混合淋巴细胞培养上清液中细胞因子水平与移植肾急性排斥反应的联系
作者：刘利 张玉海
单位：刘利(首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科 北京，100050)；张玉海(首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科 北京，100050)
关键词：混合淋巴细胞培养；细胞因子；急性排斥
肾脏病与透析肾移植杂志000111 摘 要 目的：探讨混合淋巴细胞培养(MLC)上清液中细胞因子水平与肾移植术后急性排斥反应的关系，评价肾移植术前检测MLC上清液中细胞因子水平，作为预测急性排斥反应指标的临床价值。 方法： 选取48例接受同种异体肾移植术的患者为检测对象。在手术当日，分离其外周血单个核细胞(PBMC)与供者单个核细胞进行混合培养(反应组)，同时以受者单纯自身PBMC进行培养(对照组)。在培养第1、3、5天测MLC上清中IL-2和TNF-α水平，并观察其分泌动态变化。结果： 发生急性排斥反应的患者，在3次时间点上，两种细胞因子水平均高于肾功能稳定组，差异显著。在发生急性排斥反应和肾功能稳定的两组受者中，反应组较对照组细胞因子水平都有增加；急排的患者增加量高于肾功稳定的受者，差异显著。排斥组与肾功能稳定组两种细胞因子的分泌规律基本一致，但排斥组峰值都高于肾功能稳定组。结论：检测MLC上清液中细胞因子水平可以作为合理选择供受者、预测急性排斥反应的方法。
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ALTERATION OF CYTOKINES IN MLC SUPERNATANTS IN PATIENTS WITH ACUTE RENAL ALLOGRAFT REJECTION
LIU Li，ZHANG Yuhai
(Department of Urology，Beijing Friendship Hospital，Beijing 100050)
OBJECTIVE To explore the relationship between cytokines in MLC supernatants and acute rejection in renal allograft recipients and to evaluate the clinical value of cytokines determination in MLC donor selection. METHODOLOGY 34 male and 14 female randomly chosen renal allograft recipients were involved in this study.PBMC was separated routinely in donors and recipients.For one-way MLC，stimulator PBMC was treated with mitomycin C.Cell concentration was 1.5×106/ml.Responder PBMC (recipientsPBMC) was co-cultured with either mitomycin C treated autologous PBMC (control cultures) or mitomycine C treated allogenic(stimulated cultures)in duplicates of four.ELISA was used for the determination of IL-2 and TNF-α.Samples were collected and measured on day1，3，and 5. RESULTS In 20 patients who suffered acute rejection (RG group)，the levels of both cytokines in control and stimulated cultures were significantly higher than
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those of the 28 patients whose renal function was stable(SG group).Either in RG or SG on day 1，3，and 5，both cytokineslevels in stimulated cultures were higher than in control cultures.Cytokines gaps between stimulated and control cultrues were significantly higher in RG than in SG.The kinetics of IL-2 and TNF-α in rejection group was similar to stable group. CONCLUSION The increased levels of both IL-2 and TNF-α in MLC supernatant are of significance in predicting the occurrence of acute rejection in renal allograft recipients.And they may also be applied in the selection of compatible related and unrelated donors.
