NA含量和AgNOR定量研究腮腺混合瘤细胞增殖活性的价值
作者：陈伟良 李海刚 陈光晔 孔庆瑜
单位：陈伟良(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科 510120)；李海刚(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科 510120)；陈光晔(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔颌面病理科 510120)；孔庆瑜(附属一院流式细胞仪室)
关键词：腮腺肿瘤；DNA含量；核仁形成区
口腔颌面外科杂志000112 摘 要：目的 为了评价DNA含量和AgNOR定量在研究腮腺混合瘤细胞增殖活性的价值。方法 对60例良性无复发、复发和恶性腮腺混合瘤用流式细胞仪和银染色核形成技术作DNA含量和AgNOR定量测定。结果 异倍体率，高S期细胞比率(SPF)率，AgNOR大小和分布在无复发与复发组间无显著差异，而良性与恶性肿瘤间有显著差异；AgNOR数目和形态各组间有显著差异；高SPF率与AgNOR均能反映其细胞增殖活性。结论 高SPF率和AgNOR对良恶性混合瘤的鉴别有重要价值；AgNOR颗粒数目和形态对良性混合瘤的复发有较高估测价值。
, 百拇医药
分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1005-4979(2000)01-0038-03
EVALUATION OF DNA CONTENTS AND AgNOR IN STUDY OF CELLULAR
PROLIFERATIVE ACTIVITY OF PAROTIC GLAND MIXED TUMOR
CHEN Wei-liang, LI Hai-gaung, KONG Qin-yu, CHEN Gaung-ye
Depatment of Oral and Maxillo-facial Surgery, Sun Yat-Sen Memorial Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
, 百拇医药
Abstract： Objectives For the purpose of evaluating the value of DNA contents and AgNOR in cellular proliferative activity of parotic gland mixed tumor.Methods The DNA contents and AgNOR were analysed by flow cytometry and silver staining nucleolar technique for sixty cases of benign unrecurrent, recurrent and malignant parotic gland mixed tumor.Results There were no sinificant difference in incidence of aneuploid and highs synithesis phase fraction (SPF), the size and distribution of AgNOR between unrecurrent and recurrent tumors, and there were sinificant difference between benign and malignant tumors, and there were singnificant differenct in the number and shape of AgNOR between the groups, and a linear positive correlation was observed between that obvious positive correlation was observed between highs SPF and number of AgNOR.Conclusions Both DNA contents and AgNOR can reflet the cellular proliferative activity and play a important role in distiguishing benign and malignant mixed tumors, that the number and shape of AgNOR are useful for juding the recurrent of mixed tumor.
, 百拇医药
Key words： parotic gland neoplesms/pathology; DNA contents; nucleolus organizer region
