急性白血病患者MRP、p170与多药耐药关系的分析
作者：赵瑜 于力 楼方定 浦津 王永平 史子江 靳海杰
单位：解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：急性白血病；多药耐药；多药耐药相关蛋白；p糖蛋白
军医进修学院学报000116摘 要：目的：评价p糖蛋白 (p170) 和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)表达与急性白血病患者多药耐药的关系。方法：将急性白血病患者按治疗效果分为初治敏感组、完全缓解组和复发难治组三组，用免疫细胞化学结合流式细胞仪测定p170 和MRP。结果：p170 在各型白血病中完全缓解组均低于初治和复发难治组，MRP在AML中复发难治组明显高于完全缓解组；复发难治组35人中27例有上述两或一种蛋白表达增高，两者均与临床耐药相关。综合分析敏感性、特异性和准确性，以p170和MRP联合评价效果最佳。结论：急性白血病多药耐药的发生是多因素的，p170 和MRP均与之有关。
, 百拇医药
中图号：R733.72 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0048-50
The relationship between MRP, p170 expression and MDR in acute leukemia
ZHAO Yu, YU Li, LOU Fang-ding, PU Jin, WANG Yong-ping, SHI Zi-jiang, JIN Hai-jie
(Hematology Department,PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective：To evaluate the relationship between MRP, p170 expression and MDR in acute leukemia patients.Methods：83 patients were divided into three groups: untreated (A), complete remission (B) and relapsed/refractory (C), detected their MRP and p170 expression by immunocytochemistry and FACS.Results：p170 expression was lower in B group than in A and C groups in AML and ALL, MRP expression in AML was higher in C group than in B group;there were 27 of 35 patients expressed one or two proteins in C group; The combination of p170 and MRP detection turned out to be a more sensitive, speculiar and accurate way in evaluation of MDR. Conclusion：clinical MDR is multifactorial, p170 and MRP are all associatd with it.
, 百拇医药
Key words：acute leukemia; multidrug resistance; multidrug resistance-associated protein; p170▲
白血病患者靠常规化疗难获长期存活，多药耐药(multidrugresistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因。原认为它仅与p170蛋白过度表达有关，但临床用p170难以完全解释MDR现象。现发现MRP蛋白可能也与MDR有关。为探讨它们在急性白血病多药耐药中的作用及相互关系，我们同时检测83例急性白血病患者的p170和MRP，结果报告如下。
1 对象和方法
1.1 对象 83例急性白血病患者为我院1998年7月至1999年2月就诊患者，男63例，女20例，中位年龄34.6岁(12至80岁)。根据FAB协作组的白血病诊断标准，急性淋巴细胞白血病(ALL)30例，急性非淋巴细胞白血病(AML)53例，其中M15例，M212例，M37例，M48例，M517例，M6和嗜碱粒细胞白血病各2例。按治疗效果将患者分为：A初治敏感组(指初治患者经1或2疗程标准化疗获完全缓解，其中AML9例，ALL7例)、B完全缓解组(AML22例，ALL10例)和C复发难治组(AML22例，ALL13例)。18例正常对照为同期在我院就诊的10例正常人和8例良性血液病患者(营养性贫血和原发性血小板减少性紫瘢各2例，缺铁性贫血4例)。