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Key words lymphocyte culture test cytokine acute renal rejection 影响肾移植成败的因素很多，术后的免疫性排斥反应是移植肾失功的最主要原因[1]。细胞因子，特别是IL-2、TNF-α在移植免疫中发挥重要作用[2～4]。近年来，通过各种方法测定细胞因子，可作为诊断急性排斥反应和反应强度的方法[2，5，6]。血IL-2和sIL-2R、IL-6、TNF-α水平都已用于临床，被作为监测排斥反应的指标。值得强调的是这些结论都依据肾移植术后血清标本的检测结果。而发生感染，特别是巨细胞病毒感染时，血清中炎性介质水平也会增高。环孢素A(CsA)等免疫抑制剂可引起某些细胞因子水平降低，而抗CD3单抗等治疗早期可激活体内T细胞，继而导致血清IL-2、TNF-α水平升高，给鉴别诊断带来一定困难[7]。作为体外研究排斥反应的重要模式——混合淋巴细胞培养(MLC)可以避免感染、用药及其它诸多因素导致的细胞因子水平的变化。本实验目的是进一步研究MLC上清液中IL-2和TNF-α的产生及其与排斥反应的关系。评估检测MLC上清液中细胞因子水平作为预测排斥反应及合理选择受者方法的可行性。
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1 对象和方法
1.1 检测对象 随机选取48例接受同种异体肾脏移植患者，男性34例，女性14例，平均年龄39.6(18～64)岁。术前供受者ABO血型相容，淋巴细胞毒性实验平均为1.7%(1.0%～5.0%)，HLA-A、B、Dr配型至少有一个位点相配。术后均采用CsA+硫唑嘌呤+强的松的三联免疫抑制治疗。
1.2 诊断标准
1.2.1 肾功良好 ①肾移植术后肾功能恢复良好且稳定；②无继发感染；③无急性排斥反应；④无CsA中毒。
1.2.2 急性排斥反应 ①临床有发热、少尿、双膝关节疼痛和移植肾区胀痛等症状。②体检：血压升高、移植肾肿大、质硬、压痛等。③实验室检查：BUN和SCr升高、尿脱落细胞中有大量淋巴细胞(>5个/HP)、CsA浓度偏低；④无继发感染和CsA中毒现象。⑤抗排斥治疗有效。⑥移植肾穿刺或切除病理标本符合急性排斥反应病理改变。
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1.3 实验方法
1.3.1 细胞制备 肾移植手术当日取健康供者和受者无菌抗凝血 10 ml，常规分离外周血单个核细胞(PBMC)，调整细胞浓度为1.5×109/L。①刺激细胞：供者或受者自身PBMC与丝裂霉素按9∶1(V/V)比例混合，在37℃孵育箱内处理30min，洗涤3次，备用。②反应细胞：未经丝裂霉素处理的受者PBMC，细胞浓度为1.5×109/L。
1.3.2 混合白细胞培养(MLC) 取反应细胞与刺激细胞置于96孔培养板，每孔两种细胞各100μl。设刺激细胞是受者自身PBMC孔为对照孔(组)，刺激细胞是供者PBMC孔为反应孔(组)。每份标本设4个复孔。培养板放入5%CO2、37℃条件下培养。细胞培养液系含10%(V/V)灭活小牛血清及RPIM 1640培养液。
1.3.3 细胞因子测定 在MLC第1、3、5天分别收集培养液上清置-80℃冰箱保存待检。人IL-2、TNF-α均采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定。试剂盒由深圳晶美生物制品公司提供，按使用说明书操作。
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1.4 统计学处理 数据以均数±标准差(
±s)表示，两组计量资料采用方差分析，两组计量资料采用两均数t检验，多组计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。以上数据均由国际通用数理统计软件包SPSS 7.5版完成。
2 结 果
在48例接受肾移植手术的患者中，术后发生急性排斥反应20例，为急性排斥组。其中男性14例，女性6例，平均年龄41.0(19～64)岁。术后移植肾功能保持稳定的28例，为肾功能稳定组。其中男性20例，女性8例，平均年龄38.6(18～58)岁。两组受者在性别、年龄、ABO血型、淋巴细胞毒反应及供肾等临床特征方面经统计学检查均无显著差异(见表1)。
2.1 急性排斥组与肾功能稳定组术前MLC上清液中IL-2水平的比较 见表2。
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从表中数值看，无论在哪一个时间点，发生急性排斥反应的患者，其反应组IL-2的水平均高于肾功能稳定组中反应组IL-2水平。除第1天外，在第3天和第5天，这种差异达到了显著水平(P<0.05)。两对照组之间相比，差异不显著。在所有时间点上，排斥与稳定两组的反应组IL-2水平均高于对照组IL-2水平，差异显著(P<0.05)。
Table 1. Clinical data of patients in the rejection group and the stable group
rejection group
stable group
patient number
20
28
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male/female
14/6
20/8
mean age(range)
41.0±13.6(19～64)
38.6±10.9(18～58)
ABO groups(A∶B∶AB∶O)
4∶6∶4∶6
5∶9∶5∶9
HLA matches
one or more matches
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one or more matches
MLC(1%；2%；
3%；4%；5%)
10；8；1；10
16；7；3；1；1
MLC：mixed lymphocyte cytotoxicity
2.2 急性排斥组与肾功能稳定组术前MLC上清液中TNF-α水平比较 见表3。
Table 2. Supernatants IL-2 in the rejection group and the stable group (ng/L，±s)
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rejection group
stable group
control panel
reaction panel
control panel
reaction panel
IL-2 at 1st day
19.2±7.30*
33.1±8.50
15.4±9.90*
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30.2±12.5
IL-2 at 3rd day
27.4±15.9*
74.1±25.3△
20.4±10.9*
37.6±11.4
IL-2 at 5th day
19.9±6.90*
40.6±13.6△
12.0±6.30*
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24.1±9.80
For control panel，mitogen stimulated PBMC is of recipient′s origin.And for reaction panel，mitogen stimulated PBMC is of donor′s origin.