国内外已有用流式细胞测量术(flow cytometry, FCM)或银染色核形成区(silver staining nucleolar organiger region, AgNOR)技术，对涎腺混合瘤作DNA含量或AgNOR定量分析，研究其细胞增殖活性[1～3]。但未见两种技术的比较研究报告。作者用FCM国际统一新标准[4]和Ploton等[5]改良一步法对良性和恶性混合瘤分别作DNA含量测量和AgNOR计数，旨在比较两技术在研究其细胞增殖活性的临床价值。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
选用经病理诊断为腮腺混合瘤石蜡包埋标本60例。经5～14年随访，良性腮腺混合瘤无复发33例和复发11例(原发瘤标本)，恶性16例。良性者行肿瘤包膜外切除，恶性者作腮腺全切除。
1.2 DNA含量测定
1.2.1 单细胞悬液样品制备 将石腊包埋标本切取50μm厚的组织5张，二甲苯室温下脱蜡，用100%、95%、70%、50%乙醇和蒸馏水度水化。用胃蛋白酶消化组织。300目不锈钢网过滤，经漂洗，低速离心(500r/min×2min)，除去细胞碎片后，得到单细胞悬液。细胞数大于105/ml。再用溴化乙啶(EB)染色后上机测量。
1.2.2 DNA的FCM分析 用EPICS ELITE型流式细胞仪(Coulter公司)，2W氩离子激光器，波长488mm，输出功率300mW。实验前先用EB染色的鸡红细胞悬液作为较准仪器的标准样品，使变异系数(CV)值小于4%。测量结果用Multycyle软件在计算机上拟出细胞各时相(G0/G1、S和G2M)分布。
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1.2.3 DNA倍体性的判断标准与S期细胞比率分组 用DNA指数(DNA Index,DI)表示细胞DNA含量。DI是样品细胞与对照组细胞G0/G1峰均值的比值。以正常腮腺组织细胞DNA含量为二倍体标准(DI=1.0)。二倍体和近二倍体肿瘤细胞DI范围为0.85～1.15。在此范围以外均为异倍体肿瘤。根据全组S期细胞比率(synthesis phase fraction, SPF)的平均值分组，高于平均值者为高SPF。
1.3 AgNOR定量测定
1.3.1 AgNOR染色 将石蜡包埋标本切取4μm组织片，经脱蜡，梯度乙醇水化。用2%明胶甲酸溶液和50%硝酸银溶液按1∶2临用前制成染液。20℃恒温下避光染色40min后，去离子水洗，梯度酒精脱水，二甲本透明，树胶封片。
1.3.2 AgNOR计数 按Crocker推荐方法[6]油镜下于肿瘤细胞密集区随机计数100个肿瘤细胞，其指标如下。(1) 数目：计数每个细胞核内AgNOR颗粒数，求出平均值。(2) 大小：对每个细胞核内AgNOR颗粒用C2型2n网型测微尺(上海第三光学仪器厂)测量其直径，直径大于0.5μm为大颗粒，直径小于或等于0.5μm为小颗粒，记录颗粒大小数，求出平均值。(3) 形态：颗粒分为规则型AgNOR(圆形和近似圆形，边缘光滑)和异形(杆状，多边和奇异形等)。记录每例异形颗粒比例，求出均值。(4) 分布：根据AgNOR颗粒在核内所处的位置，分为中央位(细胞长、短径连线中点)，周边位(紧贴或位于核膜上)和偏中位(中央位与周边位之间)，记录每例周边位与中央位和偏中央位之比，求出均值。
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2 结果
2.1 DNA含量
无复发组、复发组和恶性组肿瘤异 体率分别为12.1%(4/33)，27.3(3/11)和68.8%(11/16)；高PSF率(最低为4.0%，最高为29.5%，平均17.8%)分别为9.1%、27.3%和87.5%。经χ2检验，异倍体率和高SPF率，无复发与复发组比较P>0.05；恶性与无复发或复发组比较，异倍体P<0.05，高SPF，P<0.01。
2.2 AgNOR定量
标本经AgNOR染色后，胞浆呈淡黄色，核呈深黄色，AgNOR呈棕黑色颗粒。图1、2和3分别显示油镜下无复发，复发和恶性腮腺混合瘤的AgNOR颗粒。其颗粒数目、大小比值、周边与中位加偏中比值和异形与规则比值的均值见附表。
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图1 无复发瘤显示核中AgNOR颗粒1～3个，多为圆形AgNOR (×400)
图2 复发瘤显示核中AgNOR颗粒1～3个，可见少数不规划形AgNOR (×400)
图3 恶性瘤显示核中AgNOR颗粒2～5个，多为不规则形AgNOR (×400)
附表1 无复发、复和和恶性组AgNOR计数(x±s) AgNOR
良 性
恶性组
无复发组
, 百拇医药
复发组
数目(个/核)*
2.54±0.32
2.93±0.30
3.15±0.29
大/小**
4.15±0.50
2.40±0.78
1.95±0.97
周/中+偏**
0.38±0.15
, 百拇医药
0.48±0.10
0.53±0.13
异形/规则*
0.25±0.10
0.37±0.14
0.77±0.25
t检验：* 各组间比较P<0.05；** 良性与恶性比较P<0.052.3 DNA含量与AgNOR定量关系
