外源MDR-1基因对小鼠肺腺癌细胞耐药性产生的影响及机理研究
作者：沙慧芳 董强刚 苏建中 冯久贤 包国良
单位：沙慧芳 董强刚 苏建中 冯久贤 包国良(上海胸科医院胸部肿瘤研究所 200030)
关键词：转基因；Lewis肺癌细胞；多药耐药
New Page 1【摘要】目的 了解MDR-1基因表达与肺癌细胞耐药性的关系。方法 用FUGENTM6转染试剂将MDR-1基因导入小鼠Lewis肺腺癌细胞株(3LL)，建立了耐药细胞株(3LL-MDR-1)。用MTT方法测定细胞耐药性并观察异搏定对耐药的逆转效应，MDR-1基因表达产物P-gp采用免疫组化方法观察，应用流式细胞仪分析其对示踪剂罗丹明123的摄取与排泄。结果 建立了一株能稳定表达P-gp和对长春生物碱类、鬼臼毒素类具有显著耐药性的细胞株。免疫组化证实耐药细胞高度表达P-gp糖蛋白。异搏定能部分逆转该细胞株的耐药性，且效应随着剂量递增，流式细胞仪测定显示耐药细胞对示踪剂的排泄作用显著高于亲代细胞。结论 通过基因转染实验，证明MDR-1基因表达与肺癌细胞多药耐药有关。
, 百拇医药
An establishment of murine drug-resistant cell line transfected with human MDR-1 gene
SHA Huifang,DONG Qianggang,SU Jianzhong,FENG Jiuxian,BAO Guoliang
(Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai Chest Hospital,Shanghai 200030,P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the relationship between MDR-1 gene expression and drug resistance in lung cancer cells.Methods The multidrug resistant cell line (3LL-MDR-1) was established by transfecting human MDR-1 gene expressing vector into a murine Lewis lung cancer cell line (3LL).Drug resistance and the effect of valapamil (VLP) on the resistance were evaluated by MTT assay.The expression of MDR-1 gene product,P-gp,was measured immunohistochemically.The influx and efflux of Rhodamine 123 was tested with flow cytometry.Results The MDR cell line expressing P-gp was established,which exhibited a typical drug resistance to vincristine (VCR),vindesin (VDS),etoposide (VP-16),mitomycin (MMC),taxol and navelbine (NOR).Valapamil was able to reverse the resistance of the gene-transfected cells and the reversion was dose-dependent.Flow cytometric analysis showed that the resistant cells had much higher ability to export Rhodamine 123 than the parent cells did.The expression of P-gp protein was visualized immunohistochemically.Conclusion The results indicate that drug resistance in lung cancer cells is closely related to the MDR-1 gene expression.
, 百拇医药
【Key words】Transfection gene Lewis lung cancer cells Multidrug resistance
肿瘤细胞多药耐药(MDR)的产生是导致化疗失败的一个主要原因，成为临床化疗所遇的最大障碍之一。MDR是由于MDR-1基因过度表达的结果，但关于MDR-1过度表达与肺癌耐药性的关系，目前国际上仍有争论[1]。为了深入研究MDR-1基因表达与肺癌耐药性的关系，我们采用分子生物学技术将人MDR-1基因导入小鼠肺腺癌细胞，建立了一株MDR细胞系(3LL-MDR-1)，并研究了该细胞系的耐药特性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 小鼠Lewis肺癌细胞株(3LL)由意大利Mario Nagri药理研究所A Mantovani教授惠赠。
, 百拇医药
