脑出血患者血肿周围星形细胞内皮素-1 表达免疫组化研究
作者：黄勇华 张微微 郝小淑 周进和 史晓东 Margaretta Bjoeling
单位：黄勇华 张微微 郝小淑 周进和 史晓东(北京军区总医院神经内科，北京 100700；)；Margaretta Bjoeling(瑞典Uppsala大学病理研究所)
关键词：脑出血；星形细胞；内皮素-1；免疫组织化学
军医进修学院学报000102摘 要：目的：探讨内皮素-1 与星形细胞之间相互关系及其在脑出血的作用。方法：采用内皮素-1抗体SP免疫组化技术对脑出血患者尸检材料血肿周围脑组织反应性星形细胞内皮素-1 表达水平进行检测。结果：发现脑出血组反应性星形细胞增生、肥大变性，存在内皮素-1 的表达，而对照组星形细胞形态基本正常，偶见阳性。结论：内皮素-1 及反应性星形细胞可能参与脑出血的病理机制。
中图号：R743.34 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1005-1139-(2000)01-0005-07
A study of endothelin-1 expression in reactive astrocytes surrounding the hematoma in cerebral hemorrhage
Huang Yong-hua, ZHANG Wei-wei, HAO Xiao-shu,(Department of Neurology, Beijing Army General Hospital,Beijing 100700,China)
ZHOU Jin-he,SHI Xiao-dong,Margaretta Bjoeling
Abstract：Objective：To investigate the expression of endothelin-1 in astrocytes in the human brain with cerebral hemorrhage.Methods：The SP immunohistochemical method and a polyclonal antiserum were used. Autopsy material was obtained from 8 cases of cerebral hemorrhage,5 cases without brain diseases. Results：Endothelin-1 was expressed in numerous reactive astrocytes in the human brain surrounding the hematoma. But this occurred in only exceptional astrocytes of controls. Conclusion：The results suggest that endothelin-1 might play an essential role in the pathogenesis of edema formation and ischemia injury after cerebral hemorrhage.
, 百拇医药
Key words：cerebral hemorrhage; astrocyte; endothelin-1； immunohistochemistry▲
许多研究已证实脑出血后在出血灶周围存在水肿和继发性缺血损伤的区域[1]。近年来的研究发现，胶质细胞在脑缺血后异常活跃。缺血性脑损伤所激发的星形细胞和小胶质细胞反应极其复杂，已远远超出了对神经元的营养支持和清除变性坏死组织的作用范围。内皮素-1 目前仍被认为是血管收缩作用最强的生物肽[2]，同时它还有多种生物效应，其与脑血管疾病的关系日益受到人们重视。本实验旨在探讨皮素-1、星形细胞之间的相互关系及其在脑出血继发性脑损伤的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 全部标本来源于死后1/2～2d的尸体材料。8例脑出血患者，男性5例，女性3例，年龄45～87岁，平均(64±13.02)岁。出血后24h死亡者1例，24～72h死亡者3例，>72h者4例。从发病到死亡均为5d之内。全部病例根据临床表现、脑CT检查和尸检病理学诊断。其中丘脑出血2例，豆状核出血4例，小脑半球出血1例，额叶出血1例。对照组5例，男性2例，女性3例，年龄51～79岁，平均(68.4±10.31)岁。既往无神经系统疾病病史。组织取材选择病灶与正常交界区域，对照组相应部位取材。组织经过10%甲醛固定，充分脱水、透明、浸蜡、包埋。包埋过程中石蜡保持在60℃。5μm切片。
, 百拇医药
1.2 方法 采用SP染色法。兔抗体内皮素-1抗体为英国剑桥生物研究所产品。常规脱蜡水化，PBS洗5min，3次，加过氧化物酶阻断液，以阻断内源性过氧化物酶30min。PBS洗5min，3次，加非免疫性羊血清封闭30min。加一抗(1∶4000，1∶6000，1∶8000)4℃过夜。PBS洗5min，3次，加生物素标记的二抗(抗兔IgG)孵育30min。PBS洗5min，3次，再加链霉菌抗生物生物素蛋白-辣根过氧化物酶室温作用30min。PBS洗5min，3次。DAB显色。苏木素复染。常规脱水透明，中性树胶封片、观察。以PBS液取代一抗作空白对照，牛血清取代一抗作替代对照。并做吸附试验。同时组织片行GFAP染色(美国Maxim公司鼠抗人单抗制品)作对照观察。