将各组高SPF率与相应组别的AgNOR数目作相关系数显著检验：t=0.972,P<0.05。
3 讨论
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细胞分裂增殖的实质是DNA复制，染色体倍增。测量肿瘤细胞DNA倍体水平可反映细胞增殖情况，也可作为恶性肿瘤的标志之一。Martin等报告[3]，良性涎腺混合瘤无复发者异倍体率为12.5%，复发者为37.5%。国内报告分别高达33%和67%[1]。本研究结果，无复发和复发腮腺混合瘤异倍体纺较前两者报告的低，分别为12.1%和27.3%。这可能与国内外应用FCM作肿瘤研究的标准未统一，缺乏共识有关。尽管这样，本研究结果仍能反映腮腺混合瘤细胞的增殖活性。近年来，SPF被推荐为肿瘤增殖的估测指标[4]。本结果，无复发和复发腮腺混合瘤高SPE率分别为9.1%和27.3%。由于良性肿瘤异倍体率和高SPF率在无复发和复发组间无显著性差异(P>0.05)。而用DNA含量测定作为估测其复发的可能性的价值不大。恶性组异倍体率和高SPF率为68.8%和87.5%，显著高于无复发和复发的良性肿瘤。异倍体率与Chen[7]报告的62%非常接近。作者用同一标准测量到的舌鳞癌异倍体率和高SPF率为51.3%和62.5%[8]。可见，恶性腮腺混合瘤增殖活性异常活跃，其活跃程度可能高于舌鳞癌。DNA含量测定特别是SPF作为鉴别良恶性腮腺混合瘤有重要价值。
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本研究结果，无复发组，复发组和恶性组肿瘤细胞核内AgNOR数目递增。各组间有显著性差异(P<0.05)，与高SPF率呈显著正相关关系(P<0.05)。与汪说之等[2]报告的一致。表明AgNOR计数能较好地反映腮腺混合瘤的增殖状态。AgNOR数目越多，细胞增殖活性越强。Underwood等认为[9]，AgNOR颗粒分散于细胞核中；细胞倍体数增加以及rDNA转录活动增加导致原来不明显的AgNOR变得明显可见有关。AgNOR颗粒形态，异形与规则的比值与颗粒一样各组间有显著性差异，这与倍体性和SPF不同，后两者在无复发组与复发组间无统计学差异。作者认为，AgNOR颗粒数目和异形与规则比值，除可作为鉴别良恶性肿瘤外，还可估测良性腮腺混合瘤复发的可能性。AgNOR大小比值和周边位与中位加偏中位比在良性和恶性肿瘤间存在差异，作为鉴别良恶性腮腺混合瘤亦有临床价值。
本文校正：史宏男
作者简介：陈伟良(1957-)，男，副教授，硕士导师。近年发表论文三十多篇，1998年赴美国洛杉矾加州大学研修口腔颌面外科
, 百拇医药
参考文献：
[1] 杨建荣，张圆，周振英.腮腺混合瘤细胞核DNA含量与复发癌变关系的初步研究[J].口腔医学，1995，15(1)：9.
[2] 汪说之，李铁军.涎腺肿瘤中核仁组织导体区的定量研究[J].中华口腔医学杂志，1992，27(2)：74.
[3] Martin AR, Mantravadi J, Kotylo PK. Proliferative activity and aneuploidy in pleomorphic adenomas of the salivary plands [J]. Arch Pathol Lab Med, 1994, 118(3):252.
[4] 李正生，综述.恶性肿瘤流式细胞测量术国际统一标准[J].国外医学肿瘤分册，1994，21(4)：209.
, 百拇医药
[5] Ploton D, Menager M, Jeannesson P. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic protein of the nucleolar organizer region at the optical level [J]. J Histochem, 1986, 18(1):5.
[6] Crocher J, Boldy DA, Egan MJ. How should we count AgNORs? Proposale for a standarized approach [J]. J Pathol, 1989, 158(3):185.
[7] Chen RB. Flow cytomelric analsis of benign and malignant tumors of the oral and maxillofacial region [J]. J Oral Maxilloface Surg, 1989, 47(6):596.
[8] 陈伟良，任材年，陈光晔，等.舌鳞癌DNA倍体性和S期细胞比率与其预后关系[J].中山医科大学学报，1995，16(增)：73.
[9] Underwood JC, Gir DD. Nucleolar organizer region as diagnosis diserimination of malignancy [J]. J Pathol, 1988, 155(2):95.