1.1.2 试剂 转染试剂FUGENTM6(Boehringer公司)，秋水仙素(华美公司)，长春新碱(VCR)，长春地辛(VDS)(杭州民生制药厂)，鬼臼乙叉甙(VP-16)(上海乐丰制药厂)，丝裂霉素(MMC)(日本协和发酵工业株式会社)，泰素(taxol)(美国百时美施贵宝公司)，诺维本(NOR)(法国皮尔-法伯大药厂)，吉西他宾(GEM)(美国礼来公司)，顺铂(DDP)(齐鲁制药厂)，异搏定(VLP)(上海天丰制药厂)，罗丹明123(Rho123)，噻唑兰(MTT)(Sigma公司)，P-gp(迈新公司)，培养液1640(GIBCO)，小牛血清(华美公司)，质粒MDR-1基因由中国科学院细胞生物学研究所惠赠。
1.2 方法
1.2.1 基因转染 将2.5×105 3LL细胞接种于六孔板中培养过夜。将6?μl FUGENTM6转染试剂滴加入100?μl无血清培养液中，室温5?min后再滴加入含有2?μl(2?μg) MDR-1质粒溶液中，置室温15?min，滴加入换有2?ml新鲜培养液的六孔板中，培养过夜，再换上含有50?ng/ml秋水仙素的培养液进行筛选培养增殖，逐渐增加秋水仙素浓度，当达到300?ng/ml时能稳定转代与扩增的细胞即为3LL-MDR-1细胞。
, 百拇医药
1.2.2 免疫组化染色 收集3LL和3LL-MDR-1细胞，操作方法按ABC染色方法。
1.2.3 Rho123的摄取与外排 检测方法参考文献2。将1×106细胞置于含1?ml培养液的试管内，加入10?μg Rho123后，在20℃培养箱培养10?min取出，2?000?r/min离心5?min后弃上清，加1?ml生理盐水洗一遍，取出一管经流式细胞仪(FCM)测定示踪剂摄取，其余各管加入1?ml培养液，继续培养，然后分别在15，30，45，60?min时取出各相应管测定示踪剂排泄。
1.2.4 细胞耐药试验 96孔培养板中，每孔加入1×104细胞培养过夜，然后分别加入药物，每药物浓度重复4份，培养3?d后用MTT法[3]测定细胞的成活率。
1.2.5 细胞耐药逆转试验 方法同细胞耐药试验，在加入抗癌药的同时加入异搏定，培养3?d后用MTT法测定耐药指数。
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2 结果
2.1 3LL-MDR-1细胞株的建立 3LL亲代细胞在5?ng/ml秋水仙素作用下在3?d内全部死亡。但经MDR-1基因转染后的3LL细胞在上述药物浓度下仍能活跃增殖，增殖的细胞在倍增剂量的秋水仙素作用下继续培养，使药物浓度在4周内达到300?ng/ml，然后用该浓度秋水仙素长期培养转基因细胞，从而获得具有稳定耐药性的3LL-MDR-1细胞系。
用免疫组化方法检测3LL亲代细胞和3LL-MDR-1细胞系中MDR-1基因表达产物P-gp的表达，结果显示3LL-MDR-1细胞呈染色阳性，而亲代细胞则呈阴性，证明转基因细胞已能稳定表达MDR-1基因产物。
2.2 细胞对Rho123的摄取与外排 根据FCM分析结果，与亲代细胞相比，3LL-MDR-1对Rho123的摄取相对减少，而且随着时间的延长，示踪剂的外排明显增加，1?h后3LL-MDR-1与3LL相比荧光强度减少了86.4%，但异搏定能显著抑制3LL-MDR-1细胞对示踪剂的外排(图1)。
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图 1 细胞对Rho123的摄取与外排
Fig 1 Influx and efflux of Rhodamine?123
2.3 耐药谱分析 细胞耐药试验结果显示3LL-MDR-1细胞对泰素和长春新碱具有高度耐药，对鬼臼类药物的耐药程度为中等，但对顺铂药物无明显耐药(图2)。对8种常用化疗药物的耐药谱分析结果证明，该细胞系具有典型的MDR表型，其对长春碱类和泰素的耐药性较亲代细胞高100～1?200倍，但对顺铂和抗代谢类药物如吉西他宾几乎无耐药(表1)。
表1 3LL-MDR-1细胞的耐药谱
Tab 1 Drug-resistance spectrum of 3LL-MDR-1 cell line
Drugs
, 百拇医药
IC50(μg/ml)
Resistance
index
3LL
3LL-MDR-1
taxol
0.001
1.2
1?200
VDS
0.001
0.74
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740
NOR
0.001
0.17
170
VCR
0.057
5.74
100
MMC
7.2
73.6
10.2
, 百拇医药
VP-16
0.24
1.68
7
DDP
1.26
3.38
2.7
GEM
0.21
0.42
2
2.4 细胞耐药逆转试验 表2显示，单纯异搏定在0.5?μg/ml浓度以下时对3LL-MDR-1细胞均无明显细胞毒作用，但将异搏定与长春新碱同时作用下，药物的细胞毒作用明显增强，且具有显著的剂量依赖性，证明异搏定能够逆转3LL-MDR-1细胞的耐药性。表2 3LL-MDR-1细胞在不同浓度异搏定和
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长春新碱作用下的存活率(%)
Tab 2 Survival rate of 3LL-MDR-1 cells incubated
