釉基质蛋白诱导牙周组织再生的量效实验研究
作者：束蓉 张濒 刘正
单位：束蓉(第二医科大学附属第九人民医院，上海 200011)；张濒(第二医科大学附属第九人民医院，上海 200011)；刘正(第二医科大学附属第九人民医院，上海 200011)
关键词：猪釉基质蛋白；猴；量效实验研究
牙体牙髓牙周病学杂志000101 摘 要：目的：探索釉基质蛋白(Enamel Matrix Proteins,EMPs)应用的最佳剂量和甲壳质作为载体的可行性。方法：采用乙酸提取法获得猪釉基质蛋白，选用甲壳质作为载体膜，分别选择4种剂量的釉基质蛋白做猴牙周骨缺损的再生实验研究。结果：15mg剂量组可获得高达78.33%的牙骨质再生和75%的牙槽骨再生，明显高于5、10和20mg组。结论：15mg的EMPs为诱导牙周组织再生的最佳剂量，甲壳质可作为良好的载体材料。
分类号：R780.2 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1005-2593(2000)01-0001-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(1)：1]
The experimental study on dosage-effect of enamel matrix
proteins inducing regeneration of periodontal tissues
SHU Rong, ZHANG Bin, LIU Zheng
(The Ninth Affiliated Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011)
Abstract：AIM：To explore the best dosage of clinical applied enamel matrix proteins (EMPs) and the feasibility of chitin as vehicle. METHODS：Porcine enamel matrix proteins were extracted by acetic acid method and chitin was used for vehicle. Four kinds of dose of EMPs were selected for studies on periodontal regeneration in alveolar bone defect of monkey. RESULTS：Only 15mg EMPs could be resulted in regeneration of 78.33% of the new cementum and 75% of the alveolar bone, it was higher than those in 5、10 and 20mg groups. CONCLUSIONS：15mg EMPs is the best dosage for inducing regeneration of periodontal tissues and chitin is a good material for vehicle.
, 百拇医药
Key words：porcine enamel matrix proteins；monkey；dosage-effect test
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(1):1]▲
国外一些实验研究结果表明，釉基质蛋白(Enamel Matrix Proteins EMPs)具有明显的诱导牙周组织再生的能力[1～3]，这些研究成果为提高牙周病临床治疗的疗效展示了新的途径。我们已通过乙酸提取法获得了猪EMPs，并采用SDS-PAGE凝胶电泳和氨基酸测序法确定了EMPs的性质，证实了其同属种类间的遗传保守性，为临床应用提供了理论依据[4]。但作为生长因子(Growth Factors，GFs)在促进组织或细胞生长过程中，不仅对细胞增殖、分化、趋化、形态学及基质合成等方面的影响能力是不同的，而且还具有剂量依赖性增生效应——量效效应。为了摸索我们所提取的猪EMPs诱导牙周组织再生生物活性的最佳使用剂量，我们进行了量效实验，为以后的EMPs诱导牙周组织再生的临床应用剂量提供可靠的理论依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物
选择3～4岁成年猕猴1只，雄性，体重3.75kg。由上海市实验动物研究中心提供，经检疫确认无传染性疾病。
