武汉汉族群体FOLP23、TPOX及GABRB15基因座遗传多态性研究
作者：孙文清 潘良胜 周高举 张正武 蔺启英 杨庆恩 余纯应
单位：孙文清(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；潘良胜(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；周高举(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；张正武(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；蔺启英(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；杨庆恩(同济医科大学法医学系，武汉，430030)；余纯应(同济医科大学法医学系，武汉，430030)
关键词：短串联重复序列；聚合酶链反应；遗传学多态性；基因频率
武汉汉族群体FOLP23 摘 要：目的 研究FOLP23、TPOX及GABRB15的多态性及法医学应用价值。方法 应用聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及银染显带技术对武汉地区汉族200例无关个体作FOLP23、TPOX及GABRB15位点分型调查。结果 FOLP23、TPOX及GABRB15位点分别检出6、5和5个等位基因，获得汉族人群基因频率分布。三位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。位点杂合度分别为0.6798、0.5650、0.6950，个人识别能力分别为0.8594、0.6975和0.8262，非父排除率分别为0.4531、0.2745、0.4079。结论 FOLP23、TPOX及GABRB15位点均是高杂合度、高鉴别能力的遗传标记系统，具有较高的法医学应用价值。}
, http://www.100md.com
分类号：D919.2；Q75 文献标识码：A
文章编号：1007-9297(2000)01-0009-04
Polymorphism of FOLP23、TPOX and GABRB15 in Wuhan area Han population.
SUN Wen-qing PAN Liang-sheng ZHUO Gao-ju
(WuHan Intermediate Peoples' Court. WuHan 430015.)
Abstract：Objective To investigate polymorphism of STR loci FOLP23、 TPOX and GABRB15 and availability in forensic science. Methods 200 unrelative individuals of Han population living in Wuhan area were examined using PCR followed by PAGE and silver stains. Results 6 alleles of FOLP23, 5 alleles of TPOX and 5 alleles of GABRB15 were identified respectively. The patter of allele frequencies in FOLP23, TPOX and GABRB15 in Han population was obtained. The distributions of genotypes in three loci are good agreement with Hardy Weinbgrg equilibrium. The heterozyosity of FOLP23, TPOX and GABRB15 are 0.8594、 0.6975 and 0.8262, the DPP are 0.4531、0.2745、0.4079. Conclusion The results in this study show that FOLP23, TPOX and GABRB15 loci are valuable STR genetic marker system in the fields of forensic science and genetics.
, http://www.100md.com
Key Words：STR Polymerase Chain Reaction Genetic Polymorphism▲
FOLP23、TPOX及GABRB15短串联重复序列分别定位于人类第6、2和4号染色体，有关上述三个STR基因座中国武汉地区汉族群体中基因频率分布状态未见报道。本文应用PCR、PAGE技术对STR位点FOLP23、TPOX及GABRB15作了分型研究，对武汉地区汉族200例无关个体群体调查，获得三位点的基因频率分布，为人类群体遗传学研究提供参考数据。现报告如下：
材料与方法
一、材料
