自体牙周膜细胞移植对狗牙周组织再生的影响
作者：欧龙 刘宏伟 庞劲凡 袁志萍 马良
单位：解放军总医院口腔科 北京 100853
关键词：细胞移植；引导组织再生；牙周膜细胞
中华口腔医学杂志000114 摘 要：目的 对应用自体牙周细胞移植结合e-PTFE膜引导的牙周组织再生的动物实验进行评价。方法 将6只成年狗的36颗牙分为实验组和对照组，每组18颗牙。在人工制造的牙周缺损中，进行体外培养的自体牙周细胞移植结合GTR法为实验组，单纯应用GTR法为对照组。6周后切片行牙周组织学观察。结果 实验组新生牙槽骨、牙周膜组织及牙骨质的修复再生效果明显好于对照组 ( P< 0.05)；实验组牙槽骨再生高度平均为(4.00±0.13)mm，对照组为(3.09±0.28)mm。结论 应用自体牙周膜细胞移植结合e-PTFE膜引导牙周组织再生可促进狗牙周组织的再生。
Effects of autogenous periodontal ligament cell transplantation on periodontal tissue regeneration in dogs
, http://www.100md.com
OU Long
( Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853，China)
LIU Hongwei
( Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853，China)
PANG Jinfan，et al.
( Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853，China)
Abstract：Objective To evaluate the effect of autogenous periodontal ligament cell (PDL) transplantation in periodontal tissue regeneration. Methods PDL cells derived from the same dog were cultured with α-MEM. 1×105 cells of first passage were allowed to attach to the collagen membrane for 24 hours.The membrane-cells were transplanted into periodontal defect in the same dog. Then the defects were covered with e-PTFE membranes. The defects covered only with e-PTFE were the controls. Eighteen teeth of 6 dogs for each group were included. The dogs were sacrificed after 6 weeks.Results The results showed that new bone formation (4.00±0.13)mm in test group was significantly higher than that of in control group (3.09±0.28)mm, P< 0.05. The new cementum formation in test group was better than control group (P< 0.05). Conclusion The results suggested that PDL cell transplantation with guided tissue regeneration technique could enhance periodontal tissue regeneration in dogs.
, 百拇医药
Key words：Cell transplantation；Guided tissue regeneration； Periodontal ligament cell▲
牙周膜细胞是牙周组织再生的主要细胞来源，参与组织再生细胞的数量和生物学活性是牙周组织再生的关键。在大面积牙槽骨缺损和老年牙周缺损中，再生细胞在数量和质量上的减少和生物学功能的减弱，是造成组织再生不足的主要原因之一。牙周细胞移植就是在此基础上提出的。我们对自体牙周细胞移植的动物实验进行观察，为牙周细胞移植应用于牙周缺损再生修复的可能性提供依据。
材料和方法
1. 实验动物：一级雄性成年狗6只，选取每只狗的
为受试牙，共36颗牙。
2. 拔除每只狗的上下切牙，在实验室内取其根面中1/3牙周膜组织进行原代细胞培养，培养液为内含15%小牛血清(FCS)和抗生素的α-MEM培养液。第1代细胞转移到18块6 mm ×2 mm的胶原膜上(中国医学科学院生物医学工程研究所提供)，平均每张胶原膜上有1×105个细胞，培养12 h后相差显微镜下观察细胞在膜上的附着情况。
, 百拇医药
