灵芝多糖对小鼠巨噬细胞cAMP含量的影响
作者：李明春 梁东升 许自明 雷林生 杨淑琴
单位：李明春(青岛海军401医院 药剂科，山东 青岛 266071)；梁东升(青岛海军401医院 药剂科，山东 青岛 266071)；许自明(青岛海军401医院 药剂科，山东 青岛 266071)；雷林生(第一军医大学 药理教研室，广东 广州 510515)；杨淑琴(第一军医大学 药理教研室，广东 广州 510515)
关键词：灵芝多糖；cAMP；巨噬细胞
中国中药杂志000115 摘 要：目的：研究灵芝多糖(GLB7)对小鼠巨噬细胞(MФ)内cAMP含量的影响，为其免疫增强作用机制提供依据。方法：采用细胞培养和竞争性蛋白结合分析法测定小鼠腹腔MФ中cAMP含量。结果：GLB7能剂量依赖性引起小鼠腹腔MФ中cAMP浓度快速升高，5 min达峰值，之后缓慢下降，至30 min时基本恢复原来水平。结论：GLB7引起小鼠MФcAMP浓度快速升高，可能与其增强小鼠免疫功能有关。
, http://www.100md.com
Effect of Ganoderma Polysaccharides on cAMP in Murine
Peritoneal Macrophages
LI Ming-chun LIANG Dong-sheng XU Zi-ming
(Department of Pharmacy,Navy 401 Hospital,Shandong Qingdao 266071，China)
LEI Lin-sheng YANG Shu-qin
(Department of Pharmacology,First Military Medical University,Guangdong Guangzhou 510515 ，China)
, 百拇医药
Abstract：Objective:Investigating the effect of GLB7 on cAMP in murine peritoneal macrophages to provide a scientific evidence for the immunomodulatory mechanism.Method:Cell culture and radio-immunological assay of cAMP were used.Result:GLB7 increased the production of cAMP in a concentration and time dependent manner in murine peritoneal macrophages.Conclusion:The immunopotentiating effect of GLB7 may be due to the activation of macrophages that leads to the increase of cAMP.
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Key words：Ganoderma polysaccharide;cAMP; macrophage▲
灵芝多糖被公认为是灵芝的主要活性成分。70年代日本学者率先报道灵芝多糖具有抗肿瘤作用[1]，国内学者研究灵芝“扶正固本”的作用机制时，发现灵芝多糖具有免疫增强作用，认为灵芝多糖的抗肿瘤作用是通过提高动物的免疫功能而介导的[2]。目前的研究证实灵芝多糖能促进混合淋巴细胞培养反应，促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强DNA多聚酶α的活性以及促进白细胞介素2的分泌等[3～5]，但灵芝多糖免疫调节作用的确切机制仍不明确。本文利用放射免疫测定技术，研究灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞(MФ)cAMP的影响，以探讨灵芝多糖的作用机制。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 灵芝多糖(GLB7)：按文献方法提取[6，7]，化学组成是以葡萄糖、半乳糖为主的杂多糖，糖苷键连接方式以β(1→4)为主，稍多α(1→6)，分子量9000。实验时以RPMI-1640培养基或Hepes缓冲液配成所需浓度，Ф 0.22 μm滤膜过滤，消毒，4 ℃保存；RPMI-1640培养基：Gibco生命技术公司产品，使用时配成RPMI-1640完全培养基，内含：25 mmol.L-1Hepes,2 mmol.L-1L-谷胺酰胺、100 U.ml-1青霉素、100 μg.ml-1链霉素、0.2 % NaHCO3，10%胎牛血清(FCS)；FCS：杭州四季青牛场；环磷酸腺苷测定药盒：中国原子能科学研究院产品；Hepes缓冲液：pH 7.2～7.4，内含145 mmol.L-1NaCl，5 mmol.L-1KCl，1 mmol.L-1CaCl2.2H2O，0.5 mmol.L-1MgSO4.7H2O，5 mmol.L-1Glucose，10 mmol.L-1Hepes;Hank's液：pH 7.2～7.4，内含NaCl，KCl，MgCl2，MgSO4，CaCl2，Na2HPO4，KH2PO4，Glucose；Tris-HCl缓冲液：pH 7.2～7.4。