收稿日期：1999-10-18, 百拇医药
单位：陈伟良(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科 510120)；李海刚(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科 510120)；陈光晔(中山医科大学孙逸仙纪念医院口腔颌面病理科 510120)；孔庆瑜(附属一院流式细胞仪室)
关键词：腮腺肿瘤；DNA含量；核仁形成区
口腔颌面外科杂志000112 摘 要：目的 为了评价DNA含量和AgNOR定量在研究腮腺混合瘤细胞增殖活性的价值。方法 对60例良性无复发、复发和恶性腮腺混合瘤用流式细胞仪和银染色核形成技术作DNA含量和AgNOR定量测定。结果 异倍体率，高S期细胞比率(SPF)率，AgNOR大小和分布在无复发与复发组间无显著差异，而良性与恶性肿瘤间有显著差异；AgNOR数目和形态各组间有显著差异；高SPF率与AgNOR均能反映其细胞增殖活性。结论 高SPF率和AgNOR对良恶性混合瘤的鉴别有重要价值；AgNOR颗粒数目和形态对良性混合瘤的复发有较高估测价值。
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分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1005-4979(2000)01-0038-03
EVALUATION OF DNA CONTENTS AND AgNOR IN STUDY OF CELLULAR
PROLIFERATIVE ACTIVITY OF PAROTIC GLAND MIXED TUMOR
CHEN Wei-liang, LI Hai-gaung, KONG Qin-yu, CHEN Gaung-ye
Depatment of Oral and Maxillo-facial Surgery, Sun Yat-Sen Memorial Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510120
, 百拇医药
Abstract： Objectives For the purpose of evaluating the value of DNA contents and AgNOR in cellular proliferative activity of parotic gland mixed tumor.Methods The DNA contents and AgNOR were analysed by flow cytometry and silver staining nucleolar technique for sixty cases of benign unrecurrent, recurrent and malignant parotic gland mixed tumor.Results There were no sinificant difference in incidence of aneuploid and highs synithesis phase fraction (SPF), the size and distribution of AgNOR between unrecurrent and recurrent tumors, and there were sinificant difference between benign and malignant tumors, and there were singnificant differenct in the number and shape of AgNOR between the groups, and a linear positive correlation was observed between that obvious positive correlation was observed between highs SPF and number of AgNOR.Conclusions Both DNA contents and AgNOR can reflet the cellular proliferative activity and play a important role in distiguishing benign and malignant mixed tumors, that the number and shape of AgNOR are useful for juding the recurrent of mixed tumor.
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Key words： parotic gland neoplesms/pathology; DNA contents; nucleolus organizer region