3.实验分组：在狗的受试牙根颊侧制备骨缺损约6 mm，暴露颊侧根面，彻底刮除根面牙周膜组织，并在缺损底部根面制备切迹作为组织学测量点。将36颗牙分为2组，每组18颗牙，实验组：在骨缺损处植入附着细胞的胶原膜，细胞朝向根面，膜上覆盖e-PTFE膜材料(上海塑料研究所供)；对照组：在骨缺损上覆盖e-PTFE膜材料，不放置附着细胞的胶原膜，龈瓣复位，严密缝合。术后3 d内口腔清洁，肌注庆大霉素4万U/d，6周时处死动物，10%甲醛液行组织固定，脱钙后常规组织学切片，分别进行HE、胶原Masson和Mallory染色后，光镜下组织学观察，并分别测量牙槽骨上缘至根方切迹间距离(ED)；新生牙骨质高度(NC)；新生牙槽骨高度(NB)及新生结合上皮长度(JE)。
结果
牙周膜细胞转移到胶原膜上24 h后附着良好，细胞呈梭形。组织学观察可见，实验组有较多的新生牙槽骨(A)和牙骨质(B)及类牙周膜组织(C)形成，并有成排的骨细胞(D)和牙骨质细胞(E)位于表面，新生类牙周膜组织间隙内有较多的毛细血管以及胶原纤维(图1)；新生牙槽骨的钙化程度较低；e-PTFE膜保存完整(F)；膜根间隙内的胶原膜结构已消失(图2)。值得注意的是，在某些标本中的新生牙槽骨再生高度接近正常牙槽骨的高度，尽管可见骨再生的不连续现象，但基本形成了牙槽骨的完全再生。实验组的NC、NB高度均高于对照组(图3)，P< 0.05；而JE长度差异无显著性(P> 0.05)。其余各指标间差异均有显著性，P< 0.05(表1)。
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表1 实验组及对照组各项指标的测量结果(mm，
) 项目
ED
NC
NB
JE
实验组
5.39±0.05
3.64±0.16
4.00±0.13
1.47±0.20
对照组
, 百拇医药
6.06±0.25
2.72±0.33
3.09±0.28
1.62±0.24
P值
>0.05
<0.05
<0.05
>0.05
注：ED：牙槽骨上缘至根方切迹间的距离；NC：新生牙骨质高度；NB：新生牙槽骨高度；JE：新生结合上皮长度
, 百拇医药
图1 实验组可见有新生牙槽骨(A)、牙骨质(B)和类似牙周膜结构(C)的形成，并有骨细胞(D)、牙骨质细胞(E)存在，形成了完整的牙周结构，整体新生组织的钙化程度较低，作为移植细胞载体的胶原膜结构已消失(HE染色×10) 图2 实验组整体新生牙周组织形成高度接近正常的牙周组织高度，e-PTFE膜(F)保存完整(6周)(Masson染色×1) 图3 对照组可见引导再生的牙周组织未完全恢复到正常的牙周组织高度，e-PTFE膜保存完整(6周)(Mallory染色×1)
讨论
GTR技术的研究和临床应用发现，单纯GTR技术不能使牙周组织完全修复，尤其是在大面积牙槽骨缺损和老年牙周病中。体外实验结果表明：老年人牙周膜细胞中，可分化及可钙化细胞在数量和生物学功能上绝对或相对低下[1]，这可能与上述原因有关。Amar和Chung[2]认为，细胞生长因子和牙周干细胞移植与GTR方法的结合是牙周组织再生修复的发展方向，它可以弥补单纯GTR方法治疗的不足，使牙周组织再生达到较理想的效果。细胞移植修复组织缺损和恢复组织功能在医学的其他领域已有较大的发展，但在口腔医学中的研究和应用还是空白。本实验应用自体牙周细胞移植，避免组织的排异干扰，集中观察移植细胞对组织再生的作用。
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用于载体的胶原膜是中国医学科学院生物医学工程研究所生产的用于牙周GTR的材料，牙周膜细胞在其上生长良好，无明显的毒性或抑制作用[3，4]，其完全降解时间为4周。
本实验结果表明：进行自体细胞移植后，其GTR效果好于单纯应用e-PTFE膜。说明在单纯的膜覆盖情况下缺损部位的组织进行自身修复较缓慢，并受一定制约。较慢的组织生长速度就不可避免受到肌体内其他不利因素的干扰而影响组织的再生。作者以往的实验结果表明，在体外培养的牙周膜细胞中存在有多种表现型，其中存在较大数量的可参与组织再生的前体细胞(约占40%)[5]，这些细胞可能是造成实验组组织再生多于其他组的关键。牙周膜细胞的植入可使组织再生部位的细胞数量和生物活性增加，提高组织的再生速度和质量。牙周膜细胞移植的目的是为了在牙周缺损部位增加再生细胞的数量和生物学活性，促进细胞的诱导分化、组织形成[6，7]和再附着[8]。但本实验中移植细胞参与组织再生的机制尚不清楚，有待进一步揭示。实验组骨再生出现的不连续现象，可能与切片制作和局部移植细胞的数量有关，也可能是移植的牙周膜细胞呈岛状形成新骨。细胞移植的关键在于移植细胞的种类、功能等。因此，如何分离和培养合适的移植细胞，是细胞移植治疗牙周组织缺损的先决条件。
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总之，牙周膜细胞移植是一个在以往研究基础上发展起来的新课题。本实验结果表明，利用体外培养的群体细胞移植在狗牙周组织缺损部位，可明显促进牙槽骨的再生。移植细胞的种类将是关键因素，还有待进一步研究。
本文编辑：孔繁军■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770798)；国家教委留学回国人员科研启动基金资 助项目[外教司留(1997)436]
参考文献：
[1]刘宏伟，马良，欧龙，等. 年龄对牙周膜细胞克隆钙化表达的影响. 中华口腔医学杂志， 1998，33329-33331.
