ABO血型的基因型与法医学应用
作者：吕德坚 伍新尧
单位：吕德坚(广州中山医科大学法医系，510089)；伍新尧(广州中山医科大学法医系，510089)
关键词：ABO血型；基因型；法医学应用
法律与医学杂志000110 分类号：D919.2 Q75 文献标识码：A
文章编号：1007-9297(2000)01-0027-03▲
ABO血型系统是1901年由Landsteiner首先发现的第一个人类遗传标记。由于ABO血型抗原不仅存在于组织细胞，也存在于体液中，抗原相对稳定，保存较持久，分型已标准化，群体资料丰富，故在法医学上一直有着重要的地位。传统的ABO分型采用血清学方法，但其抗原属糖蛋白易失活，自然界中广泛存在类似的物质，都会影响检验效果。因DNA特殊结构，使得稳定性比蛋白更高，是携带遗传信息的物质，因此，从DNA水平对ABO基因进行分型更能准确地反映个体的差异，尤其是PCR技术对微量检材的检验，ABO血型系统的分子生物学分型法已越来越多地被应用到法医学上[1]。
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一、ABO血型的分子遗传学基础
ABO血型的遗传由三个复等位基因控制，按孟德尔定律稳定遗传，A、B基因分别编码控制A、B糖基转移酶，负责将相应的糖基连到H物质上，表现出相应的抗原特异性。而O基因决定一种无转移酶活性的蛋白，不能将糖基连到H物质上，表现为O型。但其分子遗传机理直到1990年才由Yamamoto F等[2]研究清楚，他们克隆和测序了不同ABO状态的cDNA，发现编码A与B糖基转移酶等位基因的序列之间有7个碱基差异，其中4个起决定作用的碱基(nt526,nt703,nt796和nt803[3])发生替换，导致了相应的氨基酸残基改变，编码不同特异性的糖基转移酶，O与A、B等位基因的不同是nt261G缺失，读码框移位，编码无转移酶活性的蛋白。用RFLP可以检测ABO等位基因(如图1)。进一步研究揭示，ABO基因座由7个外显子组成[4]，而对A、B转移酶特异性起决定性作用的主要是第Ⅵ和Ⅶ外显子编码的氨基酸序列[5]。继后，研究发展很快，Yamamoto F等学者又报道了各种ABO亚型等位基因的序列。到目前为止，已发现有20多种亚型基因的序列[6，7]，这些具有序列多态性的等位基因构成了ABO血型分子生物学分型的基础。
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图1 ABO基因座的5个主要等位基因核苷酸差异示意图
二、ABO血型的分子生物学分型方法
ABO血型的DNA分型技术主要有PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphisem)、PCR-SSP(sequence specific primer)、PCR-DGGE(denature gradient gel electrophoresis)和APLP(amplified product length polymorphism)等。
在法医学上主要采用PCR-RFLP，因为该法分型准确，可标准化。通常用2对或2对以上引物分别扩增O和A/B基因特异性片段，再用限制性内切酶消化，根据消化所得的片段长度判型。目前多采用Lee和Chang[8]的标准引物：引物1：5’-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3’；引物2：5’-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3’；引物3：5’-TGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’；引物4：5’-GTAGAAATCGCCTCGTCCTT-3’。引物1+2扩增长度200bp(O等位基因为199bp)，为含nt261片段，用KpnI消化后，O等位基因产生171+28bp两个片段，引物3+4扩增长度为128bp的片段，含nt703的片段，用AluI消化后B等位基因产生88+40bp的片段，而A等位基因两扩增片段均不被消化，这样ABO血型的六种基因型均可被检出。本法通常在两个独立的反应管中扩增，需要双份的模板，模板量消耗大，Tun等人[9]对PCR参数进行优化，使反应在同一反应管中扩增，节省了模板，但仍然模板要在5ng以上，PCR条件要求也较严。Herrin G等[10]将Lee和Chang的引物3、4改为：ABO3：5’-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’和ABO10：5’-CACCGACCCCCCGAAGAAC-3’(扩增产物长度为159bp，Alu I消化后为118+41bp)，在单一反应管内两对引物同时扩增后用2种内切酶消化，减少模板的用量，1～2ng模板即能成功扩增，提高了检测的灵敏度，也节省了时间，并且受PCR参数影响较小，分型稳定，重复性良好[11]。PCR-RFLP可选择更多的酶切点分析，一方面防止判错型，另一方面可检出更多的亚型[12]。
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Akane等[13]仅用lee和Chang的引物1和2，结合PCR-SSCP，可以检测出A、B、OA和OG等4种等位基因，但SSCP分析条件难以标准化。此外，也有采用AS-PCR(Allele specific PCR)、MS-PCR(mutagenically separated PCR)进行ABO血型的分型，优点是无需酶消化，时间短，缺点是需要较多的引物，并且PCR参数难以优化。
三、ABO血型的分子生物学分型在法医学中应用
(一)种属鉴定