*：comparison between control panel and reaction panel within each
group，P<0.05
△：comparison between reaction panels of each group，P<0.05Table 3. Supernatants TNF-α in the rejection group and the stable group(ng/L，±s)
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rejection group
stable group
control panel
reaction panel
control panel
reaction panel
IL-α at 1st day
123.5±17.0*
308.3±46.2△
131.4±47.2*
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215.8±83.6
IL-α at 3rd day
47.7±16.0*
96.4±16.9△
43.4±18.0*
71.7±24.8
IL-α at 5th day
67.2±13.8*
120.5±29.1△
19.6±6.70*
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35.1±5.70
For control panel，mitogen stimulated PBMC is of recipient′s origin.And for reaction panel，mitogen stimulated PBMC is of donor′s origin.
*：comparison between control panel and reaction panel within each
group，P<0.05
△：comparison between reaction panels of each group，P<0.05 从数据上看，排斥组与肾功能稳定组两组的反应组之间差异显著(P<0.05)，前者均数高于后者。每组组内反应组TNF-α水平均高于对照组水平。差异显著(P<0.05)。两对照组间比较，差异不显著。
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2.3 两组患者中，反应组与对照组相比，细胞因子分泌水平增加量的比较 见表4。Table 4. The increment of IL-2 and TNF-α production in the rejection group and stable group(ng/L，±s)
increment of IL-2
increment of TNF-α
RG
SG
RG
SG
1st day
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13.90±6.90
15.1±10.3
182.3±40.9**
84.4±56.1
3rd day
46.7±25.2**
17.2±8.60
48.7±4.30**
28.4±13.3
5th day
20.7±16.3*
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12.1±6.90
53.3±27.0**
15.5±3.70
*：comparison between RG and SG，P<0.05 **：comparison between RG and SG，P<0.01 在三次时间点上反应组细胞因子水平均高于对照组，但增加的程度却不同，急性排斥组高于肾功能稳定组(仅第1天IL-2增加量除外)。差异显著或非常显著(P<0.05或P<0.01)。
2.4 IL-2的分泌动态 根据细胞因子检测结果，按每一时间点上4次实验数据的平均值绘图。从图1中可见MLC后第1天上清液中即可测到IL-2。第3天分泌量达到高峰，然后下降，至第5天时基本恢复到第1天水平。发生急性排斥反应患者和肾功稳定患者的培养上清液中IL-2的变化较为一致，所区别的是，排斥组的各点值高于稳定组(见图1)。
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Fig.1. Dynamic changes of IL-2 production
Fig.2. Dynamic changes of TNF-α production
2.5 TNF-α分泌动态 两组患者中，其对照组与反应组之间，细胞因子水平变化的规律一致，在排斥组，MLC后第1天即达到峰值，第3天较第1天TNF-α水平下降，至第5天又有回升。稳定组第1天达到峰值，其后逐渐降低，至第5天达最低值(见图2)。
3 讨 论
肾移植术后的急性排斥反应涉及细胞免疫和体液免疫介导的免疫反应。无论是细胞免疫还是体液免疫都离不开细胞因子在其中发挥作用。与移植免疫相关的细胞因子种类很多，其中包括TNF-α和IL-2。近年来不断有利用检测细胞因子作为术后监测急性排斥反应指标的研究，并取得了较为肯定的结果[2，5，6]。为了排除肾移植术后免疫抑制剂的应用及感染，特别是巨细胞病毒感染等因素对细胞因子水平的影响，我们选择了MLC作为检测手段。MLC是移植排斥反应中机体对抗原识别的一种重要的体外模式。在此反应中，淋巴细胞的增生及某些细胞因子的释放，在一定程度上可预示体内的排斥反应发生与否[8]。另外，MLC无需在移植物植入体内就可以实施，在时序上有了前瞻性的特点，而不仅仅局限于术后监测。
