实验性兔动脉粥样硬化心肌组织bFGFmRNA表达变化
作者：吴汉明 王勇 李树岩 杨春荣
单位：吴汉明 王勇(大庆市红岗区医院，大庆 163511)；李树岩 杨春荣(白求恩医科大学第二临床学院)
关键词：动脉粥样硬化；心肌bFGFmRNA；RT-PCR
中国老年学杂志000224摘 要 目的 为探讨bFGFmRNA在动脉粥样硬化心肌组织中的变化规律和作用机制。方法 采用RT-PCR技术，检测bFGFmRNA在动脉粥样硬化心肌组织中的表达变化。结果 随着兔主动脉粥样硬化病变的逐渐加重，其心肌组织bFGFmRNA表达也逐渐增强。实验组8、10 w心肌组织bFGFmRNA表达明显高于对照组(P<0.01)。实验组12 w bFGFmRNA表达明显高于实验组8、10 w及对照组(P<0.01)。结论 bFGF在动脉粥样硬化的发生发展及其心肌细胞的反应性增生过程中可能起重要的介导作用。
, 百拇医药 Changes of bFGF mRNA expression in muscle tissue of the experimental atherosclerotic myocardium in rabbit models
Wu Hanming,Li Shuyan,Wang Yong et al
(Daqing Honggang Hospital,Daqing 163511)
Abstract：Objective To detect the changing rules and action mechanism of bFGF mRNA in atherosclerotic myocardium.Method The expression of bFGF mRNA was examined in atherosclerotic myocardium by RT-PCR.Result The expression of bFGF mRNA in myocardium increased gradually in pace with the aggravation of rabbit atherosclerotic aorta.The expressions of bFGF mRNA in myocardium at the 8th and 10th week were higher than the control group(P<0.01).The expression of bFGF mRNA at the 12th week was higher than that of thd 8th and 10th week and the control group(P<0.01).Conclusion bFGF may have important in ducing action in the development of atherosclerosis and the reactive proliferation process of myocardiac cells.
, 百拇医药
Key words Atherosclerosis Myocardium bFGFmRNA RT-PCR
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种能广泛地促进中胚层及神经外胚层细胞增殖的多肽生长因子，1974年由Gospodarowicz从牛脑垂体和脑组织中分离得到，因其能刺激成纤维细胞分裂增殖而得知。bFGF在体内具有广泛的生理功能。最近研究表明，bFGF与动脉粥样硬化、冠心病有密切关系，并越来越引起人们的关注〔1，2〕。本文采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，探讨bFGFmRNA在不同时期动脉粥样硬化心肌组织病变中的表达变化和作用，这在国内尚未见报导，为研究动脉粥样硬化、冠心病的发病机制及防治探索一条新的途径。
1 材料和方法
1.1 动物模型制备及分组 采用新西兰雄性大白兔20只，体重2～2.5 kg，由白求恩医科大学实验动物部提供。随机分为正常对照组(仅喂饲普通饲料)、实验组(喂饲含2%胆固醇、6%花生油的高脂饲料)，每组5只，分别喂养8、10、12 w，建立实验性兔动脉粥样硬化动物模型。
, http://www.100md.com
1.2 标本取材和保存 3%戊巴比妥钠30～50 g/kg耳缘静脉麻醉，迅速取出心脏和胸主动脉，冰上分离心肌组织200 mg置于EP管，液氮中保存，备RT-PCR测定。分离胸主动脉加入10%中性福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5 μm厚，HE染色，光镜下观察。
1.3 bFGFmRNA检测
1.3.1 组织总RNA提取 采用异硫氰酸胍一步法。RNA纯度260/280比值为1.89±0.08。
1.3.2 cDNA合成和RCR扩增2.5 μg总RNA在总体积20 μl中进行cDNA合成。