1.血样 200名汉族无关个体的EDTA抗凝血由武汉同济医院血库提供。一个三代六口人家系血样从自愿者采集；18例经常规血型测定确定亲生关系的父母子血样系本实验亲子鉴定案件中所收集。
, http://www.100md.com
2.引物 3个STR位点扩增引物均由Bio-tech公司合成，引物系列如下：
HUMFOLP23位点引物[1]：
A:5’-ATTGTAAGACTTTTGGAGCCATTT-3’
B:5’-TTCAGGGAGAATGAGATGGGC-3’
HUMTPOX位点引物[2]：
A:5’-ACTGGCACAGAACAGGCACCTAGG-3’
B:5-GGAGGAACTGGGAACCACACAGGT-3’
HUMGABRB15位点引物[1]：
, 百拇医药
A:5’-CTAGAAAGCTAGCAAGGTGGAT-3’
B:5’-GCTCATTAAACACTGTGTTCCT-3’
二、实验方法
1.DNA样品制备 取EDTA抗凝全血200μl，加裂解缓冲液〔0.32M蔗糖/10MTris.HCL(PH7.5)/5mMMgCl2/1%TritonX-100〕600μl混匀后13000rp离心20秒弃上清液；沉淀物重新悬浮于600μl裂解缓冲液中；重复洗涤、离心步骤至血红蛋白除净。沉淀物中加入非离子去污剂的PCR缓冲液(50mM KCL/10mM Tris.HCL PH8.0/2.5mM MgCl2/0.1mg/m1白明胶/0.45%吐温20/0.45% NP40)60μl和蛋白酶K(10mg/m1)5μl，高速振荡至沉淀物混匀。55℃水浴2h，95℃水浴10min。扩增前5000rp离心10min。
, http://www.100md.com
2.PCR扩增 反应体系总体积20μl，内含：10×反应缓冲液2μl，2.5mMdNTP1.6μl，引物A和B(4μM，其中TPOX为2.7μM)各2μl,Taq聚合酶1μl(0.5μ)，蒸馏水9.4μl，模板DNA2μl。
3.PCR热循环条件 扩增在PE9600型扩增仪(美国PE公司)完成，热循环参数为：95℃×2min×1cycle,94℃×1min/60℃×1min/70℃×1min×10cycle;90℃×1min/60℃×1min/70℃×1min×20cycle;60℃×30min×1cycle。
4.电泳分离 银染显色及统计学计算，按余纯应等人方法进行。
5.分子量标记确定等位基因片段 电泳分离设置50bp梯阶对照和Φ174/HaeⅢ分子量标准对照，确定位点多态片段大小范围。
6.对一3代6人家系作FOLP23、TPOX及GABRB15位点分型；并对18例确定亲子关系的父母子真三联作FOLP23、TPOX及GABRB15位点分型。
, http://www.100md.com
结果
1.等位基因片段的确定 参照50bp梯阶对照及Φ174/HaeⅢ分子量标准，确定位点多态片段大小范围。FOLP23位点多态片段长度160-184bp，共检出6个等位基因；TPOX位点多态片段长度为232-248bp，检出5个等位基因；GABRB15位点多态性片段长度为150-178bp，检出5个等位基因(见照片1，2，3)。
, http://www.100md.com
照片1 FOLP23电泳分型结果(上为阴极)
Picture 1 Results of FOLP23 typing by electrophoresis
(upside is negative)
Lane1:1/3 Lane2:2/2 Lane3:3/3 Lane4:4/4
Lane5:5/5 Lane6:5/6
, 百拇医药
照片2 TPOX电泳分型结果(上为阴极)
Picture 2 Results of TPOX typing by electrophoresis
(upside is negative)
Lane1:1/1 Lane2:2/4 Lane3:2/3
Lane4:2/4 Lane5:2/5
, http://www.100md.com
照片3 GABRB15电泳分型结果(上为阴极)
Picture 3 Results of GABRB15 typing by electrophoresis
(upside is negative)
Lane1:1/4 Lane2:2/3 Lane3:2/3
Lane4:4/4 Lane5:4/5
表1 汉族人群FOLP23、TPOX和GABRB15位点频率分布(N=20O)基因型数观察值
Table 1 The alleles frequencies of FOLP23, TPOX and GABRB15 in chinese Han Population (N=20D)
, 百拇医药
位点
基因数
基因频率(+SE%)
1
2
3
4
5
6
FOLP23
1
2
25
9
, 百拇医药
3
6
0
47
0.1277±1.6
2
46
32
8
25
0
182
0.4946±2.6
, 百拇医药
3
8
4
9
0
70
0.1902±2.0
4
1
2
0
19
0.0516±1.1
, 百拇医药 5
3
1
49
0.1331±2.3
6
0
1
0.0027±0.3
368 df=11 p>0.5
1
2
3
, 百拇医药
4
5
TPOX
1
64
7
5
86
