碱性成纤维细胞生长因子及成纤维细胞生长因子受体在豚鼠前庭中的定位和表达
作者：熊敏 姜泗长 顾瑞 杨伟炎 翟所强 张素珍
单位：熊敏(解放军总医院耳鼻咽喉科博士研究生(广州军区总医院耳鼻咽喉科，广州 510010)；姜泗长 顾瑞 杨伟炎 翟所强 张素珍(解放军总医院耳鼻咽喉科，北京 100853)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；成纤维细胞生长因子受体；前庭终器；免疫组织化学
军医进修学院学报000106 摘 要：目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及成纤维细胞生长因子受体(FGFR)在豚鼠前庭终器的定位和表达。方法：免疫组织化学。结果：bFGF位于支持细胞和毛细胞的胞浆及胞核，FGFR位于支持细胞表面。bFGF及FGFR在成年豚鼠表达较弱，新生豚鼠及庆大霉素内耳损伤豚鼠表达较强。结论：提示bFGF在豚鼠前庭终器发育、结构功能维持及损害后修复中起重要作用。
中图号：R392 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1005-1139(2000)01-0017-19▲
Location and expression of basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor receptor on vestibular organs of guinea pigs
XIONG Min,(Department of Otolaryngology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
JIANG Si-chang,GU Rui,YANG Wei-yan,ZHAI Suo-qiang,ZHANG Shu-zhen
Abstract：Objective：To examine the location and expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and fibroblast growth factor receptor (FGFR) on vestibular organs of guinea pigs.Methods：Immunohistochemistry. Results：bFGF was in the plasma and nuclear of supporting and hair cells; FGFR was on the surface of supporting cells. Weak bFGF and FGFR immunoreactivity was detectable in normal adults. Strong bFGF and FGFR immunoreactivity was detectable in the neonatal and adults whose inner ears were destroyed by gentamicin.Conclusion：bFGF may have a role in the development of vestibular organs and in maintenance of the integrity of structure and function of vestibular organs, and in protection and repair processes following damage to the vestibular organs.
, 百拇医药
Key words：basic fibroblast growth factor; fibroblast growth factor receptor; vestibular organs; immunohistochemistry▲
许多研究表明成纤维细胞生长因子(fibro-blast growth factor, FGF)在耳蜗发育、结构功能维持、损伤修复过程中起重要作用。但FGF在前庭中的生物学作用尚少有研究，为进一步探讨FGF在前庭中的生物学作用，本研究对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)在豚鼠前庭中的定位和表达进行观察。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
, 百拇医药
1.1.1 实验动物 健康白色红目豚鼠，雌雄兼用，耳廓反射灵敏，鼓膜正常。
1.1.2 动物分组 实验共分三组。第一组(A组)为出生后1d的新生豚鼠6只，体重70g 左右；第二组(B组)为成年豚鼠6只，体重250g 左右；第三组选用成年豚鼠18只，每天皮下注射庆大霉素 150 mg/kg，连续10d，以造成耳毒性内耳损害。第二、三组动物入选前均以脑干听诱发电位及正弦摆动前庭性眼震进行听及前庭功能测试，正常者入选。第三组以庆大霉素造模后均进行听及前庭功能测试，以确实内耳损伤模型造成。
1.2 取材及标本处理 第三组动物分三批处死，即第一批(C组)于连续注射庆大霉素10d 后处死；第二批(D组)、第三批(E组)则分别于停用庆大霉素后10d、20d 处死。所有动物均活杀，迅速取下听泡，置于4℃4%多聚甲醛溶液中。在解剖显微镜下摘除镫骨，挑开圆窗膜，于耳蜗尖端钻一小孔，将溶液缓缓灌入耳蜗内。于4%多聚甲醛室温下固定24h后，以10% EDTA脱钙。新生豚鼠脱钙1周，成年豚鼠脱钙4周。脱钙完全后，脱水、石腊包埋、切片，每片厚度为7μm。
, 百拇医药
