ZEISS公司的KS400计算机图象分析系统，将各组血管免疫组化病理片进行扫描，图象分析，测定各组横截面积约为25 μm2大小的血管平滑肌肌层的平均厚度。
4.统计学处理：数据用
±s表示，组间比较采用t检验。结 果, 百拇医药
1.髂动脉造影所见：盐水组、LMWH组和aFGF组右下肢剔除血管的近端至远端有少量的侧支血管，三组差别不明显；而aFGF+LMWH组则显示较前三组明显增多的侧支血管。
2.血管免疫组化染色：兔下肢肌组织血管免疫组化染色所见：正常肌组织间隙中小血管极少；LMWH组、aFGF组与盐水组相似：肌组织呈波浪样坏死，肌组织间隙中有少量的稀疏分布的小血管；aFGF+LMWH组肌组织坏死较盐水组减轻，肌组织间隙中有较多的均匀分布的小血管。
3.血管计数：免疫组化病理切片的血管计数(个/视野)显示(图1)：aFGF+LMWH组37.71±7.91分别与盐水组9.14±2.91,P<0.01、LMWH组11.43±3.64,P<0.01及aFGF组9.86±3.29,P<0.01比较，差异极显著；后三组之间比较，无显著性差异(P值均大于0.05)。
, http://www.100md.com
图1 各组血管数的比较(+为与aFGF+LMHP组比较，P<0.01)
4.血管平滑肌厚度的测定(图2)：盐水组血管平滑肌厚度(1.04±0.22)μm分别与aFGF+LMWH组(1.12±0.30)μm,P>0.05、LMWH组(0.95±0.17)μm,P>0.05及aFGF组(1.08±0.28)μm,P>0.05，比较差异无显著性。
图2 各组血管血管平滑肌层的厚度(+为与盐水组比较，P<0.01)
讨 论
aFGF是体内主要的促血管生长因子之一，局部动脉内给药及肌肉注射均显示aFGF具有明显的促血管生成作用[1，2]。据报道，单剂量(3～60 μg)静注125I标记的aFGF，其从血浆中清除的初始半衰期为3～4分钟，随后出现一个缓慢的4～7小时的终末半衰期[3]。因此，要维持aFGF的有效作用时间需要较大的初始剂量。本研究静脉给予低剂量的aFGF(200 μg)后未见明显的促缺血区侧支血管生成作用，可能是由于我们给予的aFGF剂量偏小所致。但当相同剂量的aFGF(200 μg)与LMWH(1 000 ICU)合用时显示出明显的促血管生成作用，表明LMWH具有明显的协同aFGF促缺血区侧支血管生成的作用。其作用机制可能与普通肝素相似，通过以下二方面发挥其协同作用的：(1)通过调节细胞表面aFGF受体的构型而增强aFGF促细胞增殖的活性[4]，由于活性的增加，因此使aFGF促血管生成所需的有效剂量下降。(2)延长aFGF的半衰期：由于aFGF分子结构中缺少半胱氨酸残基，特别是二硫键，因此aFGF对变性条件高度敏感，易被酸和热失活，并容易被体内的蛋白水解酶降解[5]。LMWH与aFGF结合后可能使aFGF分子环化从而稳定了aFGF的三级结构，使aFGF对酸、热及蛋白水解酶等具有抵抗力，从而使其半衰期延长。另外，LMWH进入体内后，主要存在于内皮细胞表面和细胞外基质中，在肝素酶的作用下，不断降解。与LMWH结合的aFGF随着LMWH的降解而逐渐地从细胞外间质中释放出来。因此LMWH在体内又可起到aFGF贮藏器的作用，使aFGF的终末半衰期进一步延长。由于aFGF半衰期的延长，使得aFGF的有效作用时间也随之延长。
, http://www.100md.com
aFGF在体内是否引起血管平滑肌细胞的过度增生，现仍存有争议。本研究结果显示aFGF+LMWH组、aFGF组、LMWH组与盐水组之间血管平滑肌厚度差异均无显著性(P>0.05)。可能与我们给予的aFGF剂量小有关。
国外的研究表明[6]静脉给予碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)9周后，犬红细胞压积和血小板均减少，对犬肺、肝、脾、肾、骨髓等组织未见明显影响。本研究仅在非粥样硬化兔下肢上观察了aFGF及其与LMWH联合应用对缺血区血管生成的影响，未对aFGF及LMWH的副作用进行观察，这方面的工作有待于今后进一步研究。
参 考 文 献
1，Li Qunpu, Allan D, Sniderman FR, et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation, 1993,88:208-215.
, http://www.100md.com
2，Lopez JJ, Edelman ER, Stamler A, et al. Angiogenic potential of perivascularly delivered aFGF in a porcine model of chronic myocardial ischemia. Am J Physiol, 1998,274(3 Pt 2):H930-H936.
3，Hondermarck H, Courty J, Boilly B, et al. Distribution of intravenously administered acidic and basic fibroblast growth factor in the mouse. Experiention, 1990,46:973-974.
4，Johnson DE, Williams LT. Structural and functional diversity in the FGF receptor mutigene family. Adv Cancer Res, 1993,60:1-40.
, 百拇医药
5，Gospodarowcz D, Cheng L. Heparin Protects acidic and basic fibroblast growth factor from inactivation. J Cell Physiol, 1987,128:475.
6，Daisy F, Lazarous MS, Matie S, et al. Effects of chronic Systemic adiministration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart. Circulation, 1995,91:145-153.
(收稿:1999-02-27)
, http://www.100md.com