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在本实验中，我们在移植术前的MLC后第1天、第3天和第5天分别检测了MLC上清液中两种细胞因子(IL-2、TNF-α)的水平。凡是发生急性排斥反应的患者，其MLC中反应组的细胞因子水平，明显高于肾功能稳定组中反应组的水平，而且差异显著(P<0.05)(仅第1天IL-2除外)。这说明两个反应组相比，发生排斥反应的MLC中，两种混合培养的细胞遗传背景差异较大，即MHC-Ⅱ类抗原的匹配程度低于肾功能稳定组。对照组与反应组的区别在于对照组中刺激细胞是经过丝裂霉素处理的受者自身PBMC，而非供者PBMC。故在理论上不难理解对照组细胞因子水平应该低于反应组。事实上，实验结果也证实了无论发生急性排斥反应与否，在三次时间点上三种细胞因子的水平反应组明显高于对照组，差异显著。两对照组相比，都是自身混合淋巴细胞反应(AMLR)，彼此之间并无显著差异。为了使实验数据更具有可比性，我们计算了细胞因子分泌增加量。即MLC与AMLR上清中细胞因子水平的差值(反应组-对照组)。结果发现，发生急性排斥反应的患者其细胞因子增加量超过了肾功能稳定组，差异达到显著或非常显著(P<0.05或P<0.01)。再次说明了急排组供受者间MLC-Ⅱ类抗原匹配程度不如肾功能稳定组供受者，即供受者遗传背景差异更大。
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就细胞因子的分泌动态而言，四种组别中，IL-2的分泌规律较为一致。均在第2天出现峰值，且排斥组各点值均高于相应的稳定组各点值。TNF-α的峰值出现在第1天，其后渐降，急性排斥组中第五天的TNF-α较第3天略有回升，但差别不大。本实验中患者术后出现急性排斥反应的时间平均在术后第12天。而细胞因子分泌的峰值、时序变化是MLC后第1、3、5天，即术后的第1、3、5天。比排斥反应出现的时间早近一周，满足了时序上预测评估排斥反应出现的要求。
淋巴细胞毒试验、HLA分型无显著差异的患者，肾移植术后预后不同。其中的原因错综复杂。术前多次输血、妊娠、二次移植等多种因素导致的机体免疫系统处于不同状态是不容忽视的重要因素。完全可以在移植术前，利用检测供受者细胞间特异性MLC上清液中的细胞因子水平的方法，对最适相容性相关和不相关的供受者做出筛选。凡淋巴细胞转化率高，上清液中细胞因子水平较高的个体可暂缓肾移植术。已手术的患者可列为“高危人群”，一旦术后表现出相应临床征兆，结合其它检查结果，优先考虑急性排斥的诊断。MLC上清液中细胞因子水平的变化，还启发人们利用抗细胞因子抗体逆转排斥反应的发生。这在许多动物实验模型中取得了成功。提供了又一治疗思路。
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综上所述，通过本实验我们认为：①检测MLC上清液中TNF-α和IL-2水平，可以作为肾移植术后预测急性排斥反应出现的一项指标：结合患者临床表现，配合其它检查方法，它在监测急性排斥反应方面有一定临床应用价值。②检测MLC中TNF-α和IL-2的水平，可以在肾移植术前作为筛选最佳供者、受者的辅助手段；是对常规组织配型实验的一种有益补充。③同时，它还启发提示人们利用抗细胞因子抗体治疗急性排斥反应。
参考文献
1，沈昌理.临床肾脏移植学.广州.广东科技出版社，1995.p16
2，何长民.器官移植免疫学.北京：人民军医出版社，1995.p36
3，Vilcek J，Lee TH.Tumor necrosis factor：new insights into the molecular mechanisms of its multiple actions.J Biol Chem，1991，266：7313
, 百拇医药
4，Imatgawa DK.The role of tumor necrosis factor in allograft rejection.Ⅱ.Evidence that antibody therapy against tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin enhances cardiac allograft survival in rats.Transplantation，1990，50：189
5，宋 涛.肾移植术后监测血清、尿液和肾组织液中肿瘤坏死因子的临床意义.中华泌尿外科杂志，1997，18：716
6，Tanaka J.Cytokine gene expression after allogeneic bone marrow transplantation.Leuk Lymphoma，1995，16(5～6)：413
7，毕爱华.医学免疫学.北京：人民军医出版社，1994.261～262
8，Danzer SG，Kirchner H，Rink L.Cytokine interactions in human mixed lymphocyte culture.Transplantation，1994，57：1638
收稿1999-09-13
修回1999-12-27, http://www.100md.com