1.3 免疫组化 第一抗体(鼠抗bFGF和FGFR)稀释效价为1∶96，加一抗后，切片置于湿盒内4℃ 冰箱过夜，阴性对照不加一抗，加正常羊血清。加入二抗(SP-9000 生物素化标记兔抗鼠IgG)，稀释效价为1∶148，置于37℃ 温盒内30min。加三抗(辣根过氧化酶标记的链球菌卵白素)，稀释效价为1∶148，置于37℃湿盒内30min。每次加抗体前均以PBS液振荡漂洗5min，3次。最后用DAB法室温下显色10min[1]。所有试剂均由北京中山生物试剂公司提供。经裱片、脱水、透明及树胶封片后，以光学显微镜观察。
2 结 果
前庭终器bFGF及FGFR阳性者呈棕黄色。bFGF主要存在于前庭终器感觉毛细胞及支持细胞胞浆及胞核中，尤以胞核染色较深。FGFR主要存在于支持细胞表面。以前庭终器bFGF及FGFR阳性者的染色深浅，将bFGF及FGFR表达分为四级。新生豚鼠椭圆囊、球囊、半规管壶腹嵴bFGF及FGFR呈强阳性(
)。成年豚鼠椭圆囊、球囊、半规管壶腹嵴bFGF及FGFR均呈弱阳性(+)。成年豚鼠皮下注射庆大霉素连续10d，其椭圆囊、球囊及半规管壶腹嵴bFGF及FGFR均呈阳性(
)。停药 10 d 后，前庭终器bFGF及FGFR呈强阳性()。停药 20 d 后，前庭终器bFGF及FGFR仍呈阳性(，附表)。
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附表 豚鼠前庭终器bFGF及FGFR表达 组别
椭圆囊
球 囊
壶腹嵴
bFGF
FGFR
bFGF
FGFR
bFGF
FGFR
A
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B
+
+
+
+
+
+
C
, 百拇医药
D
E
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注：A.新生；B.成年；C.注射庆大霉素10d；D.停用庆大霉素10d；E.停用庆大霉素20d
3 讨 论
本实验应用免疫组化方法对bFGF及FGFR在豚鼠前庭终器定位和表达进行了观察，尚未查及文献报道。结果表明：bFGF主要位于毛细胞及支持细胞胞胞浆及胞核，FGFR则主要位于支持细胞表面。新生豚鼠bFGF及FGFR表达最强()，至成年时表达减弱(+)。庆大霉素造成内耳损害后前庭终器bFGF及FGFR表达增强()，停用庆大霉素10d后bFGF及FGFR表达至新生豚鼠水平()，20d 后表达下降()，bFGF与FGFR变化呈同步性。
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bFGF在前庭终器发育中的作用。鼠在出生后第1天椭圆囊斑、球囊斑及壶腹嵴才发育分化成熟[2]。新生豚鼠前庭终器尚处于发育状态，而此时bFGF表达较强，提示bFGF在前庭终器发育中起着较为重要的作用。目前尚未查及文献阐明bFGF对前庭发育的影响，如能造成bFGF基因缺失的动物模型，观察bFGF基因缺失动物前庭发育，则可获得bFGF对前庭发育影响的直接证据。Hossain等[3]观察到bFGF能促进鸡胚耳蜗前庭神经节的发育。Zhou等[4]证实bFGF能促进鸡胚听及前庭中枢神经原的发育。这为推测bFGF能促进前庭终器发育提供了辅证。
成年豚鼠前庭终器亦有bFGF及FGFR表达。bFGF-FGFR系统可能在维持前庭终器结构的完整性及功能上起着重要作用。bFGF由前庭神经节合成，沿神经纤维传入前庭终器，主要存于毛细胞胞浆及胞核，以自分泌或旁分泌形式起作用。在正常前庭终器，bFGF对支持细胞功能维持起着重要作用，而支持细胞对邻近毛细胞不仅起着支架作用，且为其代谢营养提供保证。bFGF通过无髓鞘处神经末梢释放于前庭终器细胞外间隙，在正常状态下，以这种方式释放的bFGF量可足以维持前庭终器正常功能。由于bFGF缺乏信号序列，bFGF的分泌可能存在着一种尚不清楚的机制。细胞损伤是bFGF释放的一种确实途径。在有些组织如主动脉内皮与肌肉机械性应激可以引起原生质膜的瞬间破裂。体外实验证实机械性创伤可以诱导bFGF的释放[5]。耳毒性抗生素破坏了神经质膜的完整性，从而引起bFGF释放。bFGF与FGFR变化呈同步性提示FGFR表达是由于bFGF表达增高及释放所引起。庆大霉素引起前庭毛细胞损伤后，bFGF合成增加，表达增强，此时FGFR水平也相应上调。停用庆大霉素10d 左右，毛细胞的破坏最为严重，此时大量bFGF由破坏的毛细胞释放，因而在停用庆大霉素10d组豚鼠bFGF及FGFR均为强阳性()。此后，由于毛细胞坏死，bFGF表达减少，所以停用庆大霉素20d 组豚鼠bFGF及FGFR的表达下降，但仍为阳性()。FGFR主要位于支持细胞表面，在损害的前庭终器支持细胞是通过瘢痕形成及毛细胞再生两种方式而起修复作用[6，7]，bFGF与FGFR结合后支持细胞内部发生磷酸化，促使支持细胞增殖及向新生毛细胞转化，从而使损害的前庭终器修复。
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总之，在豚鼠前庭终器中存在bFGF及FGFR表达。通过观察bFGF-FGFR在新生豚鼠、成年豚鼠及庆大霉素内耳损伤豚鼠前庭中的表达变化，推测bFGF-FGFR系统在前庭终器发育、结构及功能维持、损害后修复再生等方面起着重要作用。■
作者简介：熊敏，男，1967-08-11生，湖北省通山县人，汉族，1989年第三军医大学毕业， 1998 年军医进修学院博士毕业，广州军区总医院耳鼻喉科主治医师；发表论文3篇。电话：(020)86662205-53513
参考文献：
[1]Depres C, Jalenques I, Romand R. Basic FGF-like protein in the lower stato-acoustic system of the neonatal and adult rat [J]. Neurorep, 1991,2:639-643.