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1.2 检测方法
1.2.1 单个核细胞制备 髂后上棘抽取3ml骨髓，置于肝素抗凝瓶中，加3ml生理盐水，缓慢注入5ml淋巴细胞分离液上层，密度梯度离心(1600r/min)20min，吸取单个核细胞，用生理盐水洗涤2次后弃上清。
1.2.2 p170测定 用直接免疫荧光法。对照和测定管内分别加入1×106细胞，分别加入p170阴性对照(PE标记的鼠抗人IgG)及PE标记的鼠抗人p170单抗(BD公司)20μl，室温避光孵育30min。生理盐水洗涤2次，弃上清后加生理盐水1ml，300目筛网过滤后上机进行流式细胞仪测定，以测定和对照管所测值之差为p170结果。
1.2.3 MRP测定 用间接免疫荧光法。对照和测定管内分别加入1×106细胞，对照管加PBS10μl，测定管加1∶100PBS稀释的鼠抗人MRP单抗(购于北京肿瘤医院)10μl，室温避光孵育30min。生理盐水洗涤后弃上清，分别加入1∶100稀释的羊抗鼠异硫氰酸荧光素(FITC-IgG)(Dako,USA)10μl，室温避光孵育30min，生理盐水洗涤2次，弃上清后加生理盐水1ml，300目筛网过滤后上机进行流式细胞仪测定，以测定和对照管所测值之差为MRP结果。
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1.2.4 流式细胞测定 用FACSCalibur流式仪(美国Becton Dicknso公司)，激光波长488nm，测量数据和图形入计算机分析。
1.3 统计学处理 方差分析和相关分析。
2 结 果
2.1 MRP和p170在正常人中的表达及阳性标准的判定 以对照组18例所测结果的均值+2倍标准差作为阳性标准划定，分别取p170和MRP以大于2%和3%为阳性。18例正常对照两项指标全部阴性。
2.2 MRP和p170在急性白血病患者中的表达
2.2.1 MRP表达 AML的A、B、C三组阳性表达分别为2/9、3/22、13/22，统计学分析提示，A、B组及A、C组间差异无显著性意义，B、C组间差异有显著性意义(P<0.05)。ALL三组阳性表达分别为3/7、2/10、4/13，统计学分析提示，两两组间差异无显著性意义。
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2.2.2 p170表达 AML的A、B、C三组阳性表达分别为2/9、3/22、14/22，ALL三组阳性表达分别为0/7、0/10、5/13，统计学分析提示AML和ALL的A、B组间差异无显著性意义，B、C及A、C组间差异有显著性意义(P<0.05)。
2.3 p170和MRP与临床多耐药关系 在35例复发难治白血病中，AML组22例，其中p170/MRP双阳性8例，p170及MRP单阳性分别为6例和5例，两者全部阴性3例；ALL组13例患者中p170及MRP双阳性1例，p170和MRP单阳性分别为4例和3例，p170、MRP全部阴性5例。而临床非耐药患者(包括完全缓解和初治敏感组患者)48人中只有1例初治AML为双阳性，p170和MRP单阳性分别为4例和10例。统计学分析提示两者之间无相关性，但它们均与临床多药耐药有关。
2.4 p170和MRP作为耐药标准的评价 根据Hiddemann[1]提出的临床耐药标准，将83例患者分为耐药与非耐药组，按Fletcher[2]提出的方法分别计算各自的敏感性(p170/MRP阳性者在临床耐药组所占比例)、特异性(p170/MRP阴性者在临床非耐药组所占比例)和准确性(真阳性和真阴性占总例数的比例)，结果见附表。从表中可以看出：从敏感性、特异性和准确性三方面综合考虑，以p170与MRP联合评价临床耐药优于其中任一单项指标。
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附表 p170和MRP作为耐药标准的评价(%)
敏感性
特异性
准确性
p170
54.3
89.6
73.5
MRP
48.3
79.2
65.1
p170/MRP
, 百拇医药
77.1
72.9
74.4
3 讨 论
MDR即白血病细胞对结构、功能不同的多种化疗药物产生耐药。它是导致白血病化疗失败的主要原因，也是常规化疗难以使白血病获长期缓解的重要障碍。以往的研究表明白血病细胞过度表达p170是MDR的主要表现，并是白血病预后不良的原因之一[3]。但临床研究显示很多复发难治病例始终无p170表达[4]，或仅有与正常人相似的低水平表达，提示MDR尚有其它机制。近年发现另一种190kd的膜表面蛋白MRP在部分无p170过度表达的临床MDR患者中表达增高，提示可能与耐药相关[5]。
