TT病毒感染者外周血单个核细胞中TT病毒的研究
作者：何忠平 冯惠忠 刘顺爱 徐克沂 崔振宇 周育森 王海涛
单位：何忠平 冯惠忠 刘顺爱 徐克沂 崔振宇(100011 北京地坛医院)；周育森 王海涛(军事医学科学院微生物和流行病研究所)
关键词：DNA病毒；肝炎；聚合酶链反应
中华医学杂志000105 摘 要：目的 了解TTV阳性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)TTV DNA存在及复制情况。方法 采用巢式PCR(nPCR)技术和绿豆芽核酸酶消化单链DNA方法研究在PBMC中的TTV DNA存在及复制情况,并克隆测序分析证实。16例血标本(血清和PBMC)和粪便标本来自北京地坛医院1997年10月～1998年10月住院患者。结果 16例TTV阳性肝炎患者PBMC中有14例TTV DNA阳性,粪便中有5例TTV DNA阳性，并用绿豆芽核酸酶消化提取的14例TTV DNA阳性患者PBMC DNA,有2例为TTV DNA阳性,提示TTV DNA能在PBMC中存在和感染。5例非甲-庚型肝炎患者(BDH1-5)的血清、 PBMC和粪便中TTV DNA片段部分序列经克隆测序，同一患者不同标本(血清、PBMC 和粪便)序列未见差异,与日本株和中国株相应位置核苷酸序列同源性大于95%,5例患者序列之间核苷酸同源性在95%～99%。粪便nPCR阳性患者血清病毒量明显大于粪便nPCR阴性患者。结论 TTV DNA可在TTV阳性肝炎患者PBMC 中存在,表明肝细胞并非TTV感染的唯一场所。
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Presence and replication of TTV DNA in peripheral blood mononuclear cells from hepatitis patients with TTV infection
HE Zhongping*
(*Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011，China)
FENG Huizhong, ZHOU Yusen, et al.
Abstract：Objective To study the presence and replication of TTV DNA in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from hepatitis patients with TTV infection. Methods Nested-PCR (nPCR) was performed for detecting the TTV DNA from the sera, PBMCs and feces of 16 patients with non- A to non-G hepatitis in Beijing Ditan Hospital from Oct. 1997 to Oct. 1998. PBMC DNAs were aslo digested by mung bean nuclease and amplified by nPCR to clasify if TTV DNA was still positive. nPCR products of the sera, PBMCs and feces of 5 hepatitis patients with non-A to non-G hepatitis were cloned and sequenced. Results 14 of the16 samples of PBMC and 5 of the 16 samples of the feces were TTV DNA positive. Two of the 14 samples of the PBMC were still positive after the digestion and amplification of the single-stand DNA. Sequence analysis showed that there was more than 95% nucleotide homology among the sequenced 5 clones (from the sera,PBMC and feces of the 5 patients) and reported AB008394 (from Japan) and AF079173 (from China). Virus loading of patients whose feces were positive by nPCR was obviously more than the patients with negative TTV DNA. Conclusion TTV DNA can exist and replicate in the PBMC； the hepatocytes of patients with TTV infection are not the only place of TTV existence and replication.