, 百拇医药
[2]Sher AE. The embryonic postnatal development of the inner ear of mouse [J]. Acta Otolaryngol, 1971,(Suppl 285):1-5.
[3]Hossain WA, Zhou X, Rutledge A. Basic fibroblast growth factor affects neuronal migration and differentiation in normotypic cell cultures from the cochleovestibular ganglion of the chick embryo [J].Experimental Neurology, 1996,138:121-125.
[4]Zhou X, Hossain WA, Rutledge A. Basic fibroblast growth factor (FGF-2) affects development of acoustico-vestibular neurons in the chick embryo brain in vitro [J]. Hearing Res, 1996,93:147-151.
, http://www.100md.com
[5]Adamis AP, Meklir B, Joyce NC. In situ injury induced release of basic fibroblast growth factor from corneal epithelial cells[J].Am J Pathol, 1991,139:961-965.
[6]Meiteles LZ, Rapheal Y. Scar formation in the vestibular sensory epithelium after aminoglycoside toxicity [J]. Hearing Res, 1994,79:26-29.
[7]Rapheal Y. Evidence for supporting cell mitosis in response to acoustic trauma in the avian inner ear [J]. J Neurocytol, 1992,21:663-665.
收稿日期：1999-07-06
改回日期：1999-08-15, 百拇医药
单位：熊敏(解放军总医院耳鼻咽喉科博士研究生(广州军区总医院耳鼻咽喉科，广州 510010)；姜泗长 顾瑞 杨伟炎 翟所强 张素珍(解放军总医院耳鼻咽喉科，北京 100853)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；成纤维细胞生长因子受体；前庭终器；免疫组织化学
军医进修学院学报000106 摘 要：目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及成纤维细胞生长因子受体(FGFR)在豚鼠前庭终器的定位和表达。方法：免疫组织化学。结果：bFGF位于支持细胞和毛细胞的胞浆及胞核，FGFR位于支持细胞表面。bFGF及FGFR在成年豚鼠表达较弱，新生豚鼠及庆大霉素内耳损伤豚鼠表达较强。结论：提示bFGF在豚鼠前庭终器发育、结构功能维持及损害后修复中起重要作用。
中图号：R392 文献标识码：A
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文章编号：1005-1139(2000)01-0017-19▲
Location and expression of basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor receptor on vestibular organs of guinea pigs
XIONG Min,(Department of Otolaryngology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
JIANG Si-chang,GU Rui,YANG Wei-yan,ZHAI Suo-qiang,ZHANG Shu-zhen
Abstract：Objective：To examine the location and expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and fibroblast growth factor receptor (FGFR) on vestibular organs of guinea pigs.Methods：Immunohistochemistry. Results：bFGF was in the plasma and nuclear of supporting and hair cells; FGFR was on the surface of supporting cells. Weak bFGF and FGFR immunoreactivity was detectable in normal adults. Strong bFGF and FGFR immunoreactivity was detectable in the neonatal and adults whose inner ears were destroyed by gentamicin.Conclusion：bFGF may have a role in the development of vestibular organs and in maintenance of the integrity of structure and function of vestibular organs, and in protection and repair processes following damage to the vestibular organs.