1.3 阳性结果判定 星形细胞胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性。
2 结 果
2.1 对照组 5例患者大脑皮层、丘脑、小脑皮层及脑干的许多神经元细胞内皮素-1免疫组化染色阳性，呈棕黄色。血管及小血管的中膜和外膜也呈现内皮素-1样免疫反应性。但星形细胞及血管的内皮细胞仅偶见有内皮素-1染色阳性的细胞。
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2.2 脑出血组 脑出血后24～36h即可见星形细胞增生及肥大变性。>72h者在脑出血灶周围，可见大量的反应性星形细胞增生、肥大变性。内皮素-1免疫组化染色，与对照组比较，除了神经元细胞染色阳性外，显微镜低倍镜下见白质区有点状或蜘蛛状的棕褐色阳性染色，高倍镜下见星状或多角的细胞胞体并向四周发出多个放射状突起，经衬染见胞核较大，呈不规则的卵圆或圆形，核内染色质淡染，未见有明显核仁，可以确定为星形胶质细胞；由星形细胞发出的突起也呈ET-1染色阳性，提示有内皮素-1的表达。这些星形细胞GFAP染色阳性。血管内皮细胞内皮素-1染色阴性。
3 讨 论
已有研究证实脑出血后在血肿周围有一明显的缺血区域，且缺血脑组织面积是血肿面积的数倍[3]，并提出在血肿周围存在一进行性脑组织坏死和水肿的“半暗带(penumbra)”[4～5]。血肿压迫、促血管收缩活性物质异常增多等使周围脑组织严重缺血，血管通透性增加、管壁破坏、血液成分漏出，是中心坏死区不断扩大的重要原因。严重者导致颅高压，诱发远离血肿的其他脑区，甚至全脑的供血不足。内皮素-1目前仍被认为是收缩血管作用最强的生物肽，最近的研究表明，内皮素-1在器官发育、细胞有丝分裂、维持正常的血脑屏障及神经调节等方面起重要作用。内皮素-1可通过其强烈的收缩血管作用、诱发细胞内钙超载、促进兴奋性氨基酸神经递质释放等作用参与缺血性脑血管病的病理过程。
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Giaid等[6]利用无神经系统疾病人脑组织研究发现，人脑的额叶、颞叶、顶叶皮层的3～6层神经元细胞，侧脑室旁，丘脑的神经核团，尾状核，杏仁核，下丘脑，小脑的Purkinje细胞均有内皮素-1的表达。但星形胶质细胞无内皮素-1的表达。我们的结果与此基本一致，在对照组仅偶见阳性星形细胞。
在脑组织中，星形胶质细胞占胶质细胞的50%～60%，为神经元数量的5倍以上。星行细胞在维持细胞组织的水、离子平衡，调节神经元的正常代谢活动中具有重要作用[7]。脑缺血损伤激发胶质细胞复杂的细胞反应，包括多种酶、蛋白质和受体表达的调节，毒性物质的释放，细胞因子和神经营养因子的分泌。星形细胞、小胶质细胞和神经元之间相互作用，对缺血性脑损伤的发展产生双向作用。有研究发现用选择性胶质毒素(fluorocitrate)破坏大鼠的胶质细胞后，能产生类似于局灶脑缺血半暗带的多种病理生理改变。并且发现，缺少正常的胶质细胞作用后，神经元对扩散性抑制波呈高度易损伤性。这提示，半暗带神经元死亡的原因可能首先是胶质细胞的功能异常[8]。Ehrenreich等[9]发现在体外培养的星形细胞能产生内皮素并释放到培养液中。Nie等[10]对腔隙梗塞、脑梗塞患者利用免疫组织化学方法研究发现，腔隙梗塞、脑梗塞患者的反应性星形细胞表达内皮素-1样免疫反应性。他们认为星形细胞产生的内皮素可以通过强烈的收缩血管作用加重缺血组织的损伤，并可能促进胶质瘢痕的产生。我们的研究结果提示，脑出血后星形细胞增生、肥大变性，同时具有内皮素-1的表达。因此，脑出血后星形细胞功能异常有可能成为出血灶周围“缺血半暗带”神经元死亡的重要原因；而增多的ET-1可能通过其强烈的收缩血管作用、诱发细胞内钙超载、促进兴奋性氨基酸神经递质释放等多种机制参与脑出血的病理过程，加重血肿周围脑组织水肿和局部缺血损伤。
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据研究发现血管内皮细胞虽能产生内皮素但不能贮存内皮素，因此血管内皮细胞在机体死亡数小时内即失去ET-1样免疫反应性[11]，而神经元和反应性星形细胞具有贮存内皮素的功能，同时由于机体死亡后ET-1的降解酶活性降低，故神经元和星形细胞的ET-1表达反而强于血管内皮细胞。本实验结果提示血管内皮细胞内皮素-1免疫组化染色阴性，可能与标本取材时间超过12h有关。
内皮素引起血管收缩的机制主要是通过激活血管平滑肌细胞的特异受体，使细胞外Ca2+内流及动员细胞内贮存Ca2+，活化磷脂酶A2和C、蛋白激酶C，以及促进Na+-H+交换，引发C-fos原癌基因的转录和抑制Na+-K+-ATP酶。Ca2+的增加引起血管收缩[12]。因此，内皮素受体拮抗剂或Ca2+拮抗剂的应用及针对胶质细胞功能异常的干预有望成为救治脑出血新的途径。■