, 百拇医药
Key words：DNA virus； Hepatitis; Polymerase chain reaction▲
TT病毒(TTV)是一新发现的单股DNA病毒,与肝功能异常有密切关系,可能属嗜肝病毒,其致病机理还不甚明了,是否感染肝细胞或外周血单个核细胞(PBMC)还缺乏依据。乙型肝炎病毒已被证实可以感染人PBMC。丙型肝炎病毒(HCV)和庚型肝炎病毒(HGV)均能在人PBMC内存在及复制。据此,我们选择了16例血清TTV DNA PCR阳性患者的PBMC,采用巢式PCR(nPCR)方法测定其PBMC中是否存在TT病毒复制;对TTV DNA PCR阳性患者的血清、PBMC和粪便标本部分扩增产物进行克隆测序和分析， 并观察血清TTV 含量与粪便排毒情况。
对象与方法
一、临床资料
, 百拇医药 1.流行病学： 16例患者中男10例，女6例，平均年龄41岁。诊断为急性肝炎者12例，其他肝病者4例。13例患者并无输血及血制品、吸毒以及不洁注射史，提示存在非血源性的感染传播途径。其他3例分别有针灸治疗史、静脉注射史和肝炎患者密切接触史。这些非甲-庚型肝炎患者中排除甲至庚型肝炎病毒、EBV、CMV感染，提示TTV可能是一新的肝炎致病因子[1，2]。
2.粪便排毒：采用nPCR法检测16例非甲-庚型肝炎患者粪便标本，5例TTV DNA阳性，阳性率为31.3%。提示TTV可从宿主的粪便排出，能通过粪-口途径传播。大部分患者在ALT恢复正常后1～2周粪便中未能检测到TTV DNA,少部分患者持续排毒，同时出现ALT反复波动或轻度持续异常。
3.临床过程：12例以急性肝炎首次发病,其临床症状、肝功能损害程度及病程与单纯急性甲型肝炎或戊型肝炎类似。这些患者起病初期大部分有乏力、纳差，同时伴眼黄、尿黄。少部分患者有肝区不适感和发热。ALT中位数为260 U/L(赖氏法)，总胆红素中位数为120 μmol/L。这些患者分别采用促肝细胞生长素、胸腺肽、强力宁、茵栀黄等一般保肝药物治疗，治疗时间为21～90 d。从出现临床症状到肝功能恢复正常时间，平均病程为42天。16例患者中有2例重症肝炎、1例慢性肝炎和1例慢性肝硬化患者。
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二、标本来源及PBMC的分离
16份血标本(血清和PBMC)和粪便标本来自北京地坛医院1997年10月～1998 年10月住院患者,其血清TTV DNA nPCR阳性,临床诊断为非甲-庚型肝炎,均为甲、乙、丙、丁、戊、庚型(美国Abbott公司,EIA方法或PCR法)和EBV、CMV抗体(德国Human公司,EIA方法)两次检测阴性,ALT异常(>40 U/L,赖氏法),并排除自身免疫性疾病、药物性肝炎、酒精性肝炎、阻塞性黄疸等。5ml 乙二氨四乙酸(EDTA)抗凝血加5 ml 1640培养液稀释,置于淋巴细胞分层液(Ficoll-hypaque)上层,进行梯度离心,吸取界面单个核细胞层。用5 ml PBS洗3次后于-70℃冻存备检。
三、试剂
Taq酶、dNTPs、T4DNA连接酶购自华美公司,T-vector 、XL1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。 STG试剂盒购自美国Biotronic公司, QIAprep MiniPrep质粒提取试剂为德国QIAgen公司产品。淋巴细胞分层液(Ficoll-hypaque)、 1640培养液为美国Sigma公司产品。绿豆芽核酸酶(mung bean nuclease, MBN)为美国Promega公司产品。
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四、DNA的提取
用STG法,取50 μl 血清、(2×105)单个核细胞和粪便标本提取液,加80 μl STG缓冲液,混匀,100℃变性5 min,13 000 r/min离心10 min, 剔除变性蛋白,加90 μl异丙醇沉淀,室温离心,沉淀物干燥后用无菌水10 μl溶解。
五、巢式PCR (nPCR)检测
参考日本株TTV基因序列设计2对引物,引物序列分别为：P1:5′-CACCAGGAGCATATACAGA-3′;P2:5′-TCTTCTTGCTGGTGAAA-3′;P3:5′-ACAGA-CAGAGGAGAAGGC-3′;P4:5′-AACAGGCACATTACT-ACT-3′。其中P1/P2为外引物,P3/P4为内引物。第1轮PCR反应条件:模板4 μl、 10×PCR 缓冲液3 μl、dNTPs 0.8 μmol/L、P1/P2 0.1 μmol/L,30 μl反应体积,94℃预变性180 s,94℃40 s、55℃40 s、72℃40 s,30个循环。第2轮PCR反应条件:取第1轮PCR产物2 μl作模板,10×PCR 缓冲液3 μl 、dNTPs 0.8 μmol/L、P3/P4 0.1 μmol/L, 30 μl反应体积,94℃预变性180 s,94℃40 s、55℃40 s、72℃40 s,30个循环。取第2轮PCR产物10 μl用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察结果。第2次PCR扩增产物为309 bp。每次PCR均设阴性和阳性对照,阴性对照为正常人PBMC及TTV感染病人PBMC最后一次洗涤液。