单位：刘利(首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科 北京，100050)；张玉海(首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科 北京，100050)
关键词：混合淋巴细胞培养；细胞因子；急性排斥
肾脏病与透析肾移植杂志000111 摘 要 目的：探讨混合淋巴细胞培养(MLC)上清液中细胞因子水平与肾移植术后急性排斥反应的关系，评价肾移植术前检测MLC上清液中细胞因子水平，作为预测急性排斥反应指标的临床价值。 方法： 选取48例接受同种异体肾移植术的患者为检测对象。在手术当日，分离其外周血单个核细胞(PBMC)与供者单个核细胞进行混合培养(反应组)，同时以受者单纯自身PBMC进行培养(对照组)。在培养第1、3、5天测MLC上清中IL-2和TNF-α水平，并观察其分泌动态变化。结果： 发生急性排斥反应的患者，在3次时间点上，两种细胞因子水平均高于肾功能稳定组，差异显著。在发生急性排斥反应和肾功能稳定的两组受者中，反应组较对照组细胞因子水平都有增加；急排的患者增加量高于肾功稳定的受者，差异显著。排斥组与肾功能稳定组两种细胞因子的分泌规律基本一致，但排斥组峰值都高于肾功能稳定组。结论：检测MLC上清液中细胞因子水平可以作为合理选择供受者、预测急性排斥反应的方法。
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ALTERATION OF CYTOKINES IN MLC SUPERNATANTS IN PATIENTS WITH ACUTE RENAL ALLOGRAFT REJECTION
LIU Li，ZHANG Yuhai
(Department of Urology，Beijing Friendship Hospital，Beijing 100050)
OBJECTIVE To explore the relationship between cytokines in MLC supernatants and acute rejection in renal allograft recipients and to evaluate the clinical value of cytokines determination in MLC donor selection. METHODOLOGY 34 male and 14 female randomly chosen renal allograft recipients were involved in this study.PBMC was separated routinely in donors and recipients.For one-way MLC，stimulator PBMC was treated with mitomycin C.Cell concentration was 1.5×106/ml.Responder PBMC (recipientsPBMC) was co-cultured with either mitomycin C treated autologous PBMC (control cultures) or mitomycine C treated allogenic(stimulated cultures)in duplicates of four.ELISA was used for the determination of IL-2 and TNF-α.Samples were collected and measured on day1，3，and 5. RESULTS In 20 patients who suffered acute rejection (RG group)，the levels of both cytokines in control and stimulated cultures were significantly higher than
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those of the 28 patients whose renal function was stable(SG group).Either in RG or SG on day 1，3，and 5，both cytokineslevels in stimulated cultures were higher than in control cultures.Cytokines gaps between stimulated and control cultrues were significantly higher in RG than in SG.The kinetics of IL-2 and TNF-α in rejection group was similar to stable group. CONCLUSION The increased levels of both IL-2 and TNF-α in MLC supernatant are of significance in predicting the occurrence of acute rejection in renal allograft recipients.And they may also be applied in the selection of compatible related and unrelated donors.