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Key words：basic fibroblast growth factor; fibroblast growth factor receptor; vestibular organs; immunohistochemistry▲
许多研究表明成纤维细胞生长因子(fibro-blast growth factor, FGF)在耳蜗发育、结构功能维持、损伤修复过程中起重要作用。但FGF在前庭中的生物学作用尚少有研究，为进一步探讨FGF在前庭中的生物学作用，本研究对碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)在豚鼠前庭中的定位和表达进行观察。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
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1.1.1 实验动物 健康白色红目豚鼠，雌雄兼用，耳廓反射灵敏，鼓膜正常。
1.1.2 动物分组 实验共分三组。第一组(A组)为出生后1d的新生豚鼠6只，体重70g 左右；第二组(B组)为成年豚鼠6只，体重250g 左右；第三组选用成年豚鼠18只，每天皮下注射庆大霉素 150 mg/kg，连续10d，以造成耳毒性内耳损害。第二、三组动物入选前均以脑干听诱发电位及正弦摆动前庭性眼震进行听及前庭功能测试，正常者入选。第三组以庆大霉素造模后均进行听及前庭功能测试，以确实内耳损伤模型造成。
1.2 取材及标本处理 第三组动物分三批处死，即第一批(C组)于连续注射庆大霉素10d 后处死；第二批(D组)、第三批(E组)则分别于停用庆大霉素后10d、20d 处死。所有动物均活杀，迅速取下听泡，置于4℃4%多聚甲醛溶液中。在解剖显微镜下摘除镫骨，挑开圆窗膜，于耳蜗尖端钻一小孔，将溶液缓缓灌入耳蜗内。于4%多聚甲醛室温下固定24h后，以10% EDTA脱钙。新生豚鼠脱钙1周，成年豚鼠脱钙4周。脱钙完全后，脱水、石腊包埋、切片，每片厚度为7μm。
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1.3 免疫组化 第一抗体(鼠抗bFGF和FGFR)稀释效价为1∶96，加一抗后，切片置于湿盒内4℃ 冰箱过夜，阴性对照不加一抗，加正常羊血清。加入二抗(SP-9000 生物素化标记兔抗鼠IgG)，稀释效价为1∶148，置于37℃ 温盒内30min。加三抗(辣根过氧化酶标记的链球菌卵白素)，稀释效价为1∶148，置于37℃湿盒内30min。每次加抗体前均以PBS液振荡漂洗5min，3次。最后用DAB法室温下显色10min[1]。所有试剂均由北京中山生物试剂公司提供。经裱片、脱水、透明及树胶封片后，以光学显微镜观察。
2 结 果
前庭终器bFGF及FGFR阳性者呈棕黄色。bFGF主要存在于前庭终器感觉毛细胞及支持细胞胞浆及胞核中，尤以胞核染色较深。FGFR主要存在于支持细胞表面。以前庭终器bFGF及FGFR阳性者的染色深浅，将bFGF及FGFR表达分为四级。新生豚鼠椭圆囊、球囊、半规管壶腹嵴bFGF及FGFR呈强阳性(
)。成年豚鼠椭圆囊、球囊、半规管壶腹嵴bFGF及FGFR均呈弱阳性(+)。成年豚鼠皮下注射庆大霉素连续10d，其椭圆囊、球囊及半规管壶腹嵴bFGF及FGFR均呈阳性()。停药 10 d 后，前庭终器bFGF及FGFR呈强阳性()。停药 20 d 后，前庭终器bFGF及FGFR仍呈阳性(，附表)。, 百拇医药
附表 豚鼠前庭终器bFGF及FGFR表达 组别
椭圆囊
球 囊
壶腹嵴
bFGF
FGFR
bFGF
FGFR
bFGF
FGFR
A
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B
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C
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D
E
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注：A.新生；B.成年；C.注射庆大霉素10d；D.停用庆大霉素10d；E.停用庆大霉素20d
3 讨 论
本实验应用免疫组化方法对bFGF及FGFR在豚鼠前庭终器定位和表达进行了观察，尚未查及文献报道。结果表明：bFGF主要位于毛细胞及支持细胞胞胞浆及胞核，FGFR则主要位于支持细胞表面。新生豚鼠bFGF及FGFR表达最强(
)，至成年时表达减弱(+)。庆大霉素造成内耳损害后前庭终器bFGF及FGFR表达增强()，停用庆大霉素10d后bFGF及FGFR表达至新生豚鼠水平()，20d 后表达下降()，bFGF与FGFR变化呈同步性。, 百拇医药
bFGF在前庭终器发育中的作用。鼠在出生后第1天椭圆囊斑、球囊斑及壶腹嵴才发育分化成熟[2]。新生豚鼠前庭终器尚处于发育状态，而此时bFGF表达较强，提示bFGF在前庭终器发育中起着较为重要的作用。目前尚未查及文献阐明bFGF对前庭发育的影响，如能造成bFGF基因缺失的动物模型，观察bFGF基因缺失动物前庭发育，则可获得bFGF对前庭发育影响的直接证据。Hossain等[3]观察到bFGF能促进鸡胚耳蜗前庭神经节的发育。Zhou等[4]证实bFGF能促进鸡胚听及前庭中枢神经原的发育。这为推测bFGF能促进前庭终器发育提供了辅证。