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770753)
作者简介：黄勇华，男，1969-06-16生，广东大埔县人，汉族，1991年第一军医大学毕业，第三军医大学97级硕士生，导师张微微教授；发表论文2篇。电话：(010)66721170
参考文献：
[1]Mayer SA, Lignelli A, Fink ME et al. Perilesional blood flow and edema formation in acute intracerebral hemorrhage a spect study[J]. Stroke, 1998,9:1791-1798.
[2]Miller RC, Pelton JT, Huggins JP. Endothelins-from receptors to medicine [J]. Tips, 1993,14:54-60.
, http://www.100md.com
[3]Mendelow AD. Mechanisms of ischemic brain damage with intracerebral hemorrhage [J]. Stroke, 1991,24(12):Ⅰ-115-Ⅰ-119.
[4]Jenkins A, Mendelow AD, Graham DI et al. Experimental intracranial hematoma: the role of blood constituents in early ischemia [J]. Br J Neurosug, 1990,4:45-51.
[5]Yang GY, Betz PT, Jenkins A et al. Effects of experimental intracerebral hemorrhage: relationship between brain edema, blood flow, and blood-brain barrier permeability in rats [J]. J Neurosurg, 1994,81:93-102.
, 百拇医药
[6]Giaid A, Gibson SJ, Herrero MT et al. Topographical localisation of endothelin mRNA and peptide immunoreactivity in neurones of the human brain [J]. Histochemistry, 1991,95:303-304.
[7]Zhan SS, Veehuis R, Kamphorst W et al. Distribution of beta amyloid associated proteins in plaques in Alzheimer′s disease and in the non-demented elderly [J]. Neurodegeneration, 1995,4:291-297.
[8]Largo C, Cuevas P, Herreras O. Is glia dysfunction the intial cause of neuronal death in ischemic Penumbra [J]? Neurol Res, 1996,18(5):445-448.
, http://www.100md.com
[9]Ehrenreich H, Kehrl JH, Anderson RW et al. A vasoactive peptide, endothelin-3, is produced by and specifically binds to primary astrocytes [J]. Brain Res, 1991,538:54-58.
[10]Nie XJ, Hoog A, Jiang MH et al. Endothelin-like immunoreactivity is expressed in reactive astrocytes in case of cerebral infarcts and lacunes [J]. European J Neurology, 1994,1:135-140.
[11]Giaid A, Gibson S, Ibrahim N et al. Endothelin-1 an endothelium-derived peptide is expressed in neurons of the human spinal cord and dorsal root ganglia [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86:7634-7638.
[12]Greenberg DA, Chan J, Sampson HA. Endothelins and nervous system [J]. Neurology, 1992,42:25-31.