2
228
0.5700±2.5
2
2
0
, 百拇医药
9
1
21
0.0525±1.1
3
0
1
0
6
0.0150±0.6
4
21
2
, http://www.100md.com 140
0.3500±2.4
5
0
5
0.0125±0.6
400 df=7 p>0.1
1
2
3
4
5
GABRB15
, 百拇医药
1
1
6
5
3
3
19
0.0475±1.1
2
31
69
17
10
164
, 百拇医药
0.4100±2.5
3
21
14
9
139
0.3475±2.4
4
5
3
47
0.1175±1.6
5
, http://www.100md.com
3
31
0.0775±1.8
表2 汉族人群FOLP23、TPOX、GABRB15位点的H、Dp、PIC和PE值
Table 2 The Heterozygosity, Probability of discrimination, Polymorphic information content and probabilty of exclusion of FOLP23, TPOX and GABRB15 in Chinese Han population
位点
H
Dp
, 百拇医药
PIC
PE
观察值
期望值(+SE)
FOLP23
0.6798
0.6881
0.8594
0.6385
0.4531
TPOX
0.5650
0.5508
, http://www.100md.com
0.6975
0.4625
0.2745
GABRB15
0.6950
0.6891
0.8262
0.5965
0.4079
2.一3代6人家系及18例已确定亲生关系的父母子FOLP23、TPOX和GABRB15三位点分型证实三位点等位基因传递均符合孟德尔遗传规律。 讨论
短串联重复系列(STR)是一类重复单位为2-5bp的微卫星DNA，广泛分布在人类基因组中，Edwards等(1991)建立了PCR-STR分型技术，研究发现三核苷酸和四核苷酸STR中约有一半具有遗传学多态性，证实STR基因座呈共显性等位基因遗传特征，且四核苷酸STR基因座稳定性好。由于具有多态性STR基因座的片段长度一般集中在100-400bp，因此应用PCR技术扩增检测灵敏度高，尤适用于微量陈旧的腐败材料的个人识别鉴定，且可将多个STR位点进行同步或复合扩增。PCR-STR分型已成为法医物证学应用研究的热点。
, 百拇医药
本文对200例武汉地区汉族人血液DNA进行上述三位点扩增，采用T6%C5%PAGE电泳分离PCR扩增产物，设置50bp阶梯长度标记作对照，按照扩增出片段长度由短到长排列，确定FOLP23位点有6个等位基因，TPOX位点有5个等位基因，GABRB15位点有5个等位基因。对三个STR位点结果作卡方检验，各位点基因型的观察值与期望值吻合度良好，符合Handy-Weinberg平衡。经计算上述三位点H、Dp、PIC和PE值(结果见表2)结果显示三位点Dp值均大于0.5，属于高分辨能力类标记系统。由于三位点分别位于三个不同的染色体上，故无连锁遗传关系。如果同步扩增三位点累计Dp达0.9927，累计非父排除概率达0.7651。通过对一3代6人家系调查显示FOLP23、TPOX和GABRB15三位点的等位基因传递符合孟德尔分离律。经30例亲子鉴定案件检验中试用上述三位点，显示出了较高的适用价值。
建立合适的扩增条件是确保扩增产物特异性的关键，这受多方面因素的影响，如引物浓度，Taq酶的浓度，MgC12的浓度，模板DNA的多少以及退火温度等等，其中退火温度和延伸温度至关重要，它决定于引物长度及其碱基组成。我室曾采用文献中介绍的引物及循环参数在PE-480型扩增仪上扩增取得较好效果，后在PE-9600扩增仪上扩增却出现了较多的非特异性杂带，后将文献中介绍的延伸时间由原来的1.5分钟缩补至1分钟重新扩增，取得了较为满意的结果，这可能与两种仪器升降温的机制不同有关。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Su ong Park, et al.Genetic Variations at FourTetrameric Tandem Repeat Loci in Korean Population. J Forensic sic,1994,4:125
[2]Nu En Huang et al.Chinese population data on three tetrameric short tandem repeat Loci-HUMTH01,TPOX and CSFLPO-derived using multplex PCR and manual typing. Forensic Sci Inter,1995,71:131
[3]余纯应，等.汉族人群五个STR基因座的多态性研究.中国法医学杂志，1997，2：69
[4]Edwards A.Civitello A.Hammond HA.et al.DNA typing and geneic mapping witrimeric and tetrameric tanden repeats.Am J Hum Genet,1991,49:746