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Key words lymphocyte culture test cytokine acute renal rejection 影响肾移植成败的因素很多，术后的免疫性排斥反应是移植肾失功的最主要原因[1]。细胞因子，特别是IL-2、TNF-α在移植免疫中发挥重要作用[2～4]。近年来，通过各种方法测定细胞因子，可作为诊断急性排斥反应和反应强度的方法[2，5，6]。血IL-2和sIL-2R、IL-6、TNF-α水平都已用于临床，被作为监测排斥反应的指标。值得强调的是这些结论都依据肾移植术后血清标本的检测结果。而发生感染，特别是巨细胞病毒感染时，血清中炎性介质水平也会增高。环孢素A(CsA)等免疫抑制剂可引起某些细胞因子水平降低，而抗CD3单抗等治疗早期可激活体内T细胞，继而导致血清IL-2、TNF-α水平升高，给鉴别诊断带来一定困难[7]。作为体外研究排斥反应的重要模式——混合淋巴细胞培养(MLC)可以避免感染、用药及其它诸多因素导致的细胞因子水平的变化。本实验目的是进一步研究MLC上清液中IL-2和TNF-α的产生及其与排斥反应的关系。评估检测MLC上清液中细胞因子水平作为预测排斥反应及合理选择受者方法的可行性。
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1 对象和方法
1.1 检测对象 随机选取48例接受同种异体肾脏移植患者，男性34例，女性14例，平均年龄39.6(18～64)岁。术前供受者ABO血型相容，淋巴细胞毒性实验平均为1.7%(1.0%～5.0%)，HLA-A、B、Dr配型至少有一个位点相配。术后均采用CsA+硫唑嘌呤+强的松的三联免疫抑制治疗。
1.2 诊断标准
1.2.1 肾功良好 ①肾移植术后肾功能恢复良好且稳定；②无继发感染；③无急性排斥反应；④无CsA中毒。
1.2.2 急性排斥反应 ①临床有发热、少尿、双膝关节疼痛和移植肾区胀痛等症状。②体检：血压升高、移植肾肿大、质硬、压痛等。③实验室检查：BUN和SCr升高、尿脱落细胞中有大量淋巴细胞(>5个/HP)、CsA浓度偏低；④无继发感染和CsA中毒现象。⑤抗排斥治疗有效。⑥移植肾穿刺或切除病理标本符合急性排斥反应病理改变。
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1.3 实验方法
1.3.1 细胞制备 肾移植手术当日取健康供者和受者无菌抗凝血 10 ml，常规分离外周血单个核细胞(PBMC)，调整细胞浓度为1.5×109/L。①刺激细胞：供者或受者自身PBMC与丝裂霉素按9∶1(V/V)比例混合，在37℃孵育箱内处理30min，洗涤3次，备用。②反应细胞：未经丝裂霉素处理的受者PBMC，细胞浓度为1.5×109/L。
1.3.2 混合白细胞培养(MLC) 取反应细胞与刺激细胞置于96孔培养板，每孔两种细胞各100μl。设刺激细胞是受者自身PBMC孔为对照孔(组)，刺激细胞是供者PBMC孔为反应孔(组)。每份标本设4个复孔。培养板放入5%CO2、37℃条件下培养。细胞培养液系含10%(V/V)灭活小牛血清及RPIM 1640培养液。
1.3.3 细胞因子测定 在MLC第1、3、5天分别收集培养液上清置-80℃冰箱保存待检。人IL-2、TNF-α均采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定。试剂盒由深圳晶美生物制品公司提供，按使用说明书操作。
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1.4 统计学处理 数据以均数±标准差(
±s)表示，两组计量资料采用方差分析，两组计量资料采用两均数t检验，多组计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。以上数据均由国际通用数理统计软件包SPSS 7.5版完成。2 结 果
在48例接受肾移植手术的患者中，术后发生急性排斥反应20例，为急性排斥组。其中男性14例，女性6例，平均年龄41.0(19～64)岁。术后移植肾功能保持稳定的28例，为肾功能稳定组。其中男性20例，女性8例，平均年龄38.6(18～58)岁。两组受者在性别、年龄、ABO血型、淋巴细胞毒反应及供肾等临床特征方面经统计学检查均无显著差异(见表1)。
2.1 急性排斥组与肾功能稳定组术前MLC上清液中IL-2水平的比较 见表2。
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从表中数值看，无论在哪一个时间点，发生急性排斥反应的患者，其反应组IL-2的水平均高于肾功能稳定组中反应组IL-2水平。除第1天外，在第3天和第5天，这种差异达到了显著水平(P<0.05)。两对照组之间相比，差异不显著。在所有时间点上，排斥与稳定两组的反应组IL-2水平均高于对照组IL-2水平，差异显著(P<0.05)。
Table 1. Clinical data of patients in the rejection group and the stable group
rejection group
stable group
patient number
20
28
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male/female
14/6
20/8
mean age(range)
41.0±13.6(19～64)
38.6±10.9(18～58)
ABO groups(A∶B∶AB∶O)
4∶6∶4∶6
5∶9∶5∶9
HLA matches
one or more matches
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one or more matches
MLC(1%；2%；
3%；4%；5%)
10；8；1；10
16；7；3；1；1
MLC：mixed lymphocyte cytotoxicity
2.2 急性排斥组与肾功能稳定组术前MLC上清液中TNF-α水平比较 见表3。
Table 2. Supernatants IL-2 in the rejection group and the stable group (ng/L，
±s), 百拇医药
rejection group
stable group
control panel
reaction panel
control panel
reaction panel
IL-2 at 1st day
19.2±7.30*
33.1±8.50
15.4±9.90*
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30.2±12.5
IL-2 at 3rd day
27.4±15.9*
74.1±25.3△
20.4±10.9*
37.6±11.4
IL-2 at 5th day
19.9±6.90*
40.6±13.6△
12.0±6.30*
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24.1±9.80
For control panel，mitogen stimulated PBMC is of recipient′s origin.And for reaction panel，mitogen stimulated PBMC is of donor′s origin.