收稿日期：1999-08-09
改回日期：1999-09-06, 百拇医药
单位：黄勇华 张微微 郝小淑 周进和 史晓东(北京军区总医院神经内科，北京 100700；)；Margaretta Bjoeling(瑞典Uppsala大学病理研究所)
关键词：脑出血；星形细胞；内皮素-1；免疫组织化学
军医进修学院学报000102摘 要：目的：探讨内皮素-1 与星形细胞之间相互关系及其在脑出血的作用。方法：采用内皮素-1抗体SP免疫组化技术对脑出血患者尸检材料血肿周围脑组织反应性星形细胞内皮素-1 表达水平进行检测。结果：发现脑出血组反应性星形细胞增生、肥大变性，存在内皮素-1 的表达，而对照组星形细胞形态基本正常，偶见阳性。结论：内皮素-1 及反应性星形细胞可能参与脑出血的病理机制。
中图号：R743.34 文献标识码：A
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文章编号：1005-1139-(2000)01-0005-07
A study of endothelin-1 expression in reactive astrocytes surrounding the hematoma in cerebral hemorrhage
Huang Yong-hua, ZHANG Wei-wei, HAO Xiao-shu,(Department of Neurology, Beijing Army General Hospital,Beijing 100700,China)
ZHOU Jin-he,SHI Xiao-dong,Margaretta Bjoeling
Abstract：Objective：To investigate the expression of endothelin-1 in astrocytes in the human brain with cerebral hemorrhage.Methods：The SP immunohistochemical method and a polyclonal antiserum were used. Autopsy material was obtained from 8 cases of cerebral hemorrhage,5 cases without brain diseases. Results：Endothelin-1 was expressed in numerous reactive astrocytes in the human brain surrounding the hematoma. But this occurred in only exceptional astrocytes of controls. Conclusion：The results suggest that endothelin-1 might play an essential role in the pathogenesis of edema formation and ischemia injury after cerebral hemorrhage.
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Key words：cerebral hemorrhage; astrocyte; endothelin-1； immunohistochemistry▲
许多研究已证实脑出血后在出血灶周围存在水肿和继发性缺血损伤的区域[1]。近年来的研究发现，胶质细胞在脑缺血后异常活跃。缺血性脑损伤所激发的星形细胞和小胶质细胞反应极其复杂，已远远超出了对神经元的营养支持和清除变性坏死组织的作用范围。内皮素-1 目前仍被认为是血管收缩作用最强的生物肽[2]，同时它还有多种生物效应，其与脑血管疾病的关系日益受到人们重视。本实验旨在探讨皮素-1、星形细胞之间的相互关系及其在脑出血继发性脑损伤的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 全部标本来源于死后1/2～2d的尸体材料。8例脑出血患者，男性5例，女性3例，年龄45～87岁，平均(64±13.02)岁。出血后24h死亡者1例，24～72h死亡者3例，>72h者4例。从发病到死亡均为5d之内。全部病例根据临床表现、脑CT检查和尸检病理学诊断。其中丘脑出血2例，豆状核出血4例，小脑半球出血1例，额叶出血1例。对照组5例，男性2例，女性3例，年龄51～79岁，平均(68.4±10.31)岁。既往无神经系统疾病病史。组织取材选择病灶与正常交界区域，对照组相应部位取材。组织经过10%甲醛固定，充分脱水、透明、浸蜡、包埋。包埋过程中石蜡保持在60℃。5μm切片。
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1.2 方法 采用SP染色法。兔抗体内皮素-1抗体为英国剑桥生物研究所产品。常规脱蜡水化，PBS洗5min，3次，加过氧化物酶阻断液，以阻断内源性过氧化物酶30min。PBS洗5min，3次，加非免疫性羊血清封闭30min。加一抗(1∶4000，1∶6000，1∶8000)4℃过夜。PBS洗5min，3次，加生物素标记的二抗(抗兔IgG)孵育30min。PBS洗5min，3次，再加链霉菌抗生物生物素蛋白-辣根过氧化物酶室温作用30min。PBS洗5min，3次。DAB显色。苏木素复染。常规脱水透明，中性树胶封片、观察。以PBS液取代一抗作空白对照，牛血清取代一抗作替代对照。并做吸附试验。同时组织片行GFAP染色(美国Maxim公司鼠抗人单抗制品)作对照观察。