收稿日期：1999-05-24
修改日期：1999-10-27, 百拇医药
单位：孙文清(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；潘良胜(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；周高举(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；张正武(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；蔺启英(湖北省武汉市中级人民法院技术处，430015)；杨庆恩(同济医科大学法医学系，武汉，430030)；余纯应(同济医科大学法医学系，武汉，430030)
关键词：短串联重复序列；聚合酶链反应；遗传学多态性；基因频率
武汉汉族群体FOLP23 摘 要：目的 研究FOLP23、TPOX及GABRB15的多态性及法医学应用价值。方法 应用聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及银染显带技术对武汉地区汉族200例无关个体作FOLP23、TPOX及GABRB15位点分型调查。结果 FOLP23、TPOX及GABRB15位点分别检出6、5和5个等位基因，获得汉族人群基因频率分布。三位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。位点杂合度分别为0.6798、0.5650、0.6950，个人识别能力分别为0.8594、0.6975和0.8262，非父排除率分别为0.4531、0.2745、0.4079。结论 FOLP23、TPOX及GABRB15位点均是高杂合度、高鉴别能力的遗传标记系统，具有较高的法医学应用价值。}
, http://www.100md.com
分类号：D919.2；Q75 文献标识码：A
文章编号：1007-9297(2000)01-0009-04
Polymorphism of FOLP23、TPOX and GABRB15 in Wuhan area Han population.
SUN Wen-qing PAN Liang-sheng ZHUO Gao-ju
(WuHan Intermediate Peoples' Court. WuHan 430015.)
Abstract：Objective To investigate polymorphism of STR loci FOLP23、 TPOX and GABRB15 and availability in forensic science. Methods 200 unrelative individuals of Han population living in Wuhan area were examined using PCR followed by PAGE and silver stains. Results 6 alleles of FOLP23, 5 alleles of TPOX and 5 alleles of GABRB15 were identified respectively. The patter of allele frequencies in FOLP23, TPOX and GABRB15 in Han population was obtained. The distributions of genotypes in three loci are good agreement with Hardy Weinbgrg equilibrium. The heterozyosity of FOLP23, TPOX and GABRB15 are 0.8594、 0.6975 and 0.8262, the DPP are 0.4531、0.2745、0.4079. Conclusion The results in this study show that FOLP23, TPOX and GABRB15 loci are valuable STR genetic marker system in the fields of forensic science and genetics.
, http://www.100md.com
Key Words：STR Polymerase Chain Reaction Genetic Polymorphism▲
FOLP23、TPOX及GABRB15短串联重复序列分别定位于人类第6、2和4号染色体，有关上述三个STR基因座中国武汉地区汉族群体中基因频率分布状态未见报道。本文应用PCR、PAGE技术对STR位点FOLP23、TPOX及GABRB15作了分型研究，对武汉地区汉族200例无关个体群体调查，获得三位点的基因频率分布，为人类群体遗传学研究提供参考数据。现报告如下：
材料与方法
一、材料
1.血样 200名汉族无关个体的EDTA抗凝血由武汉同济医院血库提供。一个三代六口人家系血样从自愿者采集；18例经常规血型测定确定亲生关系的父母子血样系本实验亲子鉴定案件中所收集。