国内外已有用流式细胞测量术(flow cytometry, FCM)或银染色核形成区(silver staining nucleolar organiger region, AgNOR)技术，对涎腺混合瘤作DNA含量或AgNOR定量分析，研究其细胞增殖活性[1～3]。但未见两种技术的比较研究报告。作者用FCM国际统一新标准[4]和Ploton等[5]改良一步法对良性和恶性混合瘤分别作DNA含量测量和AgNOR计数，旨在比较两技术在研究其细胞增殖活性的临床价值。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
选用经病理诊断为腮腺混合瘤石蜡包埋标本60例。经5～14年随访，良性腮腺混合瘤无复发33例和复发11例(原发瘤标本)，恶性16例。良性者行肿瘤包膜外切除，恶性者作腮腺全切除。
1.2 DNA含量测定
1.2.1 单细胞悬液样品制备 将石腊包埋标本切取50μm厚的组织5张，二甲苯室温下脱蜡，用100%、95%、70%、50%乙醇和蒸馏水度水化。用胃蛋白酶消化组织。300目不锈钢网过滤，经漂洗，低速离心(500r/min×2min)，除去细胞碎片后，得到单细胞悬液。细胞数大于105/ml。再用溴化乙啶(EB)染色后上机测量。
1.2.2 DNA的FCM分析 用EPICS ELITE型流式细胞仪(Coulter公司)，2W氩离子激光器，波长488mm，输出功率300mW。实验前先用EB染色的鸡红细胞悬液作为较准仪器的标准样品，使变异系数(CV)值小于4%。测量结果用Multycyle软件在计算机上拟出细胞各时相(G0/G1、S和G2M)分布。
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1.2.3 DNA倍体性的判断标准与S期细胞比率分组 用DNA指数(DNA Index,DI)表示细胞DNA含量。DI是样品细胞与对照组细胞G0/G1峰均值的比值。以正常腮腺组织细胞DNA含量为二倍体标准(DI=1.0)。二倍体和近二倍体肿瘤细胞DI范围为0.85～1.15。在此范围以外均为异倍体肿瘤。根据全组S期细胞比率(synthesis phase fraction, SPF)的平均值分组，高于平均值者为高SPF。
1.3 AgNOR定量测定
1.3.1 AgNOR染色 将石蜡包埋标本切取4μm组织片，经脱蜡，梯度乙醇水化。用2%明胶甲酸溶液和50%硝酸银溶液按1∶2临用前制成染液。20℃恒温下避光染色40min后，去离子水洗，梯度酒精脱水，二甲本透明，树胶封片。
1.3.2 AgNOR计数 按Crocker推荐方法[6]油镜下于肿瘤细胞密集区随机计数100个肿瘤细胞，其指标如下。(1) 数目：计数每个细胞核内AgNOR颗粒数，求出平均值。(2) 大小：对每个细胞核内AgNOR颗粒用C2型2n网型测微尺(上海第三光学仪器厂)测量其直径，直径大于0.5μm为大颗粒，直径小于或等于0.5μm为小颗粒，记录颗粒大小数，求出平均值。(3) 形态：颗粒分为规则型AgNOR(圆形和近似圆形，边缘光滑)和异形(杆状，多边和奇异形等)。记录每例异形颗粒比例，求出均值。(4) 分布：根据AgNOR颗粒在核内所处的位置，分为中央位(细胞长、短径连线中点)，周边位(紧贴或位于核膜上)和偏中位(中央位与周边位之间)，记录每例周边位与中央位和偏中央位之比，求出均值。
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2 结果
2.1 DNA含量
无复发组、复发组和恶性组肿瘤异 体率分别为12.1%(4/33)，27.3(3/11)和68.8%(11/16)；高PSF率(最低为4.0%，最高为29.5%，平均17.8%)分别为9.1%、27.3%和87.5%。经χ2检验，异倍体率和高SPF率，无复发与复发组比较P>0.05；恶性与无复发或复发组比较，异倍体P<0.05，高SPF，P<0.01。
2.2 AgNOR定量
标本经AgNOR染色后，胞浆呈淡黄色，核呈深黄色，AgNOR呈棕黑色颗粒。图1、2和3分别显示油镜下无复发，复发和恶性腮腺混合瘤的AgNOR颗粒。其颗粒数目、大小比值、周边与中位加偏中比值和异形与规则比值的均值见附表。
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图1 无复发瘤显示核中AgNOR颗粒1～3个，多为圆形AgNOR (×400)
图2 复发瘤显示核中AgNOR颗粒1～3个，可见少数不规划形AgNOR (×400)
图3 恶性瘤显示核中AgNOR颗粒2～5个，多为不规则形AgNOR (×400)
附表1 无复发、复和和恶性组AgNOR计数(x±s) AgNOR
良 性
恶性组
无复发组
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复发组
数目(个/核)*
2.54±0.32
2.93±0.30
3.15±0.29
大/小**
4.15±0.50
2.40±0.78
1.95±0.97
周/中+偏**
0.38±0.15
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0.48±0.10
0.53±0.13
异形/规则*
0.25±0.10
0.37±0.14
0.77±0.25
t检验：* 各组间比较P<0.05；** 良性与恶性比较P<0.052.3 DNA含量与AgNOR定量关系