1.2 实验材料
取EMPs冻干粉，ddH2O彻底溶解。采用甲壳质膜材料(由中国纺织大学馈赠，降解时间40～50d)作为载体膜，裁剪为10mm×10mm大小,与EMPs复合，使每张膜分别含EMPs 5、10、15、20mg。
1.3 实验方法
1.3.1 手术过程
实验动物采用氯胺酮肌注加戊巴比妥钠(20～30mg/kg)静脉复合麻醉的方法。常规消毒、铺巾，清除术区和周围牙面菌斑、牙石。分别在上、下颌骨4个区翻开粘骨膜瓣，在第二前磨牙、第一磨牙颊面釉牙骨质界(CEJ)做切迹。用手机去除第二前磨牙、第一磨牙近中根颊侧的牙槽骨,刮除牙骨质，去骨高度为CEJ下6mm，并在根面做切迹，彻底刮净根面的牙周膜纤维。500g/L枸橼酸处理根面，生理盐水冲洗。于各手术区分别放置含5、10、15、20mg EMPs的甲壳质膜，顺时针方向依次编号为A、B、C、D区，龈瓣复位缝合。
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1.3.2 标本制备
于术后8周处死动物，立即截取术区颌骨标本，中性甲醛溶液固定，脱钙液中脱钙，常规石蜡包埋，制备6nm切片,常规HE染色，中性树胶封片。
1.3.3 组织学观察测量
光镜下观察载体材料吸收情况、结缔组织内炎症情况、结合上皮根向移行情况。并测量如下指标：
牙骨质再生高度：计算占CEJ至根方切迹长度的百分率。
牙槽骨再生高度：计算占CEJ至根方切迹长度的百分率。
2 结果
2.1 大体观察
动物伤口愈合良好，牙龈无充血、水肿。术后8周，术区外观除牙龈稍有退缩外，无色、形、质的改变，与牙体附着紧密，未探及牙周袋。
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2.2 组织学观察
所有实验术区甲壳质载体材料均已完全吸收，结缔组织内均未见明显炎症细胞浸润。各组诱导牙骨质和牙槽骨再生高度的百分率见图1。
图1 各组诱导牙骨质和牙槽骨再生高度的百分率
A区(5mg组)：牙龈轻度退缩，未见明显的结合上皮根向移行，牙骨质再生达51.67%，新生的牙骨质均为无细胞性牙骨质，牙槽骨再生为21.67%。
B区(10mg组)：牙龈轻度退缩，未见结合上皮明显根向移行，牙骨质再生明显，达71.67%，牙槽骨再生为26.67%。
C组(15mg组)：牙龈无明显退缩，未见明显的结合上皮根向移行，牙骨质再生达78.33%，且与根部的牙本质附着紧密，表面可见密集排列的成牙骨质细胞。牙周韧带排列有序，与新生的牙骨质穿通。牙槽骨再生达75%，新生的牙槽骨表面可见较多的成骨细胞(图2、3、4)。
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D组(20mg组)：牙龈退缩，可见结合上皮根向移行，牙骨质和牙槽骨再生均不明显，分别为6.67%和3.33%。
图2 牙龈轻度退缩，未见结合上皮根徙，有牙骨质再生。 CEJ为釉牙骨质界，D为牙本质，G为牙龈，箭头示新生的牙骨质 HE ×33
图3 新生的牙周组织。 D为牙本质，G为牙龈，PDL为牙周韧带，B为牙槽骨，箭头示新生的牙骨质HE ×33
图4 高倍镜下的牙周组织，新生的牙骨质表面有紧密排列的成牙骨质细胞、夏柏氏纤维穿通。 B为牙槽骨，PDL为牙周韧带，D为牙本质，C为牙骨质 HE ×132
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3 讨论
GFs对细胞生长、分裂、增殖的调控是一个十分复杂的问题。GFs的作用是通过与细胞膜上的受体结合后凭籍信息传递机制对细胞功能产生调节。其对细胞的作用受其受体数量的调节。GFs产生最大效应的有效浓度除取决于细胞膜表面受体数量和亲和力大小外，还受其细胞间质的影响[5]。因此，GFs作用具有多样性和剂量依赖性，即量效效应。
EMPs作为一种促进组织细胞再生的蛋白质/多肽生长因子，探索产生最大效应的最佳浓度是十分必要的。肽类生长因子的量效关系通常可以分为3个阶段。最初在低浓度时剂量与效应呈正相关，GF浓度增加其效应也相应增加；当浓度增至一定值后的一段范围内，剂量增加并不产生更大效应，似乎呈饱和状态；此后GF浓度升高生物效应反而下降，量效呈负相关。在体外培养条件下，易从量效关系中找出GF最佳用量范围，而动物实验或临床试用，由于创伤形式、给药方法和剂型的不同，GF用量出入较大[6]。在本实验中，我们选择与人同属灵长类的猕猴，并设计了牙周组织缺损的动物模型，同时采用甲壳质作为载体，以尽量符合临床应用的实际状况。本实验结果提示，所提取获得的EMPs以C组，即局部应用15mg剂量时牙骨质、牙槽骨再生的百分率最高，分别达到78.33%和75.00%。而其它各组的牙骨质槽骨再生百分率有较大差距，探其原因，可能系EMPs效率剂量与作用细胞不同的缘故，进一步证实了GFs作用的处境依赖性[5]。
