老年学习记忆损害大鼠海马和新皮质小白蛋白神经元的丢失
作者：洪岸 李校坤 林剑 姚志彬 陈以慈
单位：洪岸 李校坤 林剑(暨南大学生物工程研究所)；姚志彬 陈以慈(中山医科大学解剖教研室，广州 510098)
关键词：老年学习记忆损害；小白蛋白；海马；新皮质；大鼠
中国老年学杂志000216摘 要 目的 探讨老年学习记忆损害与海马和新皮质GABA能神经元亚型——小白蛋白(PV)神经元的关系。方法 通过Morris水迷宫行为检测将相同年龄老年大鼠分为老年学习记忆正常和损害两组，采用免疫组化方法定量计数各脑区PV神经元数密度。结果 老年记忆损害鼠CA3区和齿状回PV神经元数密度较老年正常鼠明显减少；PV神经元数密度与大鼠在水迷宫中的行为密切相关。结论 CA3区和齿状回PV神经元丢失可能是老年记忆损害的原因之一，提示GABA能系统可能参与老年学习记忆损害。
, http://www.100md.com
Experimental study of intravenous basis fibroblast growth factor decreasing acute injury resulting from focal cerebral ischemia
Hong An Yao Zhibin Li Xiaokun et al
(Bioengineering Institute of JiNian University,GuangZhou 510632)
Abstract：Objective To study the protective effects of intravenous basic fibroblast growth factor(bFGF) with different concentratin against acute injury following 3 hours of focal cerebral ischemia and reperfusion.Methods The model of focal cerebral ischemia/reperfusion was established by intraluminally sutring the right middle cerebral artery of mature Sprague-Dawley rats.BFGF(5,50,250 μg/kg/h) was infused by femoral vein for 3h,beginning during reperfusion after 3 hours of focal inchemia.After 24h,the rats were sacrificed and the volume of cerebral infarcts was determined by TTC staining and image analysis.Results We found that the volume of cerebral infarcts(contral without NS,25.66±1.89%，with NS,23.23±2.64%；bFGF 5 μg/kg/h,14.69±2.43%；bFGF 50 μg/kg/h,10.98±3.10%，bFGF 250 μg/kg/h，13.57±3.43%，mean±SEM) was less in rats treated with bFGF,and the infart volume was less in rats treated with bFGF 50 μg/kg/h compared with bFGF 5 μg/kg/h.Conclusion There data indicated that intravenous adiminstration of bFGF could ameliorate significantly acute injury resulting from focal cerebral ischemia and reperfusion,and there was dose-dependent effect.bFGF may provid its beneficial effect by limiting progression of injury in ischemic broder regions.
, http://www.100md.com
Key words Cerebral ischemia/reperfusion bFGFP Infarct volume Rat1
除胆碱能系统外，老年学习记忆减退的神经化学研究已揭示了多 种神经递质的异常〔1〕，有证据表明抑制性GABA神经递质系统参与学习记忆的损害 ，药理学研究发现动物被动逃避反应的保持因训练后注入GABA受体拮抗剂而被增强，因注入 激动剂而被损害〔2〕，高剂量的GABA能损害啮齿类动物的空间学习能力〔3〕 ，更有趣的是，海马受损减少了GABA能药物对大鼠记忆的调节作用，因而提示海马在某种程 度上可能介导GABA能药物对记忆的效应〔4〕，还有研究表明含小白蛋白(PV)(一种钙 结合蛋白，定位于GABA能神经元的一个亚型)的神经元在AD受影响〔5〕。上述结果提 示GABA能系统在学习记忆过程中起着一定作用，本研究试图通过对老年学习记忆损害大鼠PV 阳性神经元的定量研究探讨老年学习记忆缺陷是否与GABA能系统功能障碍有关，以及与PV的 关系如何。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 动物准备 雌性SD大鼠，24月龄19只，3月龄5只， 其中老年鼠为12月龄淘汰孕鼠再饲养1年，青年鼠为2月龄购回，饲养4 w。
1.2 行为检测 水迷宫由一直径130 cm，高50 cm的圆 形水池和自动录相记录系统组成，池壁上4个等距离点分水池为4个象限，平台放置于任一 象限中央，没于水面下1 cm，水池周围参照物保持不变。从任一象限将大鼠面向池壁放入 水池，自动录像记录系统记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)和游泳路径，找到平台后休 息1 min，再按序由下一象限入水进行下一次试验，每只鼠每天8次试验，连续5 d。第5天第 4次结束后，撤除平台记录1 min大鼠的游泳轨迹，并计算大鼠在原平台象限游泳距离占总距 离百分比，以青年组平均逃避潜伏期95%和99%正常值范围上限值为标准，将逃避潜伏期大 于99%上限值的老年鼠视为学习记忆损害，逃避潜伏期小于95%上限值的老年鼠视为学习记忆 正常〔6〕。
, http://www.100md.com
1.3 免疫细胞化学 经4%多聚甲醛灌注后，取脑，置灌 注液中后固定，4 ℃过夜，冠状切片，厚度为1.0～1.5 mm，上行酒精脱水，透明，石蜡 包埋 ，取含背侧海马相同脑平面的包埋块连续切片，厚度7 μm，隔3张取1张，裱于明胶玻片上 ，置58 ℃烤箱1 h，切片入0.3% H2O2，37 ℃ 30 min冲洗，0.5%～2.0%正常山羊血 清孵育，抗PV单克隆抗体(1∶2 000，sigma) 4℃孵育过夜，冲洗，入二抗(1∶200，Vector )，室温2 h冲洗，ABC(1∶100 Vector)，室温2 h，冲洗，DAB显色，常规脱水，透明，封片 。
1.4 定量及统计学处理 在光学显微镜下对海马CA1 区、CA3区、齿状回、颞皮质和额皮质的PV阳性神经元进行计数，在镜中装一标尺，使三 组大鼠相同脑区都有相同长度的计数范围，每例大鼠计数连续切片6张，取均值，再通过测 算脑区面积后得到PV阳性神经元数密度(N/mm2)，采用t检验和线性回归对三组大鼠各 脑区PV阳性神经元密度及其与水迷宫中行为的关系进行统计学分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 行为筛选 在Morris水迷宫行为检测过程中，19只 相