其中AMVbuffer(5×)4 μl，1 mmol/LdNTPs,25 nmol/L oligodt,AMV 5U及RNA酶抑制剂。逆转录，42 ℃水浴，1 h。PCR扩增总体积为25 μl，其中PCR buffer(10×)2.5 μl，1 mmol/L dNTPs，0.5 mmol/L MgCl2,cDNA合成产物2 μl，Taq DNA聚合酶2 U，以及bFGF(363bp)和参照引物γ-actim(287bp)的5及3引物。引物序列：3bFGF：5-AACGGCGGCTTCTTCCTGCG-3；5-bFG：5-TCAGCTCTTAGCAGA
, 百拇医药
CATTGG-3；3γ-actin：5-ATGGAAGAAGAAATCGCCGC
-3；5γ-actin：5-ACACGCAGCTCGTTGTAGAA-3。PCR反应条件：94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃ 105 s。扩增30个循环后，在72 ℃做5 min终止前延伸。
1.3.3 PCR产物分析PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪拍摄电泳条带，结果以激光密度扫描仪分析的bFGF/γ-actin密度比值表示。
1.4 统计学处理 实验数据以x±s表示，采用t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 兔主动脉粥样硬化形态学观察 HE染色可见，对照组血管壁组织结构无明显异常变化。实验组动脉粥样硬化家兔经高脂饮食8 w时，肉眼可见内膜呈不对称性增厚，内膜下有明显的脂质斑块沉积。镜下可见泡沫细胞积聚，平滑肌细胞增殖，细胞外基质增加，病变表面的内皮细胞可有脱落。12 w时主动脉管腔明显狭窄，脂质斑块弥漫分布，平滑肌细胞明显增生，泡沫细胞大量积聚(图1)。
, 百拇医药
图1 实验性兔动脉粥样硬化，第12周主动脉病 理改变，HE 40×
2.2 心肌组织bFGFmRNA检测结果 实验8、10 w组心肌组织bFGFmRNA转录水平明显高于对照组(P<0.01)。实验12 w组bFGFmRNA表达明显高于实验8、10 w及对照组(P<0.01)(表1)。
表1 实验性兔动脉粥样硬化心肌组织
bFGFmRNA表达变化
n
bFGFmRNA
对照组
5
89.75±8.34
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实验8 w组
5
96.67±14.851)
实验10 w组
5
97.22±13.341)
实验12 w组
5
104.18±12.252)
与对照组比较：1)P<0.01，与对照组及实验8、10 w组比较：2)P<0.01
3 讨 论
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动脉粥样硬化性疾病是一类以血管平滑肌细胞增殖为主要病理改变的疾病，但也常有细胞坏死和细胞转化，bFGF的心血管系统细胞的强效丝裂原对血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有很强的促丝裂作用。正常情况下，成年家兔的血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞均呈静止状态，当受到细胞外因素(如高血脂、缺血、缺氧等)刺激时，bFGF可被激活，直接或间接地使细胞进入G1期，此时细胞内DNA含量由于有丝分裂而成倍增加，细胞经过获能后进入S期。bFGF在体内分布极为广泛，脑、心、肝、肾上腺、骨、眼和胎盘等都有bFGF存在。在心血管系统中，血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有合成bFGF的能力。bFGF是一种多功能的细胞因子，在体内的生物学功能亦相当广泛，它可促进血管生成、诱导中胚层形成、促进肢体再生、参与创伤修复过程、影响内皮细胞功能、控制高血压和动脉粥样硬化、调节免疫系统功能等〔1，2〕。
从RT-PCR的观察结果发现，随着动脉粥样硬化的发生发展，在实验第8、10、12 w实验组心肌组织bFGFmRNA表达强度逐渐增高。提示bFGF通过基因表达的变化参与了冠心病、动脉粥样硬化的发生发展过程。国外部分学者也持相同观点。Hasdai等〔3〕发现冠心病患者血清bFGF水平升高。Guevas〔2〕报道急性心肌梗死患者血清bFGF在入院时并无明显升高，但发病10 d后显著升高(P<0.05)，30 d后回到基础水平。说明bFGF对冠状动脉侧支循环的形成以及心肌细胞的反应性增生可能起重要的介导作用。
, http://www.100md.com
虽然bFGF与冠心病、动脉粥样硬化的发病有一定联系，但bFGF也是体内最为有效的血管生长因子之一。已有资料表明，给实验性心肌梗死狗动物模型冠状动脉内或直接心肌注射bFGF，可改善心肌的收缩功能，缩小梗死面积，增加梗死区小动脉和毛细血管数量〔4〕，亦有急性扩张冠状动脉的作用〔5〕。有作者临床应用bFGF治疗冠心病患者，对于防止梗死扩展和促进梗死后心功能恢复有一定作用〔6〕。结合本实验结果，我们认为促进内源性bFGF的增加和给予外源性bFGF，对于防治冠心病、动脉粥样硬化具有重要意义。