, http://www.100md.com
2.引物 3个STR位点扩增引物均由Bio-tech公司合成，引物系列如下：
HUMFOLP23位点引物[1]：
A:5’-ATTGTAAGACTTTTGGAGCCATTT-3’
B:5’-TTCAGGGAGAATGAGATGGGC-3’
HUMTPOX位点引物[2]：
A:5’-ACTGGCACAGAACAGGCACCTAGG-3’
B:5-GGAGGAACTGGGAACCACACAGGT-3’
HUMGABRB15位点引物[1]：
, 百拇医药
A:5’-CTAGAAAGCTAGCAAGGTGGAT-3’
B:5’-GCTCATTAAACACTGTGTTCCT-3’
二、实验方法
1.DNA样品制备 取EDTA抗凝全血200μl，加裂解缓冲液〔0.32M蔗糖/10MTris.HCL(PH7.5)/5mMMgCl2/1%TritonX-100〕600μl混匀后13000rp离心20秒弃上清液；沉淀物重新悬浮于600μl裂解缓冲液中；重复洗涤、离心步骤至血红蛋白除净。沉淀物中加入非离子去污剂的PCR缓冲液(50mM KCL/10mM Tris.HCL PH8.0/2.5mM MgCl2/0.1mg/m1白明胶/0.45%吐温20/0.45% NP40)60μl和蛋白酶K(10mg/m1)5μl，高速振荡至沉淀物混匀。55℃水浴2h，95℃水浴10min。扩增前5000rp离心10min。
, http://www.100md.com
2.PCR扩增 反应体系总体积20μl，内含：10×反应缓冲液2μl，2.5mMdNTP1.6μl，引物A和B(4μM，其中TPOX为2.7μM)各2μl,Taq聚合酶1μl(0.5μ)，蒸馏水9.4μl，模板DNA2μl。
3.PCR热循环条件 扩增在PE9600型扩增仪(美国PE公司)完成，热循环参数为：95℃×2min×1cycle,94℃×1min/60℃×1min/70℃×1min×10cycle;90℃×1min/60℃×1min/70℃×1min×20cycle;60℃×30min×1cycle。
4.电泳分离 银染显色及统计学计算，按余纯应等人方法进行。
5.分子量标记确定等位基因片段 电泳分离设置50bp梯阶对照和Φ174/HaeⅢ分子量标准对照，确定位点多态片段大小范围。
6.对一3代6人家系作FOLP23、TPOX及GABRB15位点分型；并对18例确定亲子关系的父母子真三联作FOLP23、TPOX及GABRB15位点分型。
, http://www.100md.com
结果
1.等位基因片段的确定 参照50bp梯阶对照及Φ174/HaeⅢ分子量标准，确定位点多态片段大小范围。FOLP23位点多态片段长度160-184bp，共检出6个等位基因；TPOX位点多态片段长度为232-248bp，检出5个等位基因；GABRB15位点多态性片段长度为150-178bp，检出5个等位基因(见照片1，2，3)。
, http://www.100md.com
照片1 FOLP23电泳分型结果(上为阴极)
Picture 1 Results of FOLP23 typing by electrophoresis
(upside is negative)
Lane1:1/3 Lane2:2/2 Lane3:3/3 Lane4:4/4
Lane5:5/5 Lane6:5/6
, 百拇医药
照片2 TPOX电泳分型结果(上为阴极)
Picture 2 Results of TPOX typing by electrophoresis
(upside is negative)
Lane1:1/1 Lane2:2/4 Lane3:2/3
Lane4:2/4 Lane5:2/5
, http://www.100md.com
照片3 GABRB15电泳分型结果(上为阴极)
Picture 3 Results of GABRB15 typing by electrophoresis
(upside is negative)
Lane1:1/4 Lane2:2/3 Lane3:2/3
Lane4:4/4 Lane5:4/5
表1 汉族人群FOLP23、TPOX和GABRB15位点频率分布(N=20O)基因型数观察值
Table 1 The alleles frequencies of FOLP23, TPOX and GABRB15 in chinese Han Population (N=20D)
, 百拇医药
位点
基因数
基因频率(+SE%)
1
2
3
4
5
6
FOLP23
1
2
25
9
, 百拇医药
3
6
0
47
0.1277±1.6
2
46
32
8
25
0
182
0.4946±2.6
, 百拇医药
3
8
4
9
0
70
0.1902±2.0
4
1
2
0
19
0.0516±1.1
, 百拇医药 5
3
1
49
0.1331±2.3
6
0
1
0.0027±0.3
368 df=11 p>0.5
1
2
3
, 百拇医药
4
5
TPOX
1
64
7
5
86
2
228
0.5700±2.5
2
2
0
, 百拇医药
9
1
21
0.0525±1.1