, 百拇医药
1.2 实验动物 BALB/c纯系小鼠，♀
不限，8周龄，体重(19.6±1.4) g，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.3 巨噬细胞(MФ)的培养 按文献[8]方法无菌取小鼠腹腔MФ，经苔盼蓝染色细胞活率95%以上，调整细胞浓度为105～107 个/ml，接种于多孔培养板中，置含5%CO2，95%空气孵箱中，37 ℃孵育24 h。对照组皆以RPMI-1640完全培养基替代，实验组中加测试药物等处理因素皆以RPMI-1640完全培养基溶解和稀释。
1.4 MФ中环磷酸腺苷(cAMP)的测定[9]
1.4.1 样品提取 取和GLB7培养一定时间的MФ，冰浴下超声粉碎，3 000 r.min-1离心10 min，去除沉淀，上清液在70～75 ℃水浴下蒸干，测定时干渣重溶于适量的TE缓冲液(pH 7.5)。
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1.4.2 cAMP的测定 采用竞争性蛋白结合分析法。整个反应都在冰浴下进行，反应总体积为180 μl。按顺序向编号试管内加入试剂，加入结合蛋白后轻轻摇匀；培养2 h后，除CT管外，每管加入吸附剂50 μl，摇匀，立即在1000 r.min-1离心6～7 min；吸取上清120 μl，置测量杯中，加1.5 ml无水乙醇，摇匀，再加入闪烁液3.5 ml，盖严、摇匀，在液体闪烁仪上测定放射性活度。测得的结果按要求作标准曲线并求算样品中cAMP含量。
2 结果
分别以5，10，20，40 μg.ml-1GLB7按一定时间作用于小鼠MФ，测得其中cAMP含量，结果见表1。实验测得MФ中cAMP基础水平为(1.84±0.22) pmol.40 μl-1(n=3,
±s)。
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表1 GLB7对小鼠腹腔巨噬细胞cAMP含量的影响 组别
剂量/
μg.ml-1
cAMP/pmol.40μl-1
2.5 min
5 min
10 min
15 min
30 min
60 min
, 百拇医药
对照
1.88±0.21
1.90±0.17
1.86±0.24
1.79±0.23
1.87±0.33
1.83±0.19
GLB7
5
8.14±0.441)
8.74±0.661)
, 百拇医药
6.23±0.471)
2.10±0.272)
1.81±0.23
1.86±0.22
10
9.13±0.361)
10.34±0.721)
6.56±0.311)
2.16±0.442)
1.88±0.38
, 百拇医药
1.84±0.28
20
9.88±0.411)
11.86±0.631)
6.94±0.241)
2.32±0.192)
1.74±0.28
1.78±0.24
40
10.23±0.561)
, 百拇医药 13.91±0.471)
7.18±0.411)
2.33±0.312)
1.88±0.28
1.74±0.21
注：①±s ②n=3 ③与对照组比 1)P<0.01 2)P<0.05
从以上结果可以看出：GLB7在2.5 min以内可引起小鼠腹腔MФ中cAMP浓度快速升高，5 min时达到峰值，之后缓慢下降，至30 min时基本恢复原来水平。在5 min时考察GLB7与cAMP之间的量效关系，可见随着GLB7浓度的升高，cAMP浓度也随之升高，二者的相关系数r=0.9749，表明GLB7引起MФ中cAMP含量的变化具有剂量相关性。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 细胞孵育至2 h左右时，以PBS或Hepes缓冲液冲洗2遍，冲洗掉未贴壁细胞，加入RPMI-1640完全培养基继续培养至24 h。经此方法处理后可获得95 %以上MФ，细胞浓度可保持在105～106 个.ml-1。
3.2 在cAMP系统中，G蛋白起核心作用[10]。受体活化通过G蛋白偶联到腺苷酸环化酶上，由G蛋白决定该酶活性的兴奋或抑制，从而决定了cAMP浓度的升降而制约细胞的各种效应。cAMP的信使作用则通过对依赖cAMP蛋白激酶(PKA)所调控。我们在实验中观察到，GLB7可剂量依赖性引起小鼠腹腔MФ内cAMP浓度快速升高，从其作用表达的时间上看，这应该是GLB7产生效用的上游事件。推断这是GLB7激活兴奋性G蛋白，在ATP的作用下活化腺苷酸环化酶，从而引起cAMP浓度的升高，而cAMP的全部效应都是通过PKA使其底物发生特异性磷酸化而实现的。由此我们可以得出，GLB7通过引起小鼠腹腔MФ中cAMP浓度的升高，从而引起PKA的活化，激活MФ。这很可能是GLB7增强小鼠免疫功能的重要途径。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39400165)
参考文献：