作者简介：吴汉明，男，45岁，副主任医师
参考文献
1，Gospodarowicz D.Firoblast growth factor:Chemical structure and biologic function.Clin Orthop，1990；257(8)：231
, http://www.100md.com
2，Guevas P，Bamov V,Gimenez-Gallego G et al.Serum levels of basic fibroblast,growth factor in acute myocarction.Eur J Med Res，1997；2(7)：282-284
3，Hasdai D，Banak V，Leibovitz E et al.Serum basic fibroblast growth factor levels in patients with ischemic heart disease.Int J Cardiol，1997；59(2)：133-138
4，Yanagisawa-Miwa A，Uchida Y,Nakamura F et al.Salvage of infarcted myocardium by engage nicaction of basic fibroblas growth factor.Science，1992；257(5075)：401-403
5，Unger EF，Banai S,Shou M et al.Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model.Am J Physical，1994；266(4)：1588～1595
6，齐华阁，李兰更，刘建国 et al.碱性成纤维细胞生长因子对急性前壁心肌梗死的影响.中国危重病急救医学，1998；10(1)：29
收稿日期：1999-10-29
修回日期：1999-12-30, 百拇医药
单位：吴汉明 王勇(大庆市红岗区医院，大庆 163511)；李树岩 杨春荣(白求恩医科大学第二临床学院)
关键词：动脉粥样硬化；心肌bFGFmRNA；RT-PCR
中国老年学杂志000224摘 要 目的 为探讨bFGFmRNA在动脉粥样硬化心肌组织中的变化规律和作用机制。方法 采用RT-PCR技术，检测bFGFmRNA在动脉粥样硬化心肌组织中的表达变化。结果 随着兔主动脉粥样硬化病变的逐渐加重，其心肌组织bFGFmRNA表达也逐渐增强。实验组8、10 w心肌组织bFGFmRNA表达明显高于对照组(P<0.01)。实验组12 w bFGFmRNA表达明显高于实验组8、10 w及对照组(P<0.01)。结论 bFGF在动脉粥样硬化的发生发展及其心肌细胞的反应性增生过程中可能起重要的介导作用。
, 百拇医药 Changes of bFGF mRNA expression in muscle tissue of the experimental atherosclerotic myocardium in rabbit models
Wu Hanming,Li Shuyan,Wang Yong et al
(Daqing Honggang Hospital,Daqing 163511)
Abstract：Objective To detect the changing rules and action mechanism of bFGF mRNA in atherosclerotic myocardium.Method The expression of bFGF mRNA was examined in atherosclerotic myocardium by RT-PCR.Result The expression of bFGF mRNA in myocardium increased gradually in pace with the aggravation of rabbit atherosclerotic aorta.The expressions of bFGF mRNA in myocardium at the 8th and 10th week were higher than the control group(P<0.01).The expression of bFGF mRNA at the 12th week was higher than that of thd 8th and 10th week and the control group(P<0.01).Conclusion bFGF may have important in ducing action in the development of atherosclerosis and the reactive proliferation process of myocardiac cells.