目前对MDR的检测主要有基因和蛋白两种水平的检测方法，由于后者具有简单、快速、稳定和花费少、影响因素少等优点，易于推广。我们用流式细胞仪技术同时检测p170和MRP，发现两者在复发难治组均明显高于初治组和完全缓解组，提示它们与临床化疗疗效差有关，即与多药耐药相关。
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p170糖蛋白是由位于7号染色体短臂的多药耐药基因(mdr-1)编码的膜表面糖蛋白，它在ATP存在下起外排泵作用，将细胞内药物泵出细胞外，从而减少细胞内药物浓度，白血病细胞免受化疗药杀伤，临床表现MDR[6]。国内外研究表明，p170是AML预后不良因素之一。我们的研究提示，AML和ALL患者p170表达在复发难治组均明显高于完全缓解组和初治敏感组，说明它与临床多药耐药关系密切，是一种很有意义的预示临床耐药的指标。有部分患者初诊时即表达较高水平p170，且难获首次完全缓解，说明MDR具内在性，可能是由于白血病细胞起源于正常情况下即有p170表达的这一克隆的干细胞。另一部分患者随化疗的进行表达逐渐升高，提示与反复化疗诱导有关，属获得性MDR。对患者经1至6个月随访发现过度表达p170者化疗疗效差，化疗相关死亡率高，说明p170的确是一项独立的预后因素。
MRP是由位于16号染色体的mrp基因编码的膜表面糖蛋白，在许多正常组织中有低水平表达。它是ABC超家族的一员，耐药机制尚未完全明了，可能与p170相似[7]。我们的实验显示，急性白血病初治和完全缓解组均有部分患者MRP过度表达，但与复发难治组相比其值较低。统计学分析显示仅AML复发难治组与完全缓解组间差异有显著性，ALL各组及AML其它两组间差异不明显。从初步结果看，MRP在AML中较ALL更具预测MDR的意义。
, 百拇医药
对35例难治与复发急性白血病分析提示：出现MRP、p170双阳性的患者在复发难治组多于其它两组，说明双阳性者对化疗反应较单阳性者更差。统计分析显示它们均与MDR相关，但两者间无相关性，提示它们与临床多药耐药有关，而耐药机制可能不同。35例中有8人为MRP和p170全部阴性，但临床显示明显MDR，说明这部分患者的MDR不能以MRP和(或)p170过度表达解释，可能与其它原因有关[8]，提示临床多药耐药机制的复杂性，有待进一步深入研究。■
基金项目：“九五”军队医药卫生科研基金项目(96Z023)；
作者简介：赵瑜，女，1968-01-19生，北京市人，汉族，1992年第四军医大学毕业，1999年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院血液科主治医师；发表文章3篇。电话：(010)937221
参考文献：
, http://www.100md.com [1]Hiddemann W, Buchner T. Treatment strategy in acute myloid leukemia (AML) [J].Blut, 1990,60:163-171.
[2]Fletcher RH. 临床流行病学 [M].上海：上海翻译出版公司，1987.45-50.
[3]Noonan K, Beck C, Holzmayer T. Quantitative analysis of MDR-1 gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:7160-7164.
[4]杨仁池，杨纯正，郝玉书等.多药耐药相关蛋白基因研究进展[J].中华血液学杂志，1995，16：381-383.
, 百拇医药
[5]Grant CE, Valdimarsson G, Hipfner DR et al. Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs [J]. Cancer Res, 1994,54:357-361.
[6]Broxterman HJ, Pinedo HM. Energy metabolism in multidrug resistant tumor cells: a review [J]. J Cell Pharmacol, 1991,2:239-247.
[7]Zaman GJR, Flens MJ, van Leusden MR et al. The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:8822-8826.
[8]Miyashita T, Reed JG. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in human leukemic cell line [J]. Blood, 1993,81:151-157.