比较人与各种高等动物的ABO基因座的DNA序列，发现他们之间具有一定的同源性。与ABH抗原广泛地存在于自然界不同，ABO的等位基因序列具有相对的种属特异性，运用适当的引物可扩增特异性的人和灵长类ABO等位基因，而鹿、狗、猫、牛和羊等常见动物均无扩增产物，一些易受微生物污染的检材，如死后的小肠组织，也未发现受污染[14]。
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(二)个人识别
DNA比蛋白质更具稳定性，对不同载体检材上的血痕、长达10年邮票上的唾液斑[1]、古木乃伊[15]都已成功地进行ABO的基因分型。由于扩增的片段长度约在200bp左右，因此在法医学上比较适用于微量、降解检材的检验。在优化PCR条件下，灵敏度已达到1ng的DNA[14]，烟头、单毛根[1]、骨骼[14]、石蜡包埋组织[16]、都可以正确地进行ABO血型的分型。对混合斑，采用二步消化法分离DNA，也可以正确地检出精斑的基因型，获得了比血清学更多的个体差异信息[14，17，18]。
(三)亲权鉴定
ABO血型的DNA分型，在亲子鉴定中有着特殊的应用意义。
, http://www.100md.com 用血清学方法，只能检测ABH抗原的表型，而从基因水平检测ABO血型的多态性，可以检出其基因型，区分是杂合子或是纯合子。血清学方法很难确定如cis-AB型一类的基因型，只能通过家系调查发现，而ABO血型的DNA分型则很容易检出。因此，检测ABO血型基因座的DNA多态性，能提供比血清学分型更为详细的遗传信息，已被用于亲子鉴定中[19]。
对ABO血型的基因分析，能解释一些血清学表现型的遗传与孟德尔定律相矛盾的例子。由于ABO基因是一个序列多态性位点，碱基替换、插入或缺失均可产生A2、Ax、Ael、cis-AB、Bx和Bel等各种亚型的变异。通过交换或颠换等重组方式也可形成A2、Ax、Ael等各种亚型，一个例子是Ogasawar K等人在Ax的个体中还发现的一个重组等位基因ABO*R101，和ABO*A101(A1)比较，在nt297、nt526、nt526、nt657、nt703、nt771和nt829处共6外碱基不同，ABO*R101序列的nt703上游与ABO*B101(B)相同，nt771下游与ABO*O201(O)相同，系ABO*B101和ABO*O201在nt703-771之间发生重组的结果，发生率可达1%。ABO*A102(Ax)和*O201(O)也可重组形成*A110(Ael)[6]。
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重组的结果还可以形成杂体等位基因(hybrid allele)[20,21,22]，编码新特异性的抗原，当用血清学方法进行亲子鉴定时，会发现不按孟德尔规律遗传。Suzuki K等[20]报告了一例血清学异常遗传的亲权鉴定案，该案母亲为B型，小孩为A1型，争议父为O型，三人的唾液均分泌H抗原，而DNA指纹(探针33.6和33.15)和微卫星(vWF、TH01、FES、PLA2和D1S315)均不能排除亲权关系。经深入研究发现，小孩有一杂体等位基因(hybrid allele)，由母亲的等位基因畸变传给小孩，该杂体等位基因由B等位基因第6外显子和O1等位基因的第7外显子的碱基序列组成，因糖基转移酶的特异性主要由第7外显示子编码控制，故表现为A1表现型。杂体等位基因是母亲的生殖细胞内发生全段de novo重组的结果。杂化体等位基因在日本人群中发生率估计有0.009%。由其它重组方式产生的各种杂体等位基因也已有报道[22，23]。我们在检案中也发现了一例父亲为B型，母亲O型，有争议小孩为A型，而20个DNA多态性标记均不排除亲生关系的案例，推测也是由于重组形成杂等位基因所致[24]。因此，在亲子鉴定中发现ABO与其它多态性标记发生矛盾时，就必须进行ABO系统的DNA分型，才能确定其遗传关系，不能单纯以ABO血型的血清学分型违反孟德尔遗传规律就下排除亲生关系的结论。
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ABO血型历史悠久，分型标准化，群体数据详尽，是ABO血型系统的优点，但目前法医学上采用的PCR-RFLP技术，所能检出等位基因只有3个，多态性比一些STR位点低。随着技术的改进，ABO血型的基因分型在个体识别和亲子鉴定的应用将进一步得到发展。■
参考文献：
[1]Lechti-Gallati S, Neesr D. Efficient and reliable PCR-based detection of the ABO blood group alleles: genotyping on stamps and other biological evidence samples. J Forensic Sci, 1996,41:653～657
[2]Yamamto F, Clausen H, White T, et al. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system. Nature, 1990,345:229～33
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[3]Yamamoto F, McNeill P, Yamamoto M, et al. Molecular genetic analysis of the ABO blood group system. 1. Weak subgroups: A3 and B3 alleles. Vox Sang, 1993,64:116～119
[4]Bennett E, Steffensen R, Clausen H, et al. Genomic cloning of the human histo-blood group ABO locus. Biochem Biophys Res Commun, 1995,206:381～325