, 百拇医药
Key words Atherosclerosis Myocardium bFGFmRNA RT-PCR
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种能广泛地促进中胚层及神经外胚层细胞增殖的多肽生长因子，1974年由Gospodarowicz从牛脑垂体和脑组织中分离得到，因其能刺激成纤维细胞分裂增殖而得知。bFGF在体内具有广泛的生理功能。最近研究表明，bFGF与动脉粥样硬化、冠心病有密切关系，并越来越引起人们的关注〔1，2〕。本文采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，探讨bFGFmRNA在不同时期动脉粥样硬化心肌组织病变中的表达变化和作用，这在国内尚未见报导，为研究动脉粥样硬化、冠心病的发病机制及防治探索一条新的途径。
1 材料和方法
1.1 动物模型制备及分组 采用新西兰雄性大白兔20只，体重2～2.5 kg，由白求恩医科大学实验动物部提供。随机分为正常对照组(仅喂饲普通饲料)、实验组(喂饲含2%胆固醇、6%花生油的高脂饲料)，每组5只，分别喂养8、10、12 w，建立实验性兔动脉粥样硬化动物模型。
, http://www.100md.com
1.2 标本取材和保存 3%戊巴比妥钠30～50 g/kg耳缘静脉麻醉，迅速取出心脏和胸主动脉，冰上分离心肌组织200 mg置于EP管，液氮中保存，备RT-PCR测定。分离胸主动脉加入10%中性福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5 μm厚，HE染色，光镜下观察。
1.3 bFGFmRNA检测
1.3.1 组织总RNA提取 采用异硫氰酸胍一步法。RNA纯度260/280比值为1.89±0.08。
1.3.2 cDNA合成和RCR扩增2.5 μg总RNA在总体积20 μl中进行cDNA合成。
其中AMVbuffer(5×)4 μl，1 mmol/LdNTPs,25 nmol/L oligodt,AMV 5U及RNA酶抑制剂。逆转录，42 ℃水浴，1 h。PCR扩增总体积为25 μl，其中PCR buffer(10×)2.5 μl，1 mmol/L dNTPs，0.5 mmol/L MgCl2,cDNA合成产物2 μl，Taq DNA聚合酶2 U，以及bFGF(363bp)和参照引物γ-actim(287bp)的5及3引物。引物序列：3bFGF：5-AACGGCGGCTTCTTCCTGCG-3；5-bFG：5-TCAGCTCTTAGCAGA
, 百拇医药
CATTGG-3；3γ-actin：5-ATGGAAGAAGAAATCGCCGC
-3；5γ-actin：5-ACACGCAGCTCGTTGTAGAA-3。PCR反应条件：94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃ 105 s。扩增30个循环后，在72 ℃做5 min终止前延伸。
1.3.3 PCR产物分析PCR扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪拍摄电泳条带，结果以激光密度扫描仪分析的bFGF/γ-actin密度比值表示。
1.4 统计学处理 实验数据以x±s表示，采用t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 兔主动脉粥样硬化形态学观察 HE染色可见，对照组血管壁组织结构无明显异常变化。实验组动脉粥样硬化家兔经高脂饮食8 w时，肉眼可见内膜呈不对称性增厚，内膜下有明显的脂质斑块沉积。镜下可见泡沫细胞积聚，平滑肌细胞增殖，细胞外基质增加，病变表面的内皮细胞可有脱落。12 w时主动脉管腔明显狭窄，脂质斑块弥漫分布，平滑肌细胞明显增生，泡沫细胞大量积聚(图1)。
, 百拇医药
图1 实验性兔动脉粥样硬化，第12周主动脉病 理改变，HE 40×
2.2 心肌组织bFGFmRNA检测结果 实验8、10 w组心肌组织bFGFmRNA转录水平明显高于对照组(P<0.01)。实验12 w组bFGFmRNA表达明显高于实验8、10 w及对照组(P<0.01)(表1)。
表1 实验性兔动脉粥样硬化心肌组织
bFGFmRNA表达变化
n
bFGFmRNA
对照组
5
89.75±8.34
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实验8 w组
5
96.67±14.851)
实验10 w组
5
97.22±13.341)
实验12 w组
5