收稿日期：1999-06-08
改回日期：1999-07-16, http://www.100md.com
单位：解放军总医院血液科，北京 100853
关键词：急性白血病；多药耐药；多药耐药相关蛋白；p糖蛋白
军医进修学院学报000116摘 要：目的：评价p糖蛋白 (p170) 和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)表达与急性白血病患者多药耐药的关系。方法：将急性白血病患者按治疗效果分为初治敏感组、完全缓解组和复发难治组三组，用免疫细胞化学结合流式细胞仪测定p170 和MRP。结果：p170 在各型白血病中完全缓解组均低于初治和复发难治组，MRP在AML中复发难治组明显高于完全缓解组；复发难治组35人中27例有上述两或一种蛋白表达增高，两者均与临床耐药相关。综合分析敏感性、特异性和准确性，以p170和MRP联合评价效果最佳。结论：急性白血病多药耐药的发生是多因素的，p170 和MRP均与之有关。
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中图号：R733.72 文献标识码：A
文章编号：1005-1139(2000)01-0048-50
The relationship between MRP, p170 expression and MDR in acute leukemia
ZHAO Yu, YU Li, LOU Fang-ding, PU Jin, WANG Yong-ping, SHI Zi-jiang, JIN Hai-jie
(Hematology Department,PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective：To evaluate the relationship between MRP, p170 expression and MDR in acute leukemia patients.Methods：83 patients were divided into three groups: untreated (A), complete remission (B) and relapsed/refractory (C), detected their MRP and p170 expression by immunocytochemistry and FACS.Results：p170 expression was lower in B group than in A and C groups in AML and ALL, MRP expression in AML was higher in C group than in B group;there were 27 of 35 patients expressed one or two proteins in C group; The combination of p170 and MRP detection turned out to be a more sensitive, speculiar and accurate way in evaluation of MDR. Conclusion：clinical MDR is multifactorial, p170 and MRP are all associatd with it.
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Key words：acute leukemia; multidrug resistance; multidrug resistance-associated protein; p170▲
白血病患者靠常规化疗难获长期存活，多药耐药(multidrugresistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因。原认为它仅与p170蛋白过度表达有关，但临床用p170难以完全解释MDR现象。现发现MRP蛋白可能也与MDR有关。为探讨它们在急性白血病多药耐药中的作用及相互关系，我们同时检测83例急性白血病患者的p170和MRP，结果报告如下。
1 对象和方法
1.1 对象 83例急性白血病患者为我院1998年7月至1999年2月就诊患者，男63例，女20例，中位年龄34.6岁(12至80岁)。根据FAB协作组的白血病诊断标准，急性淋巴细胞白血病(ALL)30例，急性非淋巴细胞白血病(AML)53例，其中M15例，M212例，M37例，M48例，M517例，M6和嗜碱粒细胞白血病各2例。按治疗效果将患者分为：A初治敏感组(指初治患者经1或2疗程标准化疗获完全缓解，其中AML9例，ALL7例)、B完全缓解组(AML22例，ALL10例)和C复发难治组(AML22例，ALL13例)。18例正常对照为同期在我院就诊的10例正常人和8例良性血液病患者(营养性贫血和原发性血小板减少性紫瘢各2例，缺铁性贫血4例)。