[2]Amar S，Chung KM. Clinical implications of cellular biologic advances in periodontal regeneration. Curr Opin Periodontol, 1994,128-140.
, 百拇医药
[3]Cortellini P, Pini Prato GP, Tonetti MS. No detrimental effect of fibrin glue on the regeneration of intrabony defects. A controlled clinical trial. J Clin Periodontol, 1995, 22:697-702.
[4]Tal H, Pitaru S, Moses O, et al. Collagen gel and membrane in guided tissue regeneration in periodontal fenestration defects in dogs. J Clin Periodontol, 1996 , 23:1-6.
[5]Liu HW, Yacobi R, Savion N, et al. A collagenous cementum-derived attachment protein is a marker for progenitors of the mineralized tissue-forming cell lineage of the periodontal ligament. J Bone Miner Res, 1997,12:1691-1699.
, http://www.100md.com
[6]Preisig E, Schroeder HE.Long-term culture of human periodontal ligament cells with autologous root discs. J Periodontal Res , 1988 , 23:211-221.
[7]Lang H, Schuler N, Arnhold S, et al. Formation of differentiated tissues in vivo by periodontal cell populations cultured in vitro. J Dent Res, 1995,74:1219-1225.
[8]Melcher AH,Cheong T, Cox J, et al. Synthesis of cementum-like tissue in vitro by cells cultured from bone:a light and electron microscope study. J Periodontal Res, 1986, 21:592-612.
收稿日期:1998-10-19, 百拇医药
单位：解放军总医院口腔科 北京 100853
关键词：细胞移植；引导组织再生；牙周膜细胞
中华口腔医学杂志000114 摘 要：目的 对应用自体牙周细胞移植结合e-PTFE膜引导的牙周组织再生的动物实验进行评价。方法 将6只成年狗的36颗牙分为实验组和对照组，每组18颗牙。在人工制造的牙周缺损中，进行体外培养的自体牙周细胞移植结合GTR法为实验组，单纯应用GTR法为对照组。6周后切片行牙周组织学观察。结果 实验组新生牙槽骨、牙周膜组织及牙骨质的修复再生效果明显好于对照组 ( P< 0.05)；实验组牙槽骨再生高度平均为(4.00±0.13)mm，对照组为(3.09±0.28)mm。结论 应用自体牙周膜细胞移植结合e-PTFE膜引导牙周组织再生可促进狗牙周组织的再生。
Effects of autogenous periodontal ligament cell transplantation on periodontal tissue regeneration in dogs
, http://www.100md.com
OU Long
( Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853，China)
LIU Hongwei
( Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853，China)
PANG Jinfan，et al.
( Department of Stomatology, General Hospital of PLA, Beijing 100853，China)
Abstract：Objective To evaluate the effect of autogenous periodontal ligament cell (PDL) transplantation in periodontal tissue regeneration. Methods PDL cells derived from the same dog were cultured with α-MEM. 1×105 cells of first passage were allowed to attach to the collagen membrane for 24 hours.The membrane-cells were transplanted into periodontal defect in the same dog. Then the defects were covered with e-PTFE membranes. The defects covered only with e-PTFE were the controls. Eighteen teeth of 6 dogs for each group were included. The dogs were sacrificed after 6 weeks.Results The results showed that new bone formation (4.00±0.13)mm in test group was significantly higher than that of in control group (3.09±0.28)mm, P< 0.05. The new cementum formation in test group was better than control group (P< 0.05). Conclusion The results suggested that PDL cell transplantation with guided tissue regeneration technique could enhance periodontal tissue regeneration in dogs.