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六、PCR产物的克隆和测序
PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后,直接与T载体连接,转化XL1-Blue宿主菌。挑取白色菌落用PCR和酶切鉴定,对阳性菌落接种培养,提取质粒,采用Sanger末端终止法,于ABI 377型自动测序仪进行双链测序。
七、DNA序列的计算机分析
采用CLUSTWAL和BLAST软件程序进行分析。
八、单双链鉴定
STG法提取的TTV DNA一式两份，各约1 μg， 一份经MBN(20 U)消化4 h,经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后,进行nPCR扩增,另一份直接进行nPCR扩增,方法同前。因MBN以内切方式降解单链DNA和RNA,产生带5′-磷酸末端的核苷酸或寡核苷酸,而保持双链DNA的完整性。TT病毒是单股DNA病毒,其单股DNA在该酶的作用下应该被分解,但若此病毒在PBMC中复制或形成双链,就能抵抗该酶的作用。
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九、血清病毒半定量分析
将血清DNA提取液10 μl经1：101、1：102、1：103、1：104、1：105、1：106稀释，分别取4 μl按上述nPCR方法进行操作。
结果
一、血清、PBMC和粪便中TTV感染的nPCR检测
16例非甲-庚型肝炎患者,其血清用nPCR方法检测TTV DNA均为阳性,采取患者PBMC(2×105个细胞)和粪便(约5 g),用STG法提取TTV DNA, PBMC和 粪便标本nPCR方法与血清标本nPCR方法相同。其中14例TTV感染的PBMC为TTV DNA阳性,5例TTV感染的粪便为TTV DNA阳性；正常人PBMC和粪便对照为阴性,阳性对照(TTV感染患者血清)为阳性。
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二、 PBMC中TTV DNA单双链鉴定
14例患者PBMC用STG法提取DNA后,一份经直接nPCR扩增，均为阳性。另一份用MBN消化, 经nPCR方法进行扩增。其中有2例患者PBMC DNA在MBN作用下仍为TTV DNA阳性，同时设立阴阳对照。2例患者PBMC DNA酶消化后nPCR扩增产物经克隆测序证实。
三、血清TTV DNA 半定量分析
16例非甲-庚型肝炎患者各种标本中TTV DNA经半定量分析血清病毒量在101～105之间。5例粪便nPCR阳性患者，血清病毒量在103～105之间，粪便nPCR阴性患者，血清病毒量在101～102之间。
四、血清、PBMC和粪便中TTV DNA部分核酸序列分析
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将5例(TTV BDH1～5)非甲-庚型肝炎患者血清、PBMC和粪便中分离出的309bp TTV DNA基因片段进行克隆后测序分析,同一患者不同标本序列未见差异；5个分离株序列与日本株(AB08394) 和中国株(AF079173)相对应位置核苷酸同源性均在95%以上,各分离株之间核苷酸同源性在95%～98%(表1)。序列分析比较结果见图1。
表1 TTV北京地坛医院分离株与日本株和中国株核苷酸同源性比较 Isolates
AB08394
CHN1
BDH1
BDH2
BDH3
BDH4
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BDH5
CHN1
0.98
BDH1
0.99
0.97
BDH2
0.98
0.99
0.97
BDH3
0.98
0.98
, 百拇医药
0.96
0.98
BDH4
0.97
0.96
0.96
0.97
0.95
BDH5
0.97
0.96
0.96
0.95
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0.96
0.95
注:AB08394为日本株,CHN1为中国株(AF079173),BDH1～5为TTV北京地坛医院分离株
图1 非甲-庚型肝炎患者TTV北京地坛医院分离株(TTV BDH1～5)与日本株和中国株核苷酸序列比较