[1]Sasaki T.Antitumor Polysaccharides from Some Polyporaceae,Ganoderma Applanatum(Pers.)Pat and Phellinus Linteus(Berk et Curt)Aoshima.Chem Pharm Bull,1971,19(4):821
[2]林志彬.灵芝多糖的免疫药理学研究及其意义.北京医科大学学报，1992，24(4)：271
[3]雷林生，林志彬.灵芝多糖对混合淋巴细胞培养的影响.基础医学与临床，1992，12(2)：59
[4]Lei L S,Lin Z H B.Effect of Ganoderma Polysaccharides on T Cell Subpopulations and Production of Interleukin 2 in Mixed Lymphocyte Response.Acta Pharmaceutica Sinica,1992,27(5):331
, http://www.100md.com
[5]Lei L S,Lin Z H B.Effect of Ganoderma Polysaccharides on the Activity of DNA Polymerase α in Spleen Cells Stimulated by Alloantigens in Mice in Vitro.J Beijing Med Univ,1991,23(4):329
[6]李荣芷，何云庆.灵芝抗衰老机理与活性成分灵芝多糖的化学与构效研究.北京医科大学学报，1991，23(6)：473
[7]何庆云，李荣芷，陈 琪，等.灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的化学研究.北京医科大学学报，1989，21(3)：225
[8]鄂 征.组织培养技术.第二版.北京：人民卫生出版社，1993.185
[9]林曙光.细胞信号转导系统.天津：天津科学技术出版社，1996.106
[10]Iyengar R.Molecular and Functional Diversity of Mammalian Gs-stimulated Adenylyl Cyclases.FASEB J,1993,7(9):768
收稿日期：1998-12-07, 百拇医药
单位：李明春(青岛海军401医院 药剂科，山东 青岛 266071)；梁东升(青岛海军401医院 药剂科，山东 青岛 266071)；许自明(青岛海军401医院 药剂科，山东 青岛 266071)；雷林生(第一军医大学 药理教研室，广东 广州 510515)；杨淑琴(第一军医大学 药理教研室，广东 广州 510515)
关键词：灵芝多糖；cAMP；巨噬细胞
中国中药杂志000115 摘 要：目的：研究灵芝多糖(GLB7)对小鼠巨噬细胞(MФ)内cAMP含量的影响，为其免疫增强作用机制提供依据。方法：采用细胞培养和竞争性蛋白结合分析法测定小鼠腹腔MФ中cAMP含量。结果：GLB7能剂量依赖性引起小鼠腹腔MФ中cAMP浓度快速升高，5 min达峰值，之后缓慢下降，至30 min时基本恢复原来水平。结论：GLB7引起小鼠MФcAMP浓度快速升高，可能与其增强小鼠免疫功能有关。
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Effect of Ganoderma Polysaccharides on cAMP in Murine
Peritoneal Macrophages
LI Ming-chun LIANG Dong-sheng XU Zi-ming
(Department of Pharmacy,Navy 401 Hospital,Shandong Qingdao 266071，China)
LEI Lin-sheng YANG Shu-qin
(Department of Pharmacology,First Military Medical University,Guangdong Guangzhou 510515 ，China)
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Abstract：Objective:Investigating the effect of GLB7 on cAMP in murine peritoneal macrophages to provide a scientific evidence for the immunomodulatory mechanism.Method:Cell culture and radio-immunological assay of cAMP were used.Result:GLB7 increased the production of cAMP in a concentration and time dependent manner in murine peritoneal macrophages.Conclusion:The immunopotentiating effect of GLB7 may be due to the activation of macrophages that leads to the increase of cAMP.