, 百拇医药
同其他GFs一样(如BMPs)，EMPs实际应用的剂量是非常小的，因此，要使其滞留于局部，须寻找适合的载体以支持釉基质蛋白与局部组织很好的接触，促使局部细胞分化、增殖，达到组织再生的作用。本实验选择由中国纺织大学提供的甲壳质膜作为载体材料。甲壳质作为一种纤维成分兼具高等动物组织的胶原和高等植物中的纤维素两种生物功能，除具有优异的生物相容性、生物活性和生物降解性外，还有抗细菌、抗真菌作用，能防止伤口感染，吸收渗出液，促进创面愈合，使伤口愈合过程加快75%[5，7]。在实验中发现，当覆盖含釉基质蛋白的甲壳质膜后，术区的渗血和渗出液明显减少，术后4个手术区均无感染，伤口愈合良好，龈瓣与牙面贴合紧密。组织学观察发现，如果剂量恰当可使EMPs发挥理想的生物活性作用。
Hammarstrom等曾选择丙烯乙二醇藻(propylene glycol alginate, PGA)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose, HEC)和葡聚糖(dextran)等可吸收材料作为釉基质衍生物(enamal, matrix delivative, EMD)的载体，结果发现，PGA能使EMD发挥最大的生物活性[8]。Gestrelius等的实验进一步证实，溶于PGA中的EMD在酸性条件下溶解形成高粘性的溶液，而在中性和体温条件下粘性降低，EMD沉淀。研究还表明，EMD能吸附在羟基磷灰石、胶原和裸露的根面，形成不溶的球形络合物。这种络合物可在根面滞留2周，从而发挥生物作用[9]。因此，合适的载体材料对充分发挥EMPs的生物学效应是十分必要的。
, 百拇医药
本实验结果表明，甲壳质可作为良好的EMPs载体，并以15mg为诱导牙周组织再生的最佳应用剂量，为进一步实验奠定了基础。■
参考文献：
[1] Hammarstrom L. Enamel matrix,cementum development and regeneration. J Clin Periodontol, 1997,24:658
[2] Gestrelius S, Andersson C, Lidstrom D, et al.In vitro studies on periodontal ligament cells and enamel matrix derivative. J Clin Periodontol, 1997,24:685
[3] Heijl L. Periodontal regeneration with enamel matrix derivative (EMDOGAIN) in the treatment of intrabony periodontal defects. J Clin Periodontol, 1997,24:705
, http://www.100md.com
[4] 束蓉，刘正，王洪海, 等. 猪釉基质蛋白的提取及N-末端氨基酸序列分析.口腔医学纵横, 1999,15(2):67
[5] 徐建，金鑫荣.天然高分子甲壳素/壳聚糖在生物和医学方面的应用.大学化学, 1994, 9(3):22
[6] 周廷冲. 多肽生长因子基础与临床. 北京:中国科学技术出版社, 1992.3
[7] Brine CJ, Sandford PA, Zikakis JP. Advance in chitin and Chitosan. Elserier Applied Science (England), 1991,34-78;543
[8] Hammarstrom L, Heijl L, Gestrlius S. Periodontal regeneration in a buccal dehiscence model in monkeysafter application of enamel matrix proteins. J Clin Periodontol, 1997,24:669
[9] Gestrelius S, Andersson C, Johansson AC, et al. Formulation of enamel matrix derivative for surface coating. J Clin Periodontol， 1997，24:678
收稿日期：1999-11-20, http://www.100md.com