with velapamil and vincristine at different dosages(%)
VLP(ng/ml)
VCR(μg/ml)
0
0.01
0.1
1
10
, http://www.100md.com
0
100
98.7
98.4
88.2
59.5
300
90.6
85.2
83.7
40.8
15.3
400
, 百拇医药
82.5
85.3
79.2
22.1
14.8
500
81.1
80.4
70.0
18.3
14.0
图 2 MTT法测定3LL和3LL-MDR-1细胞株对taxol、VCR、VP-16和DDP的耐药水平
Fig 2 Drug-resistance of 3LL and 3LL-MDR-1 cell lines to taxol,VCR,VP-16 and DDP measured by MTT assay
3 讨论
MDR-1基因过度表达是导致多药耐药的根本原因之一。我们应用逆转录病毒基因转染技术建立了一株MDR-1稳定表达的小鼠肺腺癌细胞系，, http://www.100md.com
单位：沙慧芳 董强刚 苏建中 冯久贤 包国良(上海胸科医院胸部肿瘤研究所 200030)
关键词：转基因；Lewis肺癌细胞；多药耐药
New Page 1【摘要】目的 了解MDR-1基因表达与肺癌细胞耐药性的关系。方法 用FUGENTM6转染试剂将MDR-1基因导入小鼠Lewis肺腺癌细胞株(3LL)，建立了耐药细胞株(3LL-MDR-1)。用MTT方法测定细胞耐药性并观察异搏定对耐药的逆转效应，MDR-1基因表达产物P-gp采用免疫组化方法观察，应用流式细胞仪分析其对示踪剂罗丹明123的摄取与排泄。结果 建立了一株能稳定表达P-gp和对长春生物碱类、鬼臼毒素类具有显著耐药性的细胞株。免疫组化证实耐药细胞高度表达P-gp糖蛋白。异搏定能部分逆转该细胞株的耐药性，且效应随着剂量递增，流式细胞仪测定显示耐药细胞对示踪剂的排泄作用显著高于亲代细胞。结论 通过基因转染实验，证明MDR-1基因表达与肺癌细胞多药耐药有关。
, 百拇医药
An establishment of murine drug-resistant cell line transfected with human MDR-1 gene
SHA Huifang,DONG Qianggang,SU Jianzhong,FENG Jiuxian,BAO Guoliang
(Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai Chest Hospital,Shanghai 200030,P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the relationship between MDR-1 gene expression and drug resistance in lung cancer cells.Methods The multidrug resistant cell line (3LL-MDR-1) was established by transfecting human MDR-1 gene expressing vector into a murine Lewis lung cancer cell line (3LL).Drug resistance and the effect of valapamil (VLP) on the resistance were evaluated by MTT assay.The expression of MDR-1 gene product,P-gp,was measured immunohistochemically.The influx and efflux of Rhodamine 123 was tested with flow cytometry.Results The MDR cell line expressing P-gp was established,which exhibited a typical drug resistance to vincristine (VCR),vindesin (VDS),etoposide (VP-16),mitomycin (MMC),taxol and navelbine (NOR).Valapamil was able to reverse the resistance of the gene-transfected cells and the reversion was dose-dependent.Flow cytometric analysis showed that the resistant cells had much higher ability to export Rhodamine 123 than the parent cells did.The expression of P-gp protein was visualized immunohistochemically.Conclusion The results indicate that drug resistance in lung cancer cells is closely related to the MDR-1 gene expression.