讨论
继人类发现甲、乙、丙、丁、戊(A～E)5型肝炎病毒后,仍有一些输血后或散发性的肝炎不属于上述5型肝炎病毒感染。此类非甲-戊肝炎约占肝炎发病的10%～20%。1995年美国研究者先后报道发现庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C),而HGV感染者仅占非甲～戊型肝炎患者的2.1%～15.0%,且对HGV的致病性存在不同看法[3，4]。1997年底日本学者通过代表性差异技术(RDA)发现一种单股DNA病毒,研究表明与ALT异常有明确关系,由输血和血制品、吸毒或其他途径传播,可能是引起非甲-庚型急慢性肝炎的一种新病原,命名为TTV[5，6]。自从TTV发现以来,引起各国病毒学家的极大关注,正在从各个不同方面对TTV进行研究,渴望对TTV有一个更深层次的认识。乙型肝炎病毒已被证实可以感染人外周血PBMC,并有部分HBV基因可在PBMC内表达,被认为可能是导致乙型肝炎患者免疫功能异常的重要原因[7，8]。丙型肝炎病毒(HCV)和庚型肝炎病毒(HGV)均能在人外周血PBMC中存在及复制。HCV导致慢性肝炎的比例较高,HCV感染后所发生的肝硬化过程可能是病毒直接作用的结果。有证据表明,外周血淋巴细胞在体外分泌抗-HCV抗体,故HCV除嗜肝脏外还有其他的细胞嗜性,可能作为病毒长期滞留的场所,引起病毒持续感染。HCV在免疫系统中的存在和复制,可能是导致丙型肝炎患者免疫缺陷、肝细胞损伤及病程迁延的重要原因[9，10]。但是,有关TTV在PBMC中感染及复制的研究报道甚少。
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我们采用nPCR技术和MBN对其进行研究,结果表明，16例TTV DNA阳性的非甲-庚型肝炎患者PBMC中有14例存在TTV DNA阳性;并用MBN对提取的PBMC DNA进行消化,其中有2例仍然阳性。为排除假阳性，每份标本均一式两份，一份经直接nPCR,另一份经MBN酶切消化后nPCR，同时设立阴阳对照。由此可见,87.5%(14/16)患者PBMC中存在TTV DNA,14.3%(2/14)患者PBMC经MBN酶切消化后nPCR仍为阳性，说明TTV有可能在其中进行复制,表明肝细胞并非TTV的存在和感染的唯一场所。另有12例患者PBMC经MBN酶切消化后nPCR为阴性，有几种可能：(1) PBMC中只有单链TTV DNA,并未形成双链DNA。(2)PBMC中既有单链，又有双链，而形成双链DNA较少，未达到检测量。(3)PBMC中双链DNA达到检测量，由于操作原因损耗未检出。下一步通过原位杂交和原位PCR技术来研究TTV在PBMC中的具体部位及分布,其能否整合到人体染色体仍需要进一步研究。
我们对5例患者的血清、PBMC 和粪便标本 DNA nPCR扩增均阳性的产物分别进行克隆测序, 同一患者不同标本(血清、PBMC 和粪便)序列未见差异,与日本株和中国株的核苷酸同源性在95%以上,证明为同一病毒不同分离株。这些分离株之间核苷酸同源性在95%～99%之间,说明核苷酸变异幅度不大,还未见到不同的基因型[11，12]。■
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参考文献：
[1]何忠平，周育森，黄呈辉，等.聚合酶链反应斑点杂交法检测TT病毒感染.中华医学检验杂志， 1999，22：142-144.
[2]何忠平，彭国爱，庄辉.聚合酶链反应标记输血传播病毒(TTV)地高辛素探针的初步应用.中国公共卫生， 1999，15：691-692.
[3]Leary TP,Muerhoff SA,Simons JN,et al.Sequence and genomic organization of GBV-C:A novel member of the flaviridae associated with human non A-E hepatitis.J Med Virol，1996,48:60-67.
[4]Linnen J,Jr Wages J,Zhang-keck ZY,et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:A transfusion-transmissible agent.Science， 1996,271:505-508.
, 百拇医药
[5]Nishizawa T, Okamato H,Konishi K,et al.A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transamonase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophys Res Commun，1997,241:92-97.