, 百拇医药
Key words：Cell transplantation；Guided tissue regeneration； Periodontal ligament cell▲
牙周膜细胞是牙周组织再生的主要细胞来源，参与组织再生细胞的数量和生物学活性是牙周组织再生的关键。在大面积牙槽骨缺损和老年牙周缺损中，再生细胞在数量和质量上的减少和生物学功能的减弱，是造成组织再生不足的主要原因之一。牙周细胞移植就是在此基础上提出的。我们对自体牙周细胞移植的动物实验进行观察，为牙周细胞移植应用于牙周缺损再生修复的可能性提供依据。
材料和方法
1. 实验动物：一级雄性成年狗6只，选取每只狗的
为受试牙，共36颗牙。2. 拔除每只狗的上下切牙，在实验室内取其根面中1/3牙周膜组织进行原代细胞培养，培养液为内含15%小牛血清(FCS)和抗生素的α-MEM培养液。第1代细胞转移到18块6 mm ×2 mm的胶原膜上(中国医学科学院生物医学工程研究所提供)，平均每张胶原膜上有1×105个细胞，培养12 h后相差显微镜下观察细胞在膜上的附着情况。
, 百拇医药
3.实验分组：在狗的受试牙根颊侧制备骨缺损约6 mm，暴露颊侧根面，彻底刮除根面牙周膜组织，并在缺损底部根面制备切迹作为组织学测量点。将36颗牙分为2组，每组18颗牙，实验组：在骨缺损处植入附着细胞的胶原膜，细胞朝向根面，膜上覆盖e-PTFE膜材料(上海塑料研究所供)；对照组：在骨缺损上覆盖e-PTFE膜材料，不放置附着细胞的胶原膜，龈瓣复位，严密缝合。术后3 d内口腔清洁，肌注庆大霉素4万U/d，6周时处死动物，10%甲醛液行组织固定，脱钙后常规组织学切片，分别进行HE、胶原Masson和Mallory染色后，光镜下组织学观察，并分别测量牙槽骨上缘至根方切迹间距离(ED)；新生牙骨质高度(NC)；新生牙槽骨高度(NB)及新生结合上皮长度(JE)。
结果
牙周膜细胞转移到胶原膜上24 h后附着良好，细胞呈梭形。组织学观察可见，实验组有较多的新生牙槽骨(A)和牙骨质(B)及类牙周膜组织(C)形成，并有成排的骨细胞(D)和牙骨质细胞(E)位于表面，新生类牙周膜组织间隙内有较多的毛细血管以及胶原纤维(图1)；新生牙槽骨的钙化程度较低；e-PTFE膜保存完整(F)；膜根间隙内的胶原膜结构已消失(图2)。值得注意的是，在某些标本中的新生牙槽骨再生高度接近正常牙槽骨的高度，尽管可见骨再生的不连续现象，但基本形成了牙槽骨的完全再生。实验组的NC、NB高度均高于对照组(图3)，P< 0.05；而JE长度差异无显著性(P> 0.05)。其余各指标间差异均有显著性，P< 0.05(表1)。
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表1 实验组及对照组各项指标的测量结果(mm，
) 项目ED
NC
NB
JE
实验组
5.39±0.05
3.64±0.16
4.00±0.13
1.47±0.20
对照组
, 百拇医药
6.06±0.25
2.72±0.33
3.09±0.28
1.62±0.24
P值
>0.05
<0.05
<0.05
>0.05
注：ED：牙槽骨上缘至根方切迹间的距离；NC：新生牙骨质高度；NB：新生牙槽骨高度；JE：新生结合上皮长度
, 百拇医药
图1 实验组可见有新生牙槽骨(A)、牙骨质(B)和类似牙周膜结构(C)的形成，并有骨细胞(D)、牙骨质细胞(E)存在，形成了完整的牙周结构，整体新生组织的钙化程度较低，作为移植细胞载体的胶原膜结构已消失(HE染色×10) 图2 实验组整体新生牙周组织形成高度接近正常的牙周组织高度，e-PTFE膜(F)保存完整(6周)(Masson染色×1) 图3 对照组可见引导再生的牙周组织未完全恢复到正常的牙周组织高度，e-PTFE膜保存完整(6周)(Mallory染色×1)
讨论
GTR技术的研究和临床应用发现，单纯GTR技术不能使牙周组织完全修复，尤其是在大面积牙槽骨缺损和老年牙周病中。体外实验结果表明：老年人牙周膜细胞中，可分化及可钙化细胞在数量和生物学功能上绝对或相对低下[1]，这可能与上述原因有关。Amar和Chung[2]认为，细胞生长因子和牙周干细胞移植与GTR方法的结合是牙周组织再生修复的发展方向，它可以弥补单纯GTR方法治疗的不足，使牙周组织再生达到较理想的效果。细胞移植修复组织缺损和恢复组织功能在医学的其他领域已有较大的发展，但在口腔医学中的研究和应用还是空白。本实验应用自体牙周细胞移植，避免组织的排异干扰，集中观察移植细胞对组织再生的作用。
, http://www.100md.com
用于载体的胶原膜是中国医学科学院生物医学工程研究所生产的用于牙周GTR的材料，牙周膜细胞在其上生长良好，无明显的毒性或抑制作用[3，4]，其完全降解时间为4周。