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【Key words】Transfection gene Lewis lung cancer cells Multidrug resistance
肿瘤细胞多药耐药(MDR)的产生是导致化疗失败的一个主要原因，成为临床化疗所遇的最大障碍之一。MDR是由于MDR-1基因过度表达的结果，但关于MDR-1过度表达与肺癌耐药性的关系，目前国际上仍有争论[1]。为了深入研究MDR-1基因表达与肺癌耐药性的关系，我们采用分子生物学技术将人MDR-1基因导入小鼠肺腺癌细胞，建立了一株MDR细胞系(3LL-MDR-1)，并研究了该细胞系的耐药特性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 小鼠Lewis肺癌细胞株(3LL)由意大利Mario Nagri药理研究所A Mantovani教授惠赠。
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1.1.2 试剂 转染试剂FUGENTM6(Boehringer公司)，秋水仙素(华美公司)，长春新碱(VCR)，长春地辛(VDS)(杭州民生制药厂)，鬼臼乙叉甙(VP-16)(上海乐丰制药厂)，丝裂霉素(MMC)(日本协和发酵工业株式会社)，泰素(taxol)(美国百时美施贵宝公司)，诺维本(NOR)(法国皮尔-法伯大药厂)，吉西他宾(GEM)(美国礼来公司)，顺铂(DDP)(齐鲁制药厂)，异搏定(VLP)(上海天丰制药厂)，罗丹明123(Rho123)，噻唑兰(MTT)(Sigma公司)，P-gp(迈新公司)，培养液1640(GIBCO)，小牛血清(华美公司)，质粒MDR-1基因由中国科学院细胞生物学研究所惠赠。
1.2 方法
1.2.1 基因转染 将2.5×105 3LL细胞接种于六孔板中培养过夜。将6?μl FUGENTM6转染试剂滴加入100?μl无血清培养液中，室温5?min后再滴加入含有2?μl(2?μg) MDR-1质粒溶液中，置室温15?min，滴加入换有2?ml新鲜培养液的六孔板中，培养过夜，再换上含有50?ng/ml秋水仙素的培养液进行筛选培养增殖，逐渐增加秋水仙素浓度，当达到300?ng/ml时能稳定转代与扩增的细胞即为3LL-MDR-1细胞。
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1.2.2 免疫组化染色 收集3LL和3LL-MDR-1细胞，操作方法按ABC染色方法。
1.2.3 Rho123的摄取与外排 检测方法参考文献2。将1×106细胞置于含1?ml培养液的试管内，加入10?μg Rho123后，在20℃培养箱培养10?min取出，2?000?r/min离心5?min后弃上清，加1?ml生理盐水洗一遍，取出一管经流式细胞仪(FCM)测定示踪剂摄取，其余各管加入1?ml培养液，继续培养，然后分别在15，30，45，60?min时取出各相应管测定示踪剂排泄。
1.2.4 细胞耐药试验 96孔培养板中，每孔加入1×104细胞培养过夜，然后分别加入药物，每药物浓度重复4份，培养3?d后用MTT法[3]测定细胞的成活率。
1.2.5 细胞耐药逆转试验 方法同细胞耐药试验，在加入抗癌药的同时加入异搏定，培养3?d后用MTT法测定耐药指数。
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2 结果
2.1 3LL-MDR-1细胞株的建立 3LL亲代细胞在5?ng/ml秋水仙素作用下在3?d内全部死亡。但经MDR-1基因转染后的3LL细胞在上述药物浓度下仍能活跃增殖，增殖的细胞在倍增剂量的秋水仙素作用下继续培养，使药物浓度在4周内达到300?ng/ml，然后用该浓度秋水仙素长期培养转基因细胞，从而获得具有稳定耐药性的3LL-MDR-1细胞系。