[6]Okamato H,Nishizawa T, Kayto N,et al.Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res，1998,10:1-16.
[7]Shen HD,Choo KB,Wu TC,et al.Hepatitis B virus infection of cord blood leukocytes.J Med Virol,1987,22:221-223.
, 百拇医药
[8]Yoffe B,Noonan CA,Melnick JL,et al.Hepatitis B virus DNA in mononuclear cells and analysis of cell sub-set for the presence of replicative intermediates of viral DNA.J Infect Dis,1986,153:471-477.
[9]Lohr H,Fleischer B,Michel G,et al.HCV antibody secretion in vitro by peripheral blood lymphocytes.J Hept,1992,14:112-115.
[10]Shimizu YK,Iwamoto A,Hijikata M,et al.Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line. Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:5477-5481.
[11]周育森,何忠平,董京芳，等.中国人TTV部分基因克隆及序列测定.军事医学科学院院刊，1998，22:107-109.
[12]周育森,董京芳,周乙华，等.中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学.中华预防医学杂志，1998,32:352-355.
收稿日期：1999-02-02, 百拇医药
单位：何忠平 冯惠忠 刘顺爱 徐克沂 崔振宇(100011 北京地坛医院)；周育森 王海涛(军事医学科学院微生物和流行病研究所)
关键词：DNA病毒；肝炎；聚合酶链反应
中华医学杂志000105 摘 要：目的 了解TTV阳性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)TTV DNA存在及复制情况。方法 采用巢式PCR(nPCR)技术和绿豆芽核酸酶消化单链DNA方法研究在PBMC中的TTV DNA存在及复制情况,并克隆测序分析证实。16例血标本(血清和PBMC)和粪便标本来自北京地坛医院1997年10月～1998年10月住院患者。结果 16例TTV阳性肝炎患者PBMC中有14例TTV DNA阳性,粪便中有5例TTV DNA阳性，并用绿豆芽核酸酶消化提取的14例TTV DNA阳性患者PBMC DNA,有2例为TTV DNA阳性,提示TTV DNA能在PBMC中存在和感染。5例非甲-庚型肝炎患者(BDH1-5)的血清、 PBMC和粪便中TTV DNA片段部分序列经克隆测序，同一患者不同标本(血清、PBMC 和粪便)序列未见差异,与日本株和中国株相应位置核苷酸序列同源性大于95%,5例患者序列之间核苷酸同源性在95%～99%。粪便nPCR阳性患者血清病毒量明显大于粪便nPCR阴性患者。结论 TTV DNA可在TTV阳性肝炎患者PBMC 中存在,表明肝细胞并非TTV感染的唯一场所。
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Presence and replication of TTV DNA in peripheral blood mononuclear cells from hepatitis patients with TTV infection
HE Zhongping*
(*Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011，China)
FENG Huizhong, ZHOU Yusen, et al.
Abstract：Objective To study the presence and replication of TTV DNA in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from hepatitis patients with TTV infection. Methods Nested-PCR (nPCR) was performed for detecting the TTV DNA from the sera, PBMCs and feces of 16 patients with non- A to non-G hepatitis in Beijing Ditan Hospital from Oct. 1997 to Oct. 1998. PBMC DNAs were aslo digested by mung bean nuclease and amplified by nPCR to clasify if TTV DNA was still positive. nPCR products of the sera, PBMCs and feces of 5 hepatitis patients with non-A to non-G hepatitis were cloned and sequenced. Results 14 of the16 samples of PBMC and 5 of the 16 samples of the feces were TTV DNA positive. Two of the 14 samples of the PBMC were still positive after the digestion and amplification of the single-stand DNA. Sequence analysis showed that there was more than 95% nucleotide homology among the sequenced 5 clones (from the sera,PBMC and feces of the 5 patients) and reported AB008394 (from Japan) and AF079173 (from China). Virus loading of patients whose feces were positive by nPCR was obviously more than the patients with negative TTV DNA. Conclusion TTV DNA can exist and replicate in the PBMC； the hepatocytes of patients with TTV infection are not the only place of TTV existence and replication.