本实验结果表明：进行自体细胞移植后，其GTR效果好于单纯应用e-PTFE膜。说明在单纯的膜覆盖情况下缺损部位的组织进行自身修复较缓慢，并受一定制约。较慢的组织生长速度就不可避免受到肌体内其他不利因素的干扰而影响组织的再生。作者以往的实验结果表明，在体外培养的牙周膜细胞中存在有多种表现型，其中存在较大数量的可参与组织再生的前体细胞(约占40%)[5]，这些细胞可能是造成实验组组织再生多于其他组的关键。牙周膜细胞的植入可使组织再生部位的细胞数量和生物活性增加，提高组织的再生速度和质量。牙周膜细胞移植的目的是为了在牙周缺损部位增加再生细胞的数量和生物学活性，促进细胞的诱导分化、组织形成[6，7]和再附着[8]。但本实验中移植细胞参与组织再生的机制尚不清楚，有待进一步揭示。实验组骨再生出现的不连续现象，可能与切片制作和局部移植细胞的数量有关，也可能是移植的牙周膜细胞呈岛状形成新骨。细胞移植的关键在于移植细胞的种类、功能等。因此，如何分离和培养合适的移植细胞，是细胞移植治疗牙周组织缺损的先决条件。
, http://www.100md.com
总之，牙周膜细胞移植是一个在以往研究基础上发展起来的新课题。本实验结果表明，利用体外培养的群体细胞移植在狗牙周组织缺损部位，可明显促进牙槽骨的再生。移植细胞的种类将是关键因素，还有待进一步研究。
本文编辑：孔繁军■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770798)；国家教委留学回国人员科研启动基金资 助项目[外教司留(1997)436]
参考文献：
[1]刘宏伟，马良，欧龙，等. 年龄对牙周膜细胞克隆钙化表达的影响. 中华口腔医学杂志， 1998，33329-33331.
[2]Amar S，Chung KM. Clinical implications of cellular biologic advances in periodontal regeneration. Curr Opin Periodontol, 1994,128-140.
, 百拇医药
[3]Cortellini P, Pini Prato GP, Tonetti MS. No detrimental effect of fibrin glue on the regeneration of intrabony defects. A controlled clinical trial. J Clin Periodontol, 1995, 22:697-702.
[4]Tal H, Pitaru S, Moses O, et al. Collagen gel and membrane in guided tissue regeneration in periodontal fenestration defects in dogs. J Clin Periodontol, 1996 , 23:1-6.
[5]Liu HW, Yacobi R, Savion N, et al. A collagenous cementum-derived attachment protein is a marker for progenitors of the mineralized tissue-forming cell lineage of the periodontal ligament. J Bone Miner Res, 1997,12:1691-1699.
, http://www.100md.com
[6]Preisig E, Schroeder HE.Long-term culture of human periodontal ligament cells with autologous root discs. J Periodontal Res , 1988 , 23:211-221.
[7]Lang H, Schuler N, Arnhold S, et al. Formation of differentiated tissues in vivo by periodontal cell populations cultured in vitro. J Dent Res, 1995,74:1219-1225.
[8]Melcher AH,Cheong T, Cox J, et al. Synthesis of cementum-like tissue in vitro by cells cultured from bone:a light and electron microscope study. J Periodontal Res, 1986, 21:592-612.
收稿日期:1998-10-19, 百拇医药