1.3 阳性结果判定 星形细胞胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性。
2 结 果
2.1 对照组 5例患者大脑皮层、丘脑、小脑皮层及脑干的许多神经元细胞内皮素-1免疫组化染色阳性，呈棕黄色。血管及小血管的中膜和外膜也呈现内皮素-1样免疫反应性。但星形细胞及血管的内皮细胞仅偶见有内皮素-1染色阳性的细胞。
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2.2 脑出血组 脑出血后24～36h即可见星形细胞增生及肥大变性。>72h者在脑出血灶周围，可见大量的反应性星形细胞增生、肥大变性。内皮素-1免疫组化染色，与对照组比较，除了神经元细胞染色阳性外，显微镜低倍镜下见白质区有点状或蜘蛛状的棕褐色阳性染色，高倍镜下见星状或多角的细胞胞体并向四周发出多个放射状突起，经衬染见胞核较大，呈不规则的卵圆或圆形，核内染色质淡染，未见有明显核仁，可以确定为星形胶质细胞；由星形细胞发出的突起也呈ET-1染色阳性，提示有内皮素-1的表达。这些星形细胞GFAP染色阳性。血管内皮细胞内皮素-1染色阴性。
3 讨 论
已有研究证实脑出血后在血肿周围有一明显的缺血区域，且缺血脑组织面积是血肿面积的数倍[3]，并提出在血肿周围存在一进行性脑组织坏死和水肿的“半暗带(penumbra)”[4～5]。血肿压迫、促血管收缩活性物质异常增多等使周围脑组织严重缺血，血管通透性增加、管壁破坏、血液成分漏出，是中心坏死区不断扩大的重要原因。严重者导致颅高压，诱发远离血肿的其他脑区，甚至全脑的供血不足。内皮素-1目前仍被认为是收缩血管作用最强的生物肽，最近的研究表明，内皮素-1在器官发育、细胞有丝分裂、维持正常的血脑屏障及神经调节等方面起重要作用。内皮素-1可通过其强烈的收缩血管作用、诱发细胞内钙超载、促进兴奋性氨基酸神经递质释放等作用参与缺血性脑血管病的病理过程。
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Giaid等[6]利用无神经系统疾病人脑组织研究发现，人脑的额叶、颞叶、顶叶皮层的3～6层神经元细胞，侧脑室旁，丘脑的神经核团，尾状核，杏仁核，下丘脑，小脑的Purkinje细胞均有内皮素-1的表达。但星形胶质细胞无内皮素-1的表达。我们的结果与此基本一致，在对照组仅偶见阳性星形细胞。
在脑组织中，星形胶质细胞占胶质细胞的50%～60%，为神经元数量的5倍以上。星行细胞在维持细胞组织的水、离子平衡，调节神经元的正常代谢活动中具有重要作用[7]。脑缺血损伤激发胶质细胞复杂的细胞反应，包括多种酶、蛋白质和受体表达的调节，毒性物质的释放，细胞因子和神经营养因子的分泌。星形细胞、小胶质细胞和神经元之间相互作用，对缺血性脑损伤的发展产生双向作用。有研究发现用选择性胶质毒素(fluorocitrate)破坏大鼠的胶质细胞后，能产生类似于局灶脑缺血半暗带的多种病理生理改变。并且发现，缺少正常的胶质细胞作用后，神经元对扩散性抑制波呈高度易损伤性。这提示，半暗带神经元死亡的原因可能首先是胶质细胞的功能异常[8]。Ehrenreich等[9]发现在体外培养的星形细胞能产生内皮素并释放到培养液中。Nie等[10]对腔隙梗塞、脑梗塞患者利用免疫组织化学方法研究发现，腔隙梗塞、脑梗塞患者的反应性星形细胞表达内皮素-1样免疫反应性。他们认为星形细胞产生的内皮素可以通过强烈的收缩血管作用加重缺血组织的损伤，并可能促进胶质瘢痕的产生。我们的研究结果提示，脑出血后星形细胞增生、肥大变性，同时具有内皮素-1的表达。因此，脑出血后星形细胞功能异常有可能成为出血灶周围“缺血半暗带”神经元死亡的重要原因；而增多的ET-1可能通过其强烈的收缩血管作用、诱发细胞内钙超载、促进兴奋性氨基酸神经递质释放等多种机制参与脑出血的病理过程，加重血肿周围脑组织水肿和局部缺血损伤。
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据研究发现血管内皮细胞虽能产生内皮素但不能贮存内皮素，因此血管内皮细胞在机体死亡数小时内即失去ET-1样免疫反应性[11]，而神经元和反应性星形细胞具有贮存内皮素的功能，同时由于机体死亡后ET-1的降解酶活性降低，故神经元和星形细胞的ET-1表达反而强于血管内皮细胞。本实验结果提示血管内皮细胞内皮素-1免疫组化染色阴性，可能与标本取材时间超过12h有关。
内皮素引起血管收缩的机制主要是通过激活血管平滑肌细胞的特异受体，使细胞外Ca2+内流及动员细胞内贮存Ca2+，活化磷脂酶A2和C、蛋白激酶C，以及促进Na+-H+交换，引发C-fos原癌基因的转录和抑制Na+-K+-ATP酶。Ca2+的增加引起血管收缩[12]。因此，内皮素受体拮抗剂或Ca2+拮抗剂的应用及针对胶质细胞功能异常的干预有望成为救治脑出血新的途径。■