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1.2 检测方法
1.2.1 单个核细胞制备 髂后上棘抽取3ml骨髓，置于肝素抗凝瓶中，加3ml生理盐水，缓慢注入5ml淋巴细胞分离液上层，密度梯度离心(1600r/min)20min，吸取单个核细胞，用生理盐水洗涤2次后弃上清。
1.2.2 p170测定 用直接免疫荧光法。对照和测定管内分别加入1×106细胞，分别加入p170阴性对照(PE标记的鼠抗人IgG)及PE标记的鼠抗人p170单抗(BD公司)20μl，室温避光孵育30min。生理盐水洗涤2次，弃上清后加生理盐水1ml，300目筛网过滤后上机进行流式细胞仪测定，以测定和对照管所测值之差为p170结果。
1.2.3 MRP测定 用间接免疫荧光法。对照和测定管内分别加入1×106细胞，对照管加PBS10μl，测定管加1∶100PBS稀释的鼠抗人MRP单抗(购于北京肿瘤医院)10μl，室温避光孵育30min。生理盐水洗涤后弃上清，分别加入1∶100稀释的羊抗鼠异硫氰酸荧光素(FITC-IgG)(Dako,USA)10μl，室温避光孵育30min，生理盐水洗涤2次，弃上清后加生理盐水1ml，300目筛网过滤后上机进行流式细胞仪测定，以测定和对照管所测值之差为MRP结果。
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1.2.4 流式细胞测定 用FACSCalibur流式仪(美国Becton Dicknso公司)，激光波长488nm，测量数据和图形入计算机分析。
1.3 统计学处理 方差分析和相关分析。
2 结 果
2.1 MRP和p170在正常人中的表达及阳性标准的判定 以对照组18例所测结果的均值+2倍标准差作为阳性标准划定，分别取p170和MRP以大于2%和3%为阳性。18例正常对照两项指标全部阴性。
2.2 MRP和p170在急性白血病患者中的表达
2.2.1 MRP表达 AML的A、B、C三组阳性表达分别为2/9、3/22、13/22，统计学分析提示，A、B组及A、C组间差异无显著性意义，B、C组间差异有显著性意义(P<0.05)。ALL三组阳性表达分别为3/7、2/10、4/13，统计学分析提示，两两组间差异无显著性意义。
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2.2.2 p170表达 AML的A、B、C三组阳性表达分别为2/9、3/22、14/22，ALL三组阳性表达分别为0/7、0/10、5/13，统计学分析提示AML和ALL的A、B组间差异无显著性意义，B、C及A、C组间差异有显著性意义(P<0.05)。
2.3 p170和MRP与临床多耐药关系 在35例复发难治白血病中，AML组22例，其中p170/MRP双阳性8例，p170及MRP单阳性分别为6例和5例，两者全部阴性3例；ALL组13例患者中p170及MRP双阳性1例，p170和MRP单阳性分别为4例和3例，p170、MRP全部阴性5例。而临床非耐药患者(包括完全缓解和初治敏感组患者)48人中只有1例初治AML为双阳性，p170和MRP单阳性分别为4例和10例。统计学分析提示两者之间无相关性，但它们均与临床多药耐药有关。
2.4 p170和MRP作为耐药标准的评价 根据Hiddemann[1]提出的临床耐药标准，将83例患者分为耐药与非耐药组，按Fletcher[2]提出的方法分别计算各自的敏感性(p170/MRP阳性者在临床耐药组所占比例)、特异性(p170/MRP阴性者在临床非耐药组所占比例)和准确性(真阳性和真阴性占总例数的比例)，结果见附表。从表中可以看出：从敏感性、特异性和准确性三方面综合考虑，以p170与MRP联合评价临床耐药优于其中任一单项指标。
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附表 p170和MRP作为耐药标准的评价(%)
敏感性
特异性
准确性
p170
54.3
89.6
73.5
MRP
48.3
79.2
65.1
p170/MRP
, 百拇医药
77.1
72.9
74.4
3 讨 论
MDR即白血病细胞对结构、功能不同的多种化疗药物产生耐药。它是导致白血病化疗失败的主要原因，也是常规化疗难以使白血病获长期缓解的重要障碍。以往的研究表明白血病细胞过度表达p170是MDR的主要表现，并是白血病预后不良的原因之一[3]。但临床研究显示很多复发难治病例始终无p170表达[4]，或仅有与正常人相似的低水平表达，提示MDR尚有其它机制。近年发现另一种190kd的膜表面蛋白MRP在部分无p170过度表达的临床MDR患者中表达增高，提示可能与耐药相关[5]。
目前对MDR的检测主要有基因和蛋白两种水平的检测方法，由于后者具有简单、快速、稳定和花费少、影响因素少等优点，易于推广。我们用流式细胞仪技术同时检测p170和MRP，发现两者在复发难治组均明显高于初治组和完全缓解组，提示它们与临床化疗疗效差有关，即与多药耐药相关。