[5]Yamamoto F, Hakomori S. Sugar-nucleotide donor specificity of histo-blood group A and B transferases is based on amino acid substitutions. J Biol Chem 1990,265:19257～62
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[6]Ogasawara K, Yabe R, Uchikawa M, et al. Molecular genetic analysis of variant phenotypes of the ABO blood group system. Blool, 1996,2732～2737
[7]Fukumori Y, Ohnoki S, Shibata H, et al. Suballeles of the ABO blood group system in a Jajpanese population. Hum Herd, 1996,46:85～91
[8]Lee JC, Chang JG. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J Forensic Sci, 1992,37(5):1269～75
[9]Tun Z, Honda K, Nakatome M, et al. Rapid and clear detection of ABO genotypes by simultaneous PCR-RFLP method. J Forensic Sci, 1996,41:1027～1030
, 百拇医药
[10]Herrin G. A simplified amplification procedure for two regions of the glycosyl transferase (ABO blood group) gene. J Forensic Sci, 1996,41:138～141
[11]杨庆恩，朱传红.复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型.中华医学遗传杂志，1999，16(2)：110～112
[12]Nishimukai H, Fukumori Y, Okiura T, et al. Genotyping of the ABO blood group system: analysis of nucleotide position 802 by PCR-RFLP and the distribution of ABO genotypes in a German population. Int J Legal Med 1996,109:90～3
, 百拇医药
[13]Akane A, Yoshimura S, Yoshida M, et al. ABO genotyping following a single PCR amplification. J Forensic Sci 1996,41:272～274
[14]Ladd C, Bourke MT, Scherczinger CA, et al. A PCR-based strategy for ABO genotype determination. J Forensic Sci 1996,41(1):134～7
[15]Lin Z, Kondo T, Minamino T, Sun E, et al. Genotyping of ABO blood group system by PCR and RFLP on mummies discovered at Taklamakan desert in 1912. Nippon Hoigaku Zasshi 1996,50:336～42
, 百拇医药
[16]Yamada M, Yamamoto Y, Tanegashima A, et al. Determination of ABO genotypes with DNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Int J Legal Med 1994,106(6):285～7
[17]李晓平，杜庆新，顾明波，等.ABO基因座限制性扩增片段长度多态性在法科学的应用.中国法医学杂志.1999，14(4)：30～32
[18]Sasaki M, Shiono H. ABO genotyping of suspects from sperm DNA isolated from postcoital samples in sex crimes. J Forensic Sci, 1996,41:275～278
, http://www.100md.com [19]Hashimoto Y, Nakanishi A. ABO genotyping by polymerase chain reaction (PCR) and its application to paternity testing. Nippon Hoigaku Zassshi, 1993,47:481～5
[20]Suzuki K, Iwata M, Tsuji H, et al. A de novo recombination in the ABO blood group gene and evidence for theoccurence of recombination products. Hum Genet, 1997,99:454～61