用免疫组化方法检测3LL亲代细胞和3LL-MDR-1细胞系中MDR-1基因表达产物P-gp的表达，结果显示3LL-MDR-1细胞呈染色阳性，而亲代细胞则呈阴性，证明转基因细胞已能稳定表达MDR-1基因产物。
2.2 细胞对Rho123的摄取与外排 根据FCM分析结果，与亲代细胞相比，3LL-MDR-1对Rho123的摄取相对减少，而且随着时间的延长，示踪剂的外排明显增加，1?h后3LL-MDR-1与3LL相比荧光强度减少了86.4%，但异搏定能显著抑制3LL-MDR-1细胞对示踪剂的外排(图1)。
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图 1 细胞对Rho123的摄取与外排
Fig 1 Influx and efflux of Rhodamine?123
2.3 耐药谱分析 细胞耐药试验结果显示3LL-MDR-1细胞对泰素和长春新碱具有高度耐药，对鬼臼类药物的耐药程度为中等，但对顺铂药物无明显耐药(图2)。对8种常用化疗药物的耐药谱分析结果证明，该细胞系具有典型的MDR表型，其对长春碱类和泰素的耐药性较亲代细胞高100～1?200倍，但对顺铂和抗代谢类药物如吉西他宾几乎无耐药(表1)。
表1 3LL-MDR-1细胞的耐药谱
Tab 1 Drug-resistance spectrum of 3LL-MDR-1 cell line
Drugs
, 百拇医药
IC50(μg/ml)
Resistance
index
3LL
3LL-MDR-1
taxol
0.001
1.2
1?200
VDS
0.001
0.74
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740
NOR
0.001
0.17
170
VCR
0.057
5.74
100
MMC
7.2
73.6
10.2
, 百拇医药
VP-16
0.24
1.68
7
DDP
1.26
3.38
2.7
GEM
0.21
0.42
2
2.4 细胞耐药逆转试验 表2显示，单纯异搏定在0.5?μg/ml浓度以下时对3LL-MDR-1细胞均无明显细胞毒作用，但将异搏定与长春新碱同时作用下，药物的细胞毒作用明显增强，且具有显著的剂量依赖性，证明异搏定能够逆转3LL-MDR-1细胞的耐药性。表2 3LL-MDR-1细胞在不同浓度异搏定和
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长春新碱作用下的存活率(%)
Tab 2 Survival rate of 3LL-MDR-1 cells incubated
with velapamil and vincristine at different dosages(%)
VLP(ng/ml)
VCR(μg/ml)
0
0.01
0.1
1
10
, http://www.100md.com
0
100
98.7
98.4
88.2
59.5
300
90.6
85.2
83.7
40.8
15.3
400
, 百拇医药
82.5
85.3
79.2
22.1
14.8
500
81.1
80.4
70.0
18.3
14.0
图 2 MTT法测定3LL和3LL-MDR-1细胞株对taxol、VCR、VP-16和DDP的耐药水平
Fig 2 Drug-resistance of 3LL and 3LL-MDR-1 cell lines to taxol,VCR,VP-16 and DDP measured by MTT assay
3 讨论
MDR-1基因过度表达是导致多药耐药的根本原因之一。我们应用逆转录病毒基因转染技术建立了一株MDR-1稳定表达的小鼠肺腺癌细胞系，, http://www.100md.com