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770753)
作者简介：黄勇华，男，1969-06-16生，广东大埔县人，汉族，1991年第一军医大学毕业，第三军医大学97级硕士生，导师张微微教授；发表论文2篇。电话：(010)66721170
参考文献：
[1]Mayer SA, Lignelli A, Fink ME et al. Perilesional blood flow and edema formation in acute intracerebral hemorrhage a spect study[J]. Stroke, 1998,9:1791-1798.
[2]Miller RC, Pelton JT, Huggins JP. Endothelins-from receptors to medicine [J]. Tips, 1993,14:54-60.
, http://www.100md.com
[3]Mendelow AD. Mechanisms of ischemic brain damage with intracerebral hemorrhage [J]. Stroke, 1991,24(12):Ⅰ-115-Ⅰ-119.
[4]Jenkins A, Mendelow AD, Graham DI et al. Experimental intracranial hematoma: the role of blood constituents in early ischemia [J]. Br J Neurosug, 1990,4:45-51.
[5]Yang GY, Betz PT, Jenkins A et al. Effects of experimental intracerebral hemorrhage: relationship between brain edema, blood flow, and blood-brain barrier permeability in rats [J]. J Neurosurg, 1994,81:93-102.
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[6]Giaid A, Gibson SJ, Herrero MT et al. Topographical localisation of endothelin mRNA and peptide immunoreactivity in neurones of the human brain [J]. Histochemistry, 1991,95:303-304.
[7]Zhan SS, Veehuis R, Kamphorst W et al. Distribution of beta amyloid associated proteins in plaques in Alzheimer′s disease and in the non-demented elderly [J]. Neurodegeneration, 1995,4:291-297.
[8]Largo C, Cuevas P, Herreras O. Is glia dysfunction the intial cause of neuronal death in ischemic Penumbra [J]? Neurol Res, 1996,18(5):445-448.
, http://www.100md.com
[9]Ehrenreich H, Kehrl JH, Anderson RW et al. A vasoactive peptide, endothelin-3, is produced by and specifically binds to primary astrocytes [J]. Brain Res, 1991,538:54-58.
[10]Nie XJ, Hoog A, Jiang MH et al. Endothelin-like immunoreactivity is expressed in reactive astrocytes in case of cerebral infarcts and lacunes [J]. European J Neurology, 1994,1:135-140.
[11]Giaid A, Gibson S, Ibrahim N et al. Endothelin-1 an endothelium-derived peptide is expressed in neurons of the human spinal cord and dorsal root ganglia [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86:7634-7638.
[12]Greenberg DA, Chan J, Sampson HA. Endothelins and nervous system [J]. Neurology, 1992,42:25-31.
收稿日期：1999-08-09
改回日期：1999-09-06, 百拇医药