3
0
1
0
6
0.0150±0.6
4
21
2
, http://www.100md.com 140
0.3500±2.4
5
0
5
0.0125±0.6
400 df=7 p>0.1
1
2
3
4
5
GABRB15
, 百拇医药
1
1
6
5
3
3
19
0.0475±1.1
2
31
69
17
10
164
, 百拇医药
0.4100±2.5
3
21
14
9
139
0.3475±2.4
4
5
3
47
0.1175±1.6
5
, http://www.100md.com
3
31
0.0775±1.8
表2 汉族人群FOLP23、TPOX、GABRB15位点的H、Dp、PIC和PE值
Table 2 The Heterozygosity, Probability of discrimination, Polymorphic information content and probabilty of exclusion of FOLP23, TPOX and GABRB15 in Chinese Han population
位点
H
Dp
, 百拇医药
PIC
PE
观察值
期望值(+SE)
FOLP23
0.6798
0.6881
0.8594
0.6385
0.4531
TPOX
0.5650
0.5508
, http://www.100md.com
0.6975
0.4625
0.2745
GABRB15
0.6950
0.6891
0.8262
0.5965
0.4079
2.一3代6人家系及18例已确定亲生关系的父母子FOLP23、TPOX和GABRB15三位点分型证实三位点等位基因传递均符合孟德尔遗传规律。 讨论
短串联重复系列(STR)是一类重复单位为2-5bp的微卫星DNA，广泛分布在人类基因组中，Edwards等(1991)建立了PCR-STR分型技术，研究发现三核苷酸和四核苷酸STR中约有一半具有遗传学多态性，证实STR基因座呈共显性等位基因遗传特征，且四核苷酸STR基因座稳定性好。由于具有多态性STR基因座的片段长度一般集中在100-400bp，因此应用PCR技术扩增检测灵敏度高，尤适用于微量陈旧的腐败材料的个人识别鉴定，且可将多个STR位点进行同步或复合扩增。PCR-STR分型已成为法医物证学应用研究的热点。
, 百拇医药
本文对200例武汉地区汉族人血液DNA进行上述三位点扩增，采用T6%C5%PAGE电泳分离PCR扩增产物，设置50bp阶梯长度标记作对照，按照扩增出片段长度由短到长排列，确定FOLP23位点有6个等位基因，TPOX位点有5个等位基因，GABRB15位点有5个等位基因。对三个STR位点结果作卡方检验，各位点基因型的观察值与期望值吻合度良好，符合Handy-Weinberg平衡。经计算上述三位点H、Dp、PIC和PE值(结果见表2)结果显示三位点Dp值均大于0.5，属于高分辨能力类标记系统。由于三位点分别位于三个不同的染色体上，故无连锁遗传关系。如果同步扩增三位点累计Dp达0.9927，累计非父排除概率达0.7651。通过对一3代6人家系调查显示FOLP23、TPOX和GABRB15三位点的等位基因传递符合孟德尔分离律。经30例亲子鉴定案件检验中试用上述三位点，显示出了较高的适用价值。
建立合适的扩增条件是确保扩增产物特异性的关键，这受多方面因素的影响，如引物浓度，Taq酶的浓度，MgC12的浓度，模板DNA的多少以及退火温度等等，其中退火温度和延伸温度至关重要，它决定于引物长度及其碱基组成。我室曾采用文献中介绍的引物及循环参数在PE-480型扩增仪上扩增取得较好效果，后在PE-9600扩增仪上扩增却出现了较多的非特异性杂带，后将文献中介绍的延伸时间由原来的1.5分钟缩补至1分钟重新扩增，取得了较为满意的结果，这可能与两种仪器升降温的机制不同有关。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Su ong Park, et al.Genetic Variations at FourTetrameric Tandem Repeat Loci in Korean Population. J Forensic sic,1994,4:125
[2]Nu En Huang et al.Chinese population data on three tetrameric short tandem repeat Loci-HUMTH01,TPOX and CSFLPO-derived using multplex PCR and manual typing. Forensic Sci Inter,1995,71:131
[3]余纯应，等.汉族人群五个STR基因座的多态性研究.中国法医学杂志，1997，2：69
[4]Edwards A.Civitello A.Hammond HA.et al.DNA typing and geneic mapping witrimeric and tetrameric tanden repeats.Am J Hum Genet,1991,49:746
收稿日期：1999-05-24
修改日期：1999-10-27, 百拇医药