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p170糖蛋白是由位于7号染色体短臂的多药耐药基因(mdr-1)编码的膜表面糖蛋白，它在ATP存在下起外排泵作用，将细胞内药物泵出细胞外，从而减少细胞内药物浓度，白血病细胞免受化疗药杀伤，临床表现MDR[6]。国内外研究表明，p170是AML预后不良因素之一。我们的研究提示，AML和ALL患者p170表达在复发难治组均明显高于完全缓解组和初治敏感组，说明它与临床多药耐药关系密切，是一种很有意义的预示临床耐药的指标。有部分患者初诊时即表达较高水平p170，且难获首次完全缓解，说明MDR具内在性，可能是由于白血病细胞起源于正常情况下即有p170表达的这一克隆的干细胞。另一部分患者随化疗的进行表达逐渐升高，提示与反复化疗诱导有关，属获得性MDR。对患者经1至6个月随访发现过度表达p170者化疗疗效差，化疗相关死亡率高，说明p170的确是一项独立的预后因素。
MRP是由位于16号染色体的mrp基因编码的膜表面糖蛋白，在许多正常组织中有低水平表达。它是ABC超家族的一员，耐药机制尚未完全明了，可能与p170相似[7]。我们的实验显示，急性白血病初治和完全缓解组均有部分患者MRP过度表达，但与复发难治组相比其值较低。统计学分析显示仅AML复发难治组与完全缓解组间差异有显著性，ALL各组及AML其它两组间差异不明显。从初步结果看，MRP在AML中较ALL更具预测MDR的意义。
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对35例难治与复发急性白血病分析提示：出现MRP、p170双阳性的患者在复发难治组多于其它两组，说明双阳性者对化疗反应较单阳性者更差。统计分析显示它们均与MDR相关，但两者间无相关性，提示它们与临床多药耐药有关，而耐药机制可能不同。35例中有8人为MRP和p170全部阴性，但临床显示明显MDR，说明这部分患者的MDR不能以MRP和(或)p170过度表达解释，可能与其它原因有关[8]，提示临床多药耐药机制的复杂性，有待进一步深入研究。■
基金项目：“九五”军队医药卫生科研基金项目(96Z023)；
作者简介：赵瑜，女，1968-01-19生，北京市人，汉族，1992年第四军医大学毕业，1999年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院血液科主治医师；发表文章3篇。电话：(010)937221
参考文献：
, http://www.100md.com [1]Hiddemann W, Buchner T. Treatment strategy in acute myloid leukemia (AML) [J].Blut, 1990,60:163-171.
[2]Fletcher RH. 临床流行病学 [M].上海：上海翻译出版公司，1987.45-50.
[3]Noonan K, Beck C, Holzmayer T. Quantitative analysis of MDR-1 gene expression in human tumors by polymerase chain reaction [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:7160-7164.
[4]杨仁池，杨纯正，郝玉书等.多药耐药相关蛋白基因研究进展[J].中华血液学杂志，1995，16：381-383.
, 百拇医药
[5]Grant CE, Valdimarsson G, Hipfner DR et al. Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs [J]. Cancer Res, 1994,54:357-361.
[6]Broxterman HJ, Pinedo HM. Energy metabolism in multidrug resistant tumor cells: a review [J]. J Cell Pharmacol, 1991,2:239-247.
[7]Zaman GJR, Flens MJ, van Leusden MR et al. The human multidrug resistance-associated protein MRP is a plasma membrane drug-efflux pump [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91:8822-8826.
[8]Miyashita T, Reed JG. Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in human leukemic cell line [J]. Blood, 1993,81:151-157.
收稿日期：1999-06-08
改回日期：1999-07-16, http://www.100md.com