单位：束蓉(第二医科大学附属第九人民医院，上海 200011)；张濒(第二医科大学附属第九人民医院，上海 200011)；刘正(第二医科大学附属第九人民医院，上海 200011)
关键词：猪釉基质蛋白；猴；量效实验研究
牙体牙髓牙周病学杂志000101 摘 要：目的：探索釉基质蛋白(Enamel Matrix Proteins,EMPs)应用的最佳剂量和甲壳质作为载体的可行性。方法：采用乙酸提取法获得猪釉基质蛋白，选用甲壳质作为载体膜，分别选择4种剂量的釉基质蛋白做猴牙周骨缺损的再生实验研究。结果：15mg剂量组可获得高达78.33%的牙骨质再生和75%的牙槽骨再生，明显高于5、10和20mg组。结论：15mg的EMPs为诱导牙周组织再生的最佳剂量，甲壳质可作为良好的载体材料。
分类号：R780.2 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1005-2593(2000)01-0001-03
[牙体牙髓牙周病学杂志，2000，10(1)：1]
The experimental study on dosage-effect of enamel matrix
proteins inducing regeneration of periodontal tissues
SHU Rong, ZHANG Bin, LIU Zheng
(The Ninth Affiliated Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011)
Abstract：AIM：To explore the best dosage of clinical applied enamel matrix proteins (EMPs) and the feasibility of chitin as vehicle. METHODS：Porcine enamel matrix proteins were extracted by acetic acid method and chitin was used for vehicle. Four kinds of dose of EMPs were selected for studies on periodontal regeneration in alveolar bone defect of monkey. RESULTS：Only 15mg EMPs could be resulted in regeneration of 78.33% of the new cementum and 75% of the alveolar bone, it was higher than those in 5、10 and 20mg groups. CONCLUSIONS：15mg EMPs is the best dosage for inducing regeneration of periodontal tissues and chitin is a good material for vehicle.
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Key words：porcine enamel matrix proteins；monkey；dosage-effect test
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2000,10(1):1]▲
国外一些实验研究结果表明，釉基质蛋白(Enamel Matrix Proteins EMPs)具有明显的诱导牙周组织再生的能力[1～3]，这些研究成果为提高牙周病临床治疗的疗效展示了新的途径。我们已通过乙酸提取法获得了猪EMPs，并采用SDS-PAGE凝胶电泳和氨基酸测序法确定了EMPs的性质，证实了其同属种类间的遗传保守性，为临床应用提供了理论依据[4]。但作为生长因子(Growth Factors，GFs)在促进组织或细胞生长过程中，不仅对细胞增殖、分化、趋化、形态学及基质合成等方面的影响能力是不同的，而且还具有剂量依赖性增生效应——量效效应。为了摸索我们所提取的猪EMPs诱导牙周组织再生生物活性的最佳使用剂量，我们进行了量效实验，为以后的EMPs诱导牙周组织再生的临床应用剂量提供可靠的理论依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验动物
选择3～4岁成年猕猴1只，雄性，体重3.75kg。由上海市实验动物研究中心提供，经检疫确认无传染性疾病。
1.2 实验材料