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Key words：Ganoderma polysaccharide;cAMP; macrophage▲
灵芝多糖被公认为是灵芝的主要活性成分。70年代日本学者率先报道灵芝多糖具有抗肿瘤作用[1]，国内学者研究灵芝“扶正固本”的作用机制时，发现灵芝多糖具有免疫增强作用，认为灵芝多糖的抗肿瘤作用是通过提高动物的免疫功能而介导的[2]。目前的研究证实灵芝多糖能促进混合淋巴细胞培养反应，促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强DNA多聚酶α的活性以及促进白细胞介素2的分泌等[3～5]，但灵芝多糖免疫调节作用的确切机制仍不明确。本文利用放射免疫测定技术，研究灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞(MФ)cAMP的影响，以探讨灵芝多糖的作用机制。
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 灵芝多糖(GLB7)：按文献方法提取[6，7]，化学组成是以葡萄糖、半乳糖为主的杂多糖，糖苷键连接方式以β(1→4)为主，稍多α(1→6)，分子量9000。实验时以RPMI-1640培养基或Hepes缓冲液配成所需浓度，Ф 0.22 μm滤膜过滤，消毒，4 ℃保存；RPMI-1640培养基：Gibco生命技术公司产品，使用时配成RPMI-1640完全培养基，内含：25 mmol.L-1Hepes,2 mmol.L-1L-谷胺酰胺、100 U.ml-1青霉素、100 μg.ml-1链霉素、0.2 % NaHCO3，10%胎牛血清(FCS)；FCS：杭州四季青牛场；环磷酸腺苷测定药盒：中国原子能科学研究院产品；Hepes缓冲液：pH 7.2～7.4，内含145 mmol.L-1NaCl，5 mmol.L-1KCl，1 mmol.L-1CaCl2.2H2O，0.5 mmol.L-1MgSO4.7H2O，5 mmol.L-1Glucose，10 mmol.L-1Hepes;Hank's液：pH 7.2～7.4，内含NaCl，KCl，MgCl2，MgSO4，CaCl2，Na2HPO4，KH2PO4，Glucose；Tris-HCl缓冲液：pH 7.2～7.4。
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1.2 实验动物 BALB/c纯系小鼠，♀
不限，8周龄，体重(19.6±1.4) g，由第一军医大学实验动物中心提供。1.3 巨噬细胞(MФ)的培养 按文献[8]方法无菌取小鼠腹腔MФ，经苔盼蓝染色细胞活率95%以上，调整细胞浓度为105～107 个/ml，接种于多孔培养板中，置含5%CO2，95%空气孵箱中，37 ℃孵育24 h。对照组皆以RPMI-1640完全培养基替代，实验组中加测试药物等处理因素皆以RPMI-1640完全培养基溶解和稀释。
1.4 MФ中环磷酸腺苷(cAMP)的测定[9]
1.4.1 样品提取 取和GLB7培养一定时间的MФ，冰浴下超声粉碎，3 000 r.min-1离心10 min，去除沉淀，上清液在70～75 ℃水浴下蒸干，测定时干渣重溶于适量的TE缓冲液(pH 7.5)。
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1.4.2 cAMP的测定 采用竞争性蛋白结合分析法。整个反应都在冰浴下进行，反应总体积为180 μl。按顺序向编号试管内加入试剂，加入结合蛋白后轻轻摇匀；培养2 h后，除CT管外，每管加入吸附剂50 μl，摇匀，立即在1000 r.min-1离心6～7 min；吸取上清120 μl，置测量杯中，加1.5 ml无水乙醇，摇匀，再加入闪烁液3.5 ml，盖严、摇匀，在液体闪烁仪上测定放射性活度。测得的结果按要求作标准曲线并求算样品中cAMP含量。
2 结果
分别以5，10，20，40 μg.ml-1GLB7按一定时间作用于小鼠MФ，测得其中cAMP含量，结果见表1。实验测得MФ中cAMP基础水平为(1.84±0.22) pmol.40 μl-1(n=3,
±s)。, http://www.100md.com
表1 GLB7对小鼠腹腔巨噬细胞cAMP含量的影响 组别
剂量/
μg.ml-1
cAMP/pmol.40μl-1
2.5 min
5 min
10 min
15 min
30 min
60 min
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对照
1.88±0.21
1.90±0.17
1.86±0.24
1.79±0.23
1.87±0.33
1.83±0.19
GLB7
5
8.14±0.441)
8.74±0.661)
, 百拇医药