104.18±12.252)
与对照组比较：1)P<0.01，与对照组及实验8、10 w组比较：2)P<0.01
3 讨 论
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动脉粥样硬化性疾病是一类以血管平滑肌细胞增殖为主要病理改变的疾病，但也常有细胞坏死和细胞转化，bFGF的心血管系统细胞的强效丝裂原对血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有很强的促丝裂作用。正常情况下，成年家兔的血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞均呈静止状态，当受到细胞外因素(如高血脂、缺血、缺氧等)刺激时，bFGF可被激活，直接或间接地使细胞进入G1期，此时细胞内DNA含量由于有丝分裂而成倍增加，细胞经过获能后进入S期。bFGF在体内分布极为广泛，脑、心、肝、肾上腺、骨、眼和胎盘等都有bFGF存在。在心血管系统中，血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞均有合成bFGF的能力。bFGF是一种多功能的细胞因子，在体内的生物学功能亦相当广泛，它可促进血管生成、诱导中胚层形成、促进肢体再生、参与创伤修复过程、影响内皮细胞功能、控制高血压和动脉粥样硬化、调节免疫系统功能等〔1，2〕。
从RT-PCR的观察结果发现，随着动脉粥样硬化的发生发展，在实验第8、10、12 w实验组心肌组织bFGFmRNA表达强度逐渐增高。提示bFGF通过基因表达的变化参与了冠心病、动脉粥样硬化的发生发展过程。国外部分学者也持相同观点。Hasdai等〔3〕发现冠心病患者血清bFGF水平升高。Guevas〔2〕报道急性心肌梗死患者血清bFGF在入院时并无明显升高，但发病10 d后显著升高(P<0.05)，30 d后回到基础水平。说明bFGF对冠状动脉侧支循环的形成以及心肌细胞的反应性增生可能起重要的介导作用。
, http://www.100md.com
虽然bFGF与冠心病、动脉粥样硬化的发病有一定联系，但bFGF也是体内最为有效的血管生长因子之一。已有资料表明，给实验性心肌梗死狗动物模型冠状动脉内或直接心肌注射bFGF，可改善心肌的收缩功能，缩小梗死面积，增加梗死区小动脉和毛细血管数量〔4〕，亦有急性扩张冠状动脉的作用〔5〕。有作者临床应用bFGF治疗冠心病患者，对于防止梗死扩展和促进梗死后心功能恢复有一定作用〔6〕。结合本实验结果，我们认为促进内源性bFGF的增加和给予外源性bFGF，对于防治冠心病、动脉粥样硬化具有重要意义。
作者简介：吴汉明，男，45岁，副主任医师
参考文献
1，Gospodarowicz D.Firoblast growth factor:Chemical structure and biologic function.Clin Orthop，1990；257(8)：231
, http://www.100md.com
2，Guevas P，Bamov V,Gimenez-Gallego G et al.Serum levels of basic fibroblast,growth factor in acute myocarction.Eur J Med Res，1997；2(7)：282-284
3，Hasdai D，Banak V，Leibovitz E et al.Serum basic fibroblast growth factor levels in patients with ischemic heart disease.Int J Cardiol，1997；59(2)：133-138
4，Yanagisawa-Miwa A，Uchida Y,Nakamura F et al.Salvage of infarcted myocardium by engage nicaction of basic fibroblas growth factor.Science，1992；257(5075)：401-403
5，Unger EF，Banai S,Shou M et al.Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model.Am J Physical，1994；266(4)：1588～1595
6，齐华阁，李兰更，刘建国 et al.碱性成纤维细胞生长因子对急性前壁心肌梗死的影响.中国危重病急救医学，1998；10(1)：29
收稿日期：1999-10-29
修回日期：1999-12-30, 百拇医药