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Key words：DNA virus； Hepatitis; Polymerase chain reaction▲
TT病毒(TTV)是一新发现的单股DNA病毒,与肝功能异常有密切关系,可能属嗜肝病毒,其致病机理还不甚明了,是否感染肝细胞或外周血单个核细胞(PBMC)还缺乏依据。乙型肝炎病毒已被证实可以感染人PBMC。丙型肝炎病毒(HCV)和庚型肝炎病毒(HGV)均能在人PBMC内存在及复制。据此,我们选择了16例血清TTV DNA PCR阳性患者的PBMC,采用巢式PCR(nPCR)方法测定其PBMC中是否存在TT病毒复制;对TTV DNA PCR阳性患者的血清、PBMC和粪便标本部分扩增产物进行克隆测序和分析， 并观察血清TTV 含量与粪便排毒情况。
对象与方法
一、临床资料
, 百拇医药 1.流行病学： 16例患者中男10例，女6例，平均年龄41岁。诊断为急性肝炎者12例，其他肝病者4例。13例患者并无输血及血制品、吸毒以及不洁注射史，提示存在非血源性的感染传播途径。其他3例分别有针灸治疗史、静脉注射史和肝炎患者密切接触史。这些非甲-庚型肝炎患者中排除甲至庚型肝炎病毒、EBV、CMV感染，提示TTV可能是一新的肝炎致病因子[1，2]。
2.粪便排毒：采用nPCR法检测16例非甲-庚型肝炎患者粪便标本，5例TTV DNA阳性，阳性率为31.3%。提示TTV可从宿主的粪便排出，能通过粪-口途径传播。大部分患者在ALT恢复正常后1～2周粪便中未能检测到TTV DNA,少部分患者持续排毒，同时出现ALT反复波动或轻度持续异常。
3.临床过程：12例以急性肝炎首次发病,其临床症状、肝功能损害程度及病程与单纯急性甲型肝炎或戊型肝炎类似。这些患者起病初期大部分有乏力、纳差，同时伴眼黄、尿黄。少部分患者有肝区不适感和发热。ALT中位数为260 U/L(赖氏法)，总胆红素中位数为120 μmol/L。这些患者分别采用促肝细胞生长素、胸腺肽、强力宁、茵栀黄等一般保肝药物治疗，治疗时间为21～90 d。从出现临床症状到肝功能恢复正常时间，平均病程为42天。16例患者中有2例重症肝炎、1例慢性肝炎和1例慢性肝硬化患者。
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二、标本来源及PBMC的分离
16份血标本(血清和PBMC)和粪便标本来自北京地坛医院1997年10月～1998 年10月住院患者,其血清TTV DNA nPCR阳性,临床诊断为非甲-庚型肝炎,均为甲、乙、丙、丁、戊、庚型(美国Abbott公司,EIA方法或PCR法)和EBV、CMV抗体(德国Human公司,EIA方法)两次检测阴性,ALT异常(>40 U/L,赖氏法),并排除自身免疫性疾病、药物性肝炎、酒精性肝炎、阻塞性黄疸等。5ml 乙二氨四乙酸(EDTA)抗凝血加5 ml 1640培养液稀释,置于淋巴细胞分层液(Ficoll-hypaque)上层,进行梯度离心,吸取界面单个核细胞层。用5 ml PBS洗3次后于-70℃冻存备检。
三、试剂
Taq酶、dNTPs、T4DNA连接酶购自华美公司,T-vector 、XL1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。 STG试剂盒购自美国Biotronic公司, QIAprep MiniPrep质粒提取试剂为德国QIAgen公司产品。淋巴细胞分层液(Ficoll-hypaque)、 1640培养液为美国Sigma公司产品。绿豆芽核酸酶(mung bean nuclease, MBN)为美国Promega公司产品。
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四、DNA的提取
用STG法,取50 μl 血清、(2×105)单个核细胞和粪便标本提取液,加80 μl STG缓冲液,混匀,100℃变性5 min,13 000 r/min离心10 min, 剔除变性蛋白,加90 μl异丙醇沉淀,室温离心,沉淀物干燥后用无菌水10 μl溶解。
五、巢式PCR (nPCR)检测