6.23±0.471)
2.10±0.272)
1.81±0.23
1.86±0.22
10
9.13±0.361)
10.34±0.721)
6.56±0.311)
2.16±0.442)
1.88±0.38
, 百拇医药
1.84±0.28
20
9.88±0.411)
11.86±0.631)
6.94±0.241)
2.32±0.192)
1.74±0.28
1.78±0.24
40
10.23±0.561)
, 百拇医药 13.91±0.471)
7.18±0.411)
2.33±0.312)
1.88±0.28
1.74±0.21
注：①
±s ②n=3 ③与对照组比 1)P<0.01 2)P<0.05从以上结果可以看出：GLB7在2.5 min以内可引起小鼠腹腔MФ中cAMP浓度快速升高，5 min时达到峰值，之后缓慢下降，至30 min时基本恢复原来水平。在5 min时考察GLB7与cAMP之间的量效关系，可见随着GLB7浓度的升高，cAMP浓度也随之升高，二者的相关系数r=0.9749，表明GLB7引起MФ中cAMP含量的变化具有剂量相关性。
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3 讨论
3.1 细胞孵育至2 h左右时，以PBS或Hepes缓冲液冲洗2遍，冲洗掉未贴壁细胞，加入RPMI-1640完全培养基继续培养至24 h。经此方法处理后可获得95 %以上MФ，细胞浓度可保持在105～106 个.ml-1。
3.2 在cAMP系统中，G蛋白起核心作用[10]。受体活化通过G蛋白偶联到腺苷酸环化酶上，由G蛋白决定该酶活性的兴奋或抑制，从而决定了cAMP浓度的升降而制约细胞的各种效应。cAMP的信使作用则通过对依赖cAMP蛋白激酶(PKA)所调控。我们在实验中观察到，GLB7可剂量依赖性引起小鼠腹腔MФ内cAMP浓度快速升高，从其作用表达的时间上看，这应该是GLB7产生效用的上游事件。推断这是GLB7激活兴奋性G蛋白，在ATP的作用下活化腺苷酸环化酶，从而引起cAMP浓度的升高，而cAMP的全部效应都是通过PKA使其底物发生特异性磷酸化而实现的。由此我们可以得出，GLB7通过引起小鼠腹腔MФ中cAMP浓度的升高，从而引起PKA的活化，激活MФ。这很可能是GLB7增强小鼠免疫功能的重要途径。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39400165)
参考文献：
[1]Sasaki T.Antitumor Polysaccharides from Some Polyporaceae,Ganoderma Applanatum(Pers.)Pat and Phellinus Linteus(Berk et Curt)Aoshima.Chem Pharm Bull,1971,19(4):821
[2]林志彬.灵芝多糖的免疫药理学研究及其意义.北京医科大学学报，1992，24(4)：271
[3]雷林生，林志彬.灵芝多糖对混合淋巴细胞培养的影响.基础医学与临床，1992，12(2)：59
[4]Lei L S,Lin Z H B.Effect of Ganoderma Polysaccharides on T Cell Subpopulations and Production of Interleukin 2 in Mixed Lymphocyte Response.Acta Pharmaceutica Sinica,1992,27(5):331
, http://www.100md.com
[5]Lei L S,Lin Z H B.Effect of Ganoderma Polysaccharides on the Activity of DNA Polymerase α in Spleen Cells Stimulated by Alloantigens in Mice in Vitro.J Beijing Med Univ,1991,23(4):329
[6]李荣芷，何云庆.灵芝抗衰老机理与活性成分灵芝多糖的化学与构效研究.北京医科大学学报，1991，23(6)：473
[7]何庆云，李荣芷，陈 琪，等.灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的化学研究.北京医科大学学报，1989，21(3)：225
[8]鄂 征.组织培养技术.第二版.北京：人民卫生出版社，1993.185
[9]林曙光.细胞信号转导系统.天津：天津科学技术出版社，1996.106
[10]Iyengar R.Molecular and Functional Diversity of Mammalian Gs-stimulated Adenylyl Cyclases.FASEB J,1993,7(9):768
收稿日期：1998-12-07, 百拇医药