*：comparison between control panel and reaction panel within each
group，P<0.05
△：comparison between reaction panels of each group，P<0.05Table 3. Supernatants TNF-α in the rejection group and the stable group(ng/L，
±s), http://www.100md.com
rejection group
stable group
control panel
reaction panel
control panel
reaction panel
IL-α at 1st day
123.5±17.0*
308.3±46.2△
131.4±47.2*
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215.8±83.6
IL-α at 3rd day
47.7±16.0*
96.4±16.9△
43.4±18.0*
71.7±24.8
IL-α at 5th day
67.2±13.8*
120.5±29.1△
19.6±6.70*
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35.1±5.70
For control panel，mitogen stimulated PBMC is of recipient′s origin.And for reaction panel，mitogen stimulated PBMC is of donor′s origin.
*：comparison between control panel and reaction panel within each
group，P<0.05
△：comparison between reaction panels of each group，P<0.05 从数据上看，排斥组与肾功能稳定组两组的反应组之间差异显著(P<0.05)，前者均数高于后者。每组组内反应组TNF-α水平均高于对照组水平。差异显著(P<0.05)。两对照组间比较，差异不显著。
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2.3 两组患者中，反应组与对照组相比，细胞因子分泌水平增加量的比较 见表4。Table 4. The increment of IL-2 and TNF-α production in the rejection group and stable group(ng/L，
±s)increment of IL-2
increment of TNF-α
RG
SG
RG
SG
1st day
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13.90±6.90
15.1±10.3
182.3±40.9**
84.4±56.1
3rd day
46.7±25.2**
17.2±8.60
48.7±4.30**
28.4±13.3
5th day
20.7±16.3*
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12.1±6.90
53.3±27.0**
15.5±3.70
*：comparison between RG and SG，P<0.05 **：comparison between RG and SG，P<0.01 在三次时间点上反应组细胞因子水平均高于对照组，但增加的程度却不同，急性排斥组高于肾功能稳定组(仅第1天IL-2增加量除外)。差异显著或非常显著(P<0.05或P<0.01)。
2.4 IL-2的分泌动态 根据细胞因子检测结果，按每一时间点上4次实验数据的平均值绘图。从图1中可见MLC后第1天上清液中即可测到IL-2。第3天分泌量达到高峰，然后下降，至第5天时基本恢复到第1天水平。发生急性排斥反应患者和肾功稳定患者的培养上清液中IL-2的变化较为一致，所区别的是，排斥组的各点值高于稳定组(见图1)。
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Fig.1. Dynamic changes of IL-2 production
Fig.2. Dynamic changes of TNF-α production
2.5 TNF-α分泌动态 两组患者中，其对照组与反应组之间，细胞因子水平变化的规律一致，在排斥组，MLC后第1天即达到峰值，第3天较第1天TNF-α水平下降，至第5天又有回升。稳定组第1天达到峰值，其后逐渐降低，至第5天达最低值(见图2)。
3 讨 论
肾移植术后的急性排斥反应涉及细胞免疫和体液免疫介导的免疫反应。无论是细胞免疫还是体液免疫都离不开细胞因子在其中发挥作用。与移植免疫相关的细胞因子种类很多，其中包括TNF-α和IL-2。近年来不断有利用检测细胞因子作为术后监测急性排斥反应指标的研究，并取得了较为肯定的结果[2，5，6]。为了排除肾移植术后免疫抑制剂的应用及感染，特别是巨细胞病毒感染等因素对细胞因子水平的影响，我们选择了MLC作为检测手段。MLC是移植排斥反应中机体对抗原识别的一种重要的体外模式。在此反应中，淋巴细胞的增生及某些细胞因子的释放，在一定程度上可预示体内的排斥反应发生与否[8]。另外，MLC无需在移植物植入体内就可以实施，在时序上有了前瞻性的特点，而不仅仅局限于术后监测。