[21]Olsson ML, Chester MA. Evidence for a new type of O allele at the ABO locus, due to a comoination of the A2 nucleotide deletion and the Ael nucleotide insertion. Vox Sang, 1996,71:113～7
, 百拇医药
[22]Olsson ML, Chester MA. Heterogeneity of the bolld group Ax allele: genetic recombination of common alleles can result in thd Ax phenotype. Transfus Med, 1998,8:231～8
[23]Watanabe G, Umetsu K, Sato M, et al. Three cases of recombinated gene in the ABO blood group system. Nippon Hoigaku Zasshi, 1997,51(3),205～10
[24]吕德坚，李建金，刘秋玲，等.ABO血型异常遗传的亲子鉴定案(待发表)
收稿日期：1999-09-06, 百拇医药
单位：吕德坚(广州中山医科大学法医系，510089)；伍新尧(广州中山医科大学法医系，510089)
关键词：ABO血型；基因型；法医学应用
法律与医学杂志000110 分类号：D919.2 Q75 文献标识码：A
文章编号：1007-9297(2000)01-0027-03▲
ABO血型系统是1901年由Landsteiner首先发现的第一个人类遗传标记。由于ABO血型抗原不仅存在于组织细胞，也存在于体液中，抗原相对稳定，保存较持久，分型已标准化，群体资料丰富，故在法医学上一直有着重要的地位。传统的ABO分型采用血清学方法，但其抗原属糖蛋白易失活，自然界中广泛存在类似的物质，都会影响检验效果。因DNA特殊结构，使得稳定性比蛋白更高，是携带遗传信息的物质，因此，从DNA水平对ABO基因进行分型更能准确地反映个体的差异，尤其是PCR技术对微量检材的检验，ABO血型系统的分子生物学分型法已越来越多地被应用到法医学上[1]。
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一、ABO血型的分子遗传学基础
ABO血型的遗传由三个复等位基因控制，按孟德尔定律稳定遗传，A、B基因分别编码控制A、B糖基转移酶，负责将相应的糖基连到H物质上，表现出相应的抗原特异性。而O基因决定一种无转移酶活性的蛋白，不能将糖基连到H物质上，表现为O型。但其分子遗传机理直到1990年才由Yamamoto F等[2]研究清楚，他们克隆和测序了不同ABO状态的cDNA，发现编码A与B糖基转移酶等位基因的序列之间有7个碱基差异，其中4个起决定作用的碱基(nt526,nt703,nt796和nt803[3])发生替换，导致了相应的氨基酸残基改变，编码不同特异性的糖基转移酶，O与A、B等位基因的不同是nt261G缺失，读码框移位，编码无转移酶活性的蛋白。用RFLP可以检测ABO等位基因(如图1)。进一步研究揭示，ABO基因座由7个外显子组成[4]，而对A、B转移酶特异性起决定性作用的主要是第Ⅵ和Ⅶ外显子编码的氨基酸序列[5]。继后，研究发展很快，Yamamoto F等学者又报道了各种ABO亚型等位基因的序列。到目前为止，已发现有20多种亚型基因的序列[6，7]，这些具有序列多态性的等位基因构成了ABO血型分子生物学分型的基础。
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图1 ABO基因座的5个主要等位基因核苷酸差异示意图
二、ABO血型的分子生物学分型方法
ABO血型的DNA分型技术主要有PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphisem)、PCR-SSP(sequence specific primer)、PCR-DGGE(denature gradient gel electrophoresis)和APLP(amplified product length polymorphism)等。
在法医学上主要采用PCR-RFLP，因为该法分型准确，可标准化。通常用2对或2对以上引物分别扩增O和A/B基因特异性片段，再用限制性内切酶消化，根据消化所得的片段长度判型。目前多采用Lee和Chang[8]的标准引物：引物1：5’-CACCGTGGAAGGATGTCCTC-3’；引物2：5’-AATGTCCACAGTCACTCGCC-3’；引物3：5’-TGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’；引物4：5’-GTAGAAATCGCCTCGTCCTT-3’。引物1+2扩增长度200bp(O等位基因为199bp)，为含nt261片段，用KpnI消化后，O等位基因产生171+28bp两个片段，引物3+4扩增长度为128bp的片段，含nt703的片段，用AluI消化后B等位基因产生88+40bp的片段，而A等位基因两扩增片段均不被消化，这样ABO血型的六种基因型均可被检出。本法通常在两个独立的反应管中扩增，需要双份的模板，模板量消耗大，Tun等人[9]对PCR参数进行优化，使反应在同一反应管中扩增，节省了模板，但仍然模板要在5ng以上，PCR条件要求也较严。Herrin G等[10]将Lee和Chang的引物3、4改为：ABO3：5’-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’和ABO10：5’-CACCGACCCCCCGAAGAAC-3’(扩增产物长度为159bp，Alu I消化后为118+41bp)，在单一反应管内两对引物同时扩增后用2种内切酶消化，减少模板的用量，1～2ng模板即能成功扩增，提高了检测的灵敏度，也节省了时间，并且受PCR参数影响较小，分型稳定，重复性良好[11]。PCR-RFLP可选择更多的酶切点分析，一方面防止判错型，另一方面可检出更多的亚型[12]。