取EMPs冻干粉，ddH2O彻底溶解。采用甲壳质膜材料(由中国纺织大学馈赠，降解时间40～50d)作为载体膜，裁剪为10mm×10mm大小,与EMPs复合，使每张膜分别含EMPs 5、10、15、20mg。
1.3 实验方法
1.3.1 手术过程
实验动物采用氯胺酮肌注加戊巴比妥钠(20～30mg/kg)静脉复合麻醉的方法。常规消毒、铺巾，清除术区和周围牙面菌斑、牙石。分别在上、下颌骨4个区翻开粘骨膜瓣，在第二前磨牙、第一磨牙颊面釉牙骨质界(CEJ)做切迹。用手机去除第二前磨牙、第一磨牙近中根颊侧的牙槽骨,刮除牙骨质，去骨高度为CEJ下6mm，并在根面做切迹，彻底刮净根面的牙周膜纤维。500g/L枸橼酸处理根面，生理盐水冲洗。于各手术区分别放置含5、10、15、20mg EMPs的甲壳质膜，顺时针方向依次编号为A、B、C、D区，龈瓣复位缝合。
, 百拇医药
1.3.2 标本制备
于术后8周处死动物，立即截取术区颌骨标本，中性甲醛溶液固定，脱钙液中脱钙，常规石蜡包埋，制备6nm切片,常规HE染色，中性树胶封片。
1.3.3 组织学观察测量
光镜下观察载体材料吸收情况、结缔组织内炎症情况、结合上皮根向移行情况。并测量如下指标：
牙骨质再生高度：计算占CEJ至根方切迹长度的百分率。
牙槽骨再生高度：计算占CEJ至根方切迹长度的百分率。
2 结果
2.1 大体观察
动物伤口愈合良好，牙龈无充血、水肿。术后8周，术区外观除牙龈稍有退缩外，无色、形、质的改变，与牙体附着紧密，未探及牙周袋。
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2.2 组织学观察
所有实验术区甲壳质载体材料均已完全吸收，结缔组织内均未见明显炎症细胞浸润。各组诱导牙骨质和牙槽骨再生高度的百分率见图1。
图1 各组诱导牙骨质和牙槽骨再生高度的百分率
A区(5mg组)：牙龈轻度退缩，未见明显的结合上皮根向移行，牙骨质再生达51.67%，新生的牙骨质均为无细胞性牙骨质，牙槽骨再生为21.67%。
B区(10mg组)：牙龈轻度退缩，未见结合上皮明显根向移行，牙骨质再生明显，达71.67%，牙槽骨再生为26.67%。
C组(15mg组)：牙龈无明显退缩，未见明显的结合上皮根向移行，牙骨质再生达78.33%，且与根部的牙本质附着紧密，表面可见密集排列的成牙骨质细胞。牙周韧带排列有序，与新生的牙骨质穿通。牙槽骨再生达75%，新生的牙槽骨表面可见较多的成骨细胞(图2、3、4)。
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D组(20mg组)：牙龈退缩，可见结合上皮根向移行，牙骨质和牙槽骨再生均不明显，分别为6.67%和3.33%。
图2 牙龈轻度退缩，未见结合上皮根徙，有牙骨质再生。 CEJ为釉牙骨质界，D为牙本质，G为牙龈，箭头示新生的牙骨质 HE ×33
图3 新生的牙周组织。 D为牙本质，G为牙龈，PDL为牙周韧带，B为牙槽骨，箭头示新生的牙骨质HE ×33
图4 高倍镜下的牙周组织，新生的牙骨质表面有紧密排列的成牙骨质细胞、夏柏氏纤维穿通。 B为牙槽骨，PDL为牙周韧带，D为牙本质，C为牙骨质 HE ×132
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3 讨论
GFs对细胞生长、分裂、增殖的调控是一个十分复杂的问题。GFs的作用是通过与细胞膜上的受体结合后凭籍信息传递机制对细胞功能产生调节。其对细胞的作用受其受体数量的调节。GFs产生最大效应的有效浓度除取决于细胞膜表面受体数量和亲和力大小外，还受其细胞间质的影响[5]。因此，GFs作用具有多样性和剂量依赖性，即量效效应。
EMPs作为一种促进组织细胞再生的蛋白质/多肽生长因子，探索产生最大效应的最佳浓度是十分必要的。肽类生长因子的量效关系通常可以分为3个阶段。最初在低浓度时剂量与效应呈正相关，GF浓度增加其效应也相应增加；当浓度增至一定值后的一段范围内，剂量增加并不产生更大效应，似乎呈饱和状态；此后GF浓度升高生物效应反而下降，量效呈负相关。在体外培养条件下，易从量效关系中找出GF最佳用量范围，而动物实验或临床试用，由于创伤形式、给药方法和剂型的不同，GF用量出入较大[6]。在本实验中，我们选择与人同属灵长类的猕猴，并设计了牙周组织缺损的动物模型，同时采用甲壳质作为载体，以尽量符合临床应用的实际状况。本实验结果提示，所提取获得的EMPs以C组，即局部应用15mg剂量时牙骨质、牙槽骨再生的百分率最高，分别达到78.33%和75.00%。而其它各组的牙骨质槽骨再生百分率有较大差距，探其原因，可能系EMPs效率剂量与作用细胞不同的缘故，进一步证实了GFs作用的处境依赖性[5]。