将各组高SPF率与相应组别的AgNOR数目作相关系数显著检验：t=0.972,P<0.05。
3 讨论
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细胞分裂增殖的实质是DNA复制，染色体倍增。测量肿瘤细胞DNA倍体水平可反映细胞增殖情况，也可作为恶性肿瘤的标志之一。Martin等报告[3]，良性涎腺混合瘤无复发者异倍体率为12.5%，复发者为37.5%。国内报告分别高达33%和67%[1]。本研究结果，无复发和复发腮腺混合瘤异倍体纺较前两者报告的低，分别为12.1%和27.3%。这可能与国内外应用FCM作肿瘤研究的标准未统一，缺乏共识有关。尽管这样，本研究结果仍能反映腮腺混合瘤细胞的增殖活性。近年来，SPF被推荐为肿瘤增殖的估测指标[4]。本结果，无复发和复发腮腺混合瘤高SPE率分别为9.1%和27.3%。由于良性肿瘤异倍体率和高SPF率在无复发和复发组间无显著性差异(P>0.05)。而用DNA含量测定作为估测其复发的可能性的价值不大。恶性组异倍体率和高SPF率为68.8%和87.5%，显著高于无复发和复发的良性肿瘤。异倍体率与Chen[7]报告的62%非常接近。作者用同一标准测量到的舌鳞癌异倍体率和高SPF率为51.3%和62.5%[8]。可见，恶性腮腺混合瘤增殖活性异常活跃，其活跃程度可能高于舌鳞癌。DNA含量测定特别是SPF作为鉴别良恶性腮腺混合瘤有重要价值。
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本研究结果，无复发组，复发组和恶性组肿瘤细胞核内AgNOR数目递增。各组间有显著性差异(P<0.05)，与高SPF率呈显著正相关关系(P<0.05)。与汪说之等[2]报告的一致。表明AgNOR计数能较好地反映腮腺混合瘤的增殖状态。AgNOR数目越多，细胞增殖活性越强。Underwood等认为[9]，AgNOR颗粒分散于细胞核中；细胞倍体数增加以及rDNA转录活动增加导致原来不明显的AgNOR变得明显可见有关。AgNOR颗粒形态，异形与规则的比值与颗粒一样各组间有显著性差异，这与倍体性和SPF不同，后两者在无复发组与复发组间无统计学差异。作者认为，AgNOR颗粒数目和异形与规则比值，除可作为鉴别良恶性肿瘤外，还可估测良性腮腺混合瘤复发的可能性。AgNOR大小比值和周边位与中位加偏中位比在良性和恶性肿瘤间存在差异，作为鉴别良恶性腮腺混合瘤亦有临床价值。
本文校正：史宏男
作者简介：陈伟良(1957-)，男，副教授，硕士导师。近年发表论文三十多篇，1998年赴美国洛杉矾加州大学研修口腔颌面外科
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参考文献：
[1] 杨建荣，张圆，周振英.腮腺混合瘤细胞核DNA含量与复发癌变关系的初步研究[J].口腔医学，1995，15(1)：9.
[2] 汪说之，李铁军.涎腺肿瘤中核仁组织导体区的定量研究[J].中华口腔医学杂志，1992，27(2)：74.
[3] Martin AR, Mantravadi J, Kotylo PK. Proliferative activity and aneuploidy in pleomorphic adenomas of the salivary plands [J]. Arch Pathol Lab Med, 1994, 118(3):252.
[4] 李正生，综述.恶性肿瘤流式细胞测量术国际统一标准[J].国外医学肿瘤分册，1994，21(4)：209.
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[5] Ploton D, Menager M, Jeannesson P. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic protein of the nucleolar organizer region at the optical level [J]. J Histochem, 1986, 18(1):5.
[6] Crocher J, Boldy DA, Egan MJ. How should we count AgNORs? Proposale for a standarized approach [J]. J Pathol, 1989, 158(3):185.
[7] Chen RB. Flow cytomelric analsis of benign and malignant tumors of the oral and maxillofacial region [J]. J Oral Maxilloface Surg, 1989, 47(6):596.
[8] 陈伟良，任材年，陈光晔，等.舌鳞癌DNA倍体性和S期细胞比率与其预后关系[J].中山医科大学学报，1995，16(增)：73.
[9] Underwood JC, Gir DD. Nucleolar organizer region as diagnosis diserimination of malignancy [J]. J Pathol, 1988, 155(2):95.
收稿日期：1999-10-18, 百拇医药