参考日本株TTV基因序列设计2对引物,引物序列分别为：P1:5′-CACCAGGAGCATATACAGA-3′;P2:5′-TCTTCTTGCTGGTGAAA-3′;P3:5′-ACAGA-CAGAGGAGAAGGC-3′;P4:5′-AACAGGCACATTACT-ACT-3′。其中P1/P2为外引物,P3/P4为内引物。第1轮PCR反应条件:模板4 μl、 10×PCR 缓冲液3 μl、dNTPs 0.8 μmol/L、P1/P2 0.1 μmol/L,30 μl反应体积,94℃预变性180 s,94℃40 s、55℃40 s、72℃40 s,30个循环。第2轮PCR反应条件:取第1轮PCR产物2 μl作模板,10×PCR 缓冲液3 μl 、dNTPs 0.8 μmol/L、P3/P4 0.1 μmol/L, 30 μl反应体积,94℃预变性180 s,94℃40 s、55℃40 s、72℃40 s,30个循环。取第2轮PCR产物10 μl用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察结果。第2次PCR扩增产物为309 bp。每次PCR均设阴性和阳性对照,阴性对照为正常人PBMC及TTV感染病人PBMC最后一次洗涤液。
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六、PCR产物的克隆和测序
PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后,直接与T载体连接,转化XL1-Blue宿主菌。挑取白色菌落用PCR和酶切鉴定,对阳性菌落接种培养,提取质粒,采用Sanger末端终止法,于ABI 377型自动测序仪进行双链测序。
七、DNA序列的计算机分析
采用CLUSTWAL和BLAST软件程序进行分析。
八、单双链鉴定
STG法提取的TTV DNA一式两份，各约1 μg， 一份经MBN(20 U)消化4 h,经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后,进行nPCR扩增,另一份直接进行nPCR扩增,方法同前。因MBN以内切方式降解单链DNA和RNA,产生带5′-磷酸末端的核苷酸或寡核苷酸,而保持双链DNA的完整性。TT病毒是单股DNA病毒,其单股DNA在该酶的作用下应该被分解,但若此病毒在PBMC中复制或形成双链,就能抵抗该酶的作用。
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九、血清病毒半定量分析
将血清DNA提取液10 μl经1：101、1：102、1：103、1：104、1：105、1：106稀释，分别取4 μl按上述nPCR方法进行操作。
结果
一、血清、PBMC和粪便中TTV感染的nPCR检测
16例非甲-庚型肝炎患者,其血清用nPCR方法检测TTV DNA均为阳性,采取患者PBMC(2×105个细胞)和粪便(约5 g),用STG法提取TTV DNA, PBMC和 粪便标本nPCR方法与血清标本nPCR方法相同。其中14例TTV感染的PBMC为TTV DNA阳性,5例TTV感染的粪便为TTV DNA阳性；正常人PBMC和粪便对照为阴性,阳性对照(TTV感染患者血清)为阳性。
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二、 PBMC中TTV DNA单双链鉴定
14例患者PBMC用STG法提取DNA后,一份经直接nPCR扩增，均为阳性。另一份用MBN消化, 经nPCR方法进行扩增。其中有2例患者PBMC DNA在MBN作用下仍为TTV DNA阳性，同时设立阴阳对照。2例患者PBMC DNA酶消化后nPCR扩增产物经克隆测序证实。
三、血清TTV DNA 半定量分析
16例非甲-庚型肝炎患者各种标本中TTV DNA经半定量分析血清病毒量在101～105之间。5例粪便nPCR阳性患者，血清病毒量在103～105之间，粪便nPCR阴性患者，血清病毒量在101～102之间。
四、血清、PBMC和粪便中TTV DNA部分核酸序列分析
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将5例(TTV BDH1～5)非甲-庚型肝炎患者血清、PBMC和粪便中分离出的309bp TTV DNA基因片段进行克隆后测序分析,同一患者不同标本序列未见差异；5个分离株序列与日本株(AB08394) 和中国株(AF079173)相对应位置核苷酸同源性均在95%以上,各分离株之间核苷酸同源性在95%～98%(表1)。序列分析比较结果见图1。