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同其他GFs一样(如BMPs)，EMPs实际应用的剂量是非常小的，因此，要使其滞留于局部，须寻找适合的载体以支持釉基质蛋白与局部组织很好的接触，促使局部细胞分化、增殖，达到组织再生的作用。本实验选择由中国纺织大学提供的甲壳质膜作为载体材料。甲壳质作为一种纤维成分兼具高等动物组织的胶原和高等植物中的纤维素两种生物功能，除具有优异的生物相容性、生物活性和生物降解性外，还有抗细菌、抗真菌作用，能防止伤口感染，吸收渗出液，促进创面愈合，使伤口愈合过程加快75%[5，7]。在实验中发现，当覆盖含釉基质蛋白的甲壳质膜后，术区的渗血和渗出液明显减少，术后4个手术区均无感染，伤口愈合良好，龈瓣与牙面贴合紧密。组织学观察发现，如果剂量恰当可使EMPs发挥理想的生物活性作用。
Hammarstrom等曾选择丙烯乙二醇藻(propylene glycol alginate, PGA)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose, HEC)和葡聚糖(dextran)等可吸收材料作为釉基质衍生物(enamal, matrix delivative, EMD)的载体，结果发现，PGA能使EMD发挥最大的生物活性[8]。Gestrelius等的实验进一步证实，溶于PGA中的EMD在酸性条件下溶解形成高粘性的溶液，而在中性和体温条件下粘性降低，EMD沉淀。研究还表明，EMD能吸附在羟基磷灰石、胶原和裸露的根面，形成不溶的球形络合物。这种络合物可在根面滞留2周，从而发挥生物作用[9]。因此，合适的载体材料对充分发挥EMPs的生物学效应是十分必要的。
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本实验结果表明，甲壳质可作为良好的EMPs载体，并以15mg为诱导牙周组织再生的最佳应用剂量，为进一步实验奠定了基础。■
参考文献：
[1] Hammarstrom L. Enamel matrix,cementum development and regeneration. J Clin Periodontol, 1997,24:658
[2] Gestrelius S, Andersson C, Lidstrom D, et al.In vitro studies on periodontal ligament cells and enamel matrix derivative. J Clin Periodontol, 1997,24:685
[3] Heijl L. Periodontal regeneration with enamel matrix derivative (EMDOGAIN) in the treatment of intrabony periodontal defects. J Clin Periodontol, 1997,24:705
, http://www.100md.com
[4] 束蓉，刘正，王洪海, 等. 猪釉基质蛋白的提取及N-末端氨基酸序列分析.口腔医学纵横, 1999,15(2):67
[5] 徐建，金鑫荣.天然高分子甲壳素/壳聚糖在生物和医学方面的应用.大学化学, 1994, 9(3):22
[6] 周廷冲. 多肽生长因子基础与临床. 北京:中国科学技术出版社, 1992.3
[7] Brine CJ, Sandford PA, Zikakis JP. Advance in chitin and Chitosan. Elserier Applied Science (England), 1991,34-78;543
[8] Hammarstrom L, Heijl L, Gestrlius S. Periodontal regeneration in a buccal dehiscence model in monkeysafter application of enamel matrix proteins. J Clin Periodontol, 1997,24:669
[9] Gestrelius S, Andersson C, Johansson AC, et al. Formulation of enamel matrix derivative for surface coating. J Clin Periodontol， 1997，24:678
收稿日期：1999-11-20, http://www.100md.com