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在本实验中，我们在移植术前的MLC后第1天、第3天和第5天分别检测了MLC上清液中两种细胞因子(IL-2、TNF-α)的水平。凡是发生急性排斥反应的患者，其MLC中反应组的细胞因子水平，明显高于肾功能稳定组中反应组的水平，而且差异显著(P<0.05)(仅第1天IL-2除外)。这说明两个反应组相比，发生排斥反应的MLC中，两种混合培养的细胞遗传背景差异较大，即MHC-Ⅱ类抗原的匹配程度低于肾功能稳定组。对照组与反应组的区别在于对照组中刺激细胞是经过丝裂霉素处理的受者自身PBMC，而非供者PBMC。故在理论上不难理解对照组细胞因子水平应该低于反应组。事实上，实验结果也证实了无论发生急性排斥反应与否，在三次时间点上三种细胞因子的水平反应组明显高于对照组，差异显著。两对照组相比，都是自身混合淋巴细胞反应(AMLR)，彼此之间并无显著差异。为了使实验数据更具有可比性，我们计算了细胞因子分泌增加量。即MLC与AMLR上清中细胞因子水平的差值(反应组-对照组)。结果发现，发生急性排斥反应的患者其细胞因子增加量超过了肾功能稳定组，差异达到显著或非常显著(P<0.05或P<0.01)。再次说明了急排组供受者间MLC-Ⅱ类抗原匹配程度不如肾功能稳定组供受者，即供受者遗传背景差异更大。
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就细胞因子的分泌动态而言，四种组别中，IL-2的分泌规律较为一致。均在第2天出现峰值，且排斥组各点值均高于相应的稳定组各点值。TNF-α的峰值出现在第1天，其后渐降，急性排斥组中第五天的TNF-α较第3天略有回升，但差别不大。本实验中患者术后出现急性排斥反应的时间平均在术后第12天。而细胞因子分泌的峰值、时序变化是MLC后第1、3、5天，即术后的第1、3、5天。比排斥反应出现的时间早近一周，满足了时序上预测评估排斥反应出现的要求。
淋巴细胞毒试验、HLA分型无显著差异的患者，肾移植术后预后不同。其中的原因错综复杂。术前多次输血、妊娠、二次移植等多种因素导致的机体免疫系统处于不同状态是不容忽视的重要因素。完全可以在移植术前，利用检测供受者细胞间特异性MLC上清液中的细胞因子水平的方法，对最适相容性相关和不相关的供受者做出筛选。凡淋巴细胞转化率高，上清液中细胞因子水平较高的个体可暂缓肾移植术。已手术的患者可列为“高危人群”，一旦术后表现出相应临床征兆，结合其它检查结果，优先考虑急性排斥的诊断。MLC上清液中细胞因子水平的变化，还启发人们利用抗细胞因子抗体逆转排斥反应的发生。这在许多动物实验模型中取得了成功。提供了又一治疗思路。
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综上所述，通过本实验我们认为：①检测MLC上清液中TNF-α和IL-2水平，可以作为肾移植术后预测急性排斥反应出现的一项指标：结合患者临床表现，配合其它检查方法，它在监测急性排斥反应方面有一定临床应用价值。②检测MLC中TNF-α和IL-2的水平，可以在肾移植术前作为筛选最佳供者、受者的辅助手段；是对常规组织配型实验的一种有益补充。③同时，它还启发提示人们利用抗细胞因子抗体治疗急性排斥反应。
参考文献
1，沈昌理.临床肾脏移植学.广州.广东科技出版社，1995.p16
2，何长民.器官移植免疫学.北京：人民军医出版社，1995.p36
3，Vilcek J，Lee TH.Tumor necrosis factor：new insights into the molecular mechanisms of its multiple actions.J Biol Chem，1991，266：7313
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4，Imatgawa DK.The role of tumor necrosis factor in allograft rejection.Ⅱ.Evidence that antibody therapy against tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin enhances cardiac allograft survival in rats.Transplantation，1990，50：189
5，宋 涛.肾移植术后监测血清、尿液和肾组织液中肿瘤坏死因子的临床意义.中华泌尿外科杂志，1997，18：716
6，Tanaka J.Cytokine gene expression after allogeneic bone marrow transplantation.Leuk Lymphoma，1995，16(5～6)：413
7，毕爱华.医学免疫学.北京：人民军医出版社，1994.261～262
8，Danzer SG，Kirchner H，Rink L.Cytokine interactions in human mixed lymphocyte culture.Transplantation，1994，57：1638
收稿1999-09-13
修回1999-12-27, http://www.100md.com