成年豚鼠前庭终器亦有bFGF及FGFR表达。bFGF-FGFR系统可能在维持前庭终器结构的完整性及功能上起着重要作用。bFGF由前庭神经节合成，沿神经纤维传入前庭终器，主要存于毛细胞胞浆及胞核，以自分泌或旁分泌形式起作用。在正常前庭终器，bFGF对支持细胞功能维持起着重要作用，而支持细胞对邻近毛细胞不仅起着支架作用，且为其代谢营养提供保证。bFGF通过无髓鞘处神经末梢释放于前庭终器细胞外间隙，在正常状态下，以这种方式释放的bFGF量可足以维持前庭终器正常功能。由于bFGF缺乏信号序列，bFGF的分泌可能存在着一种尚不清楚的机制。细胞损伤是bFGF释放的一种确实途径。在有些组织如主动脉内皮与肌肉机械性应激可以引起原生质膜的瞬间破裂。体外实验证实机械性创伤可以诱导bFGF的释放[5]。耳毒性抗生素破坏了神经质膜的完整性，从而引起bFGF释放。bFGF与FGFR变化呈同步性提示FGFR表达是由于bFGF表达增高及释放所引起。庆大霉素引起前庭毛细胞损伤后，bFGF合成增加，表达增强，此时FGFR水平也相应上调。停用庆大霉素10d 左右，毛细胞的破坏最为严重，此时大量bFGF由破坏的毛细胞释放，因而在停用庆大霉素10d组豚鼠bFGF及FGFR均为强阳性(
)。此后，由于毛细胞坏死，bFGF表达减少，所以停用庆大霉素20d 组豚鼠bFGF及FGFR的表达下降，但仍为阳性()。FGFR主要位于支持细胞表面，在损害的前庭终器支持细胞是通过瘢痕形成及毛细胞再生两种方式而起修复作用[6，7]，bFGF与FGFR结合后支持细胞内部发生磷酸化，促使支持细胞增殖及向新生毛细胞转化，从而使损害的前庭终器修复。, http://www.100md.com
总之，在豚鼠前庭终器中存在bFGF及FGFR表达。通过观察bFGF-FGFR在新生豚鼠、成年豚鼠及庆大霉素内耳损伤豚鼠前庭中的表达变化，推测bFGF-FGFR系统在前庭终器发育、结构及功能维持、损害后修复再生等方面起着重要作用。■
作者简介：熊敏，男，1967-08-11生，湖北省通山县人，汉族，1989年第三军医大学毕业， 1998 年军医进修学院博士毕业，广州军区总医院耳鼻喉科主治医师；发表论文3篇。电话：(020)86662205-53513
参考文献：
[1]Depres C, Jalenques I, Romand R. Basic FGF-like protein in the lower stato-acoustic system of the neonatal and adult rat [J]. Neurorep, 1991,2:639-643.
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[2]Sher AE. The embryonic postnatal development of the inner ear of mouse [J]. Acta Otolaryngol, 1971,(Suppl 285):1-5.
[3]Hossain WA, Zhou X, Rutledge A. Basic fibroblast growth factor affects neuronal migration and differentiation in normotypic cell cultures from the cochleovestibular ganglion of the chick embryo [J].Experimental Neurology, 1996,138:121-125.
[4]Zhou X, Hossain WA, Rutledge A. Basic fibroblast growth factor (FGF-2) affects development of acoustico-vestibular neurons in the chick embryo brain in vitro [J]. Hearing Res, 1996,93:147-151.
, http://www.100md.com
[5]Adamis AP, Meklir B, Joyce NC. In situ injury induced release of basic fibroblast growth factor from corneal epithelial cells[J].Am J Pathol, 1991,139:961-965.
[6]Meiteles LZ, Rapheal Y. Scar formation in the vestibular sensory epithelium after aminoglycoside toxicity [J]. Hearing Res, 1994,79:26-29.
[7]Rapheal Y. Evidence for supporting cell mitosis in response to acoustic trauma in the avian inner ear [J]. J Neurocytol, 1992,21:663-665.
收稿日期：1999-07-06
改回日期：1999-08-15, 百拇医药