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Akane等[13]仅用lee和Chang的引物1和2，结合PCR-SSCP，可以检测出A、B、OA和OG等4种等位基因，但SSCP分析条件难以标准化。此外，也有采用AS-PCR(Allele specific PCR)、MS-PCR(mutagenically separated PCR)进行ABO血型的分型，优点是无需酶消化，时间短，缺点是需要较多的引物，并且PCR参数难以优化。
三、ABO血型的分子生物学分型在法医学中应用
(一)种属鉴定
比较人与各种高等动物的ABO基因座的DNA序列，发现他们之间具有一定的同源性。与ABH抗原广泛地存在于自然界不同，ABO的等位基因序列具有相对的种属特异性，运用适当的引物可扩增特异性的人和灵长类ABO等位基因，而鹿、狗、猫、牛和羊等常见动物均无扩增产物，一些易受微生物污染的检材，如死后的小肠组织，也未发现受污染[14]。
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(二)个人识别
DNA比蛋白质更具稳定性，对不同载体检材上的血痕、长达10年邮票上的唾液斑[1]、古木乃伊[15]都已成功地进行ABO的基因分型。由于扩增的片段长度约在200bp左右，因此在法医学上比较适用于微量、降解检材的检验。在优化PCR条件下，灵敏度已达到1ng的DNA[14]，烟头、单毛根[1]、骨骼[14]、石蜡包埋组织[16]、都可以正确地进行ABO血型的分型。对混合斑，采用二步消化法分离DNA，也可以正确地检出精斑的基因型，获得了比血清学更多的个体差异信息[14，17，18]。
(三)亲权鉴定
ABO血型的DNA分型，在亲子鉴定中有着特殊的应用意义。
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对ABO血型的基因分析，能解释一些血清学表现型的遗传与孟德尔定律相矛盾的例子。由于ABO基因是一个序列多态性位点，碱基替换、插入或缺失均可产生A2、Ax、Ael、cis-AB、Bx和Bel等各种亚型的变异。通过交换或颠换等重组方式也可形成A2、Ax、Ael等各种亚型，一个例子是Ogasawar K等人在Ax的个体中还发现的一个重组等位基因ABO*R101，和ABO*A101(A1)比较，在nt297、nt526、nt526、nt657、nt703、nt771和nt829处共6外碱基不同，ABO*R101序列的nt703上游与ABO*B101(B)相同，nt771下游与ABO*O201(O)相同，系ABO*B101和ABO*O201在nt703-771之间发生重组的结果，发生率可达1%。ABO*A102(Ax)和*O201(O)也可重组形成*A110(Ael)[6]。
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重组的结果还可以形成杂体等位基因(hybrid allele)[20,21,22]，编码新特异性的抗原，当用血清学方法进行亲子鉴定时，会发现不按孟德尔规律遗传。Suzuki K等[20]报告了一例血清学异常遗传的亲权鉴定案，该案母亲为B型，小孩为A1型，争议父为O型，三人的唾液均分泌H抗原，而DNA指纹(探针33.6和33.15)和微卫星(vWF、TH01、FES、PLA2和D1S315)均不能排除亲权关系。经深入研究发现，小孩有一杂体等位基因(hybrid allele)，由母亲的等位基因畸变传给小孩，该杂体等位基因由B等位基因第6外显子和O1等位基因的第7外显子的碱基序列组成，因糖基转移酶的特异性主要由第7外显示子编码控制，故表现为A1表现型。杂体等位基因是母亲的生殖细胞内发生全段de novo重组的结果。杂化体等位基因在日本人群中发生率估计有0.009%。由其它重组方式产生的各种杂体等位基因也已有报道[22，23]。我们在检案中也发现了一例父亲为B型，母亲O型，有争议小孩为A型，而20个DNA多态性标记均不排除亲生关系的案例，推测也是由于重组形成杂等位基因所致[24]。因此，在亲子鉴定中发现ABO与其它多态性标记发生矛盾时，就必须进行ABO系统的DNA分型，才能确定其遗传关系，不能单纯以ABO血型的血清学分型违反孟德尔遗传规律就下排除亲生关系的结论。
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ABO血型历史悠久，分型标准化，群体数据详尽，是ABO血型系统的优点，但目前法医学上采用的PCR-RFLP技术，所能检出等位基因只有3个，多态性比一些STR位点低。随着技术的改进，ABO血型的基因分型在个体识别和亲子鉴定的应用将进一步得到发展。■
参考文献：
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[15]Lin Z, Kondo T, Minamino T, Sun E, et al. Genotyping of ABO blood group system by PCR and RFLP on mummies discovered at Taklamakan desert in 1912. Nippon Hoigaku Zasshi 1996,50:336～42
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收稿日期：1999-09-06, 百拇医药