表1 TTV北京地坛医院分离株与日本株和中国株核苷酸同源性比较 Isolates
AB08394
CHN1
BDH1
BDH2
BDH3
BDH4
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BDH5
CHN1
0.98
BDH1
0.99
0.97
BDH2
0.98
0.99
0.97
BDH3
0.98
0.98
, 百拇医药
0.96
0.98
BDH4
0.97
0.96
0.96
0.97
0.95
BDH5
0.97
0.96
0.96
0.95
, 百拇医药
0.96
0.95
注:AB08394为日本株,CHN1为中国株(AF079173),BDH1～5为TTV北京地坛医院分离株
图1 非甲-庚型肝炎患者TTV北京地坛医院分离株(TTV BDH1～5)与日本株和中国株核苷酸序列比较
讨论
继人类发现甲、乙、丙、丁、戊(A～E)5型肝炎病毒后,仍有一些输血后或散发性的肝炎不属于上述5型肝炎病毒感染。此类非甲-戊肝炎约占肝炎发病的10%～20%。1995年美国研究者先后报道发现庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C),而HGV感染者仅占非甲～戊型肝炎患者的2.1%～15.0%,且对HGV的致病性存在不同看法[3，4]。1997年底日本学者通过代表性差异技术(RDA)发现一种单股DNA病毒,研究表明与ALT异常有明确关系,由输血和血制品、吸毒或其他途径传播,可能是引起非甲-庚型急慢性肝炎的一种新病原,命名为TTV[5，6]。自从TTV发现以来,引起各国病毒学家的极大关注,正在从各个不同方面对TTV进行研究,渴望对TTV有一个更深层次的认识。乙型肝炎病毒已被证实可以感染人外周血PBMC,并有部分HBV基因可在PBMC内表达,被认为可能是导致乙型肝炎患者免疫功能异常的重要原因[7，8]。丙型肝炎病毒(HCV)和庚型肝炎病毒(HGV)均能在人外周血PBMC中存在及复制。HCV导致慢性肝炎的比例较高,HCV感染后所发生的肝硬化过程可能是病毒直接作用的结果。有证据表明,外周血淋巴细胞在体外分泌抗-HCV抗体,故HCV除嗜肝脏外还有其他的细胞嗜性,可能作为病毒长期滞留的场所,引起病毒持续感染。HCV在免疫系统中的存在和复制,可能是导致丙型肝炎患者免疫缺陷、肝细胞损伤及病程迁延的重要原因[9，10]。但是,有关TTV在PBMC中感染及复制的研究报道甚少。
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我们采用nPCR技术和MBN对其进行研究,结果表明，16例TTV DNA阳性的非甲-庚型肝炎患者PBMC中有14例存在TTV DNA阳性;并用MBN对提取的PBMC DNA进行消化,其中有2例仍然阳性。为排除假阳性，每份标本均一式两份，一份经直接nPCR,另一份经MBN酶切消化后nPCR，同时设立阴阳对照。由此可见,87.5%(14/16)患者PBMC中存在TTV DNA,14.3%(2/14)患者PBMC经MBN酶切消化后nPCR仍为阳性，说明TTV有可能在其中进行复制,表明肝细胞并非TTV的存在和感染的唯一场所。另有12例患者PBMC经MBN酶切消化后nPCR为阴性，有几种可能：(1) PBMC中只有单链TTV DNA,并未形成双链DNA。(2)PBMC中既有单链，又有双链，而形成双链DNA较少，未达到检测量。(3)PBMC中双链DNA达到检测量，由于操作原因损耗未检出。下一步通过原位杂交和原位PCR技术来研究TTV在PBMC中的具体部位及分布,其能否整合到人体染色体仍需要进一步研究。
我们对5例患者的血清、PBMC 和粪便标本 DNA nPCR扩增均阳性的产物分别进行克隆测序, 同一患者不同标本(血清、PBMC 和粪便)序列未见差异,与日本株和中国株的核苷酸同源性在95%以上,证明为同一病毒不同分离株。这些分离株之间核苷酸同源性在95%～99%之间,说明核苷酸变异幅度不大,还未见到不同的基因型[11，12]。■
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收稿日期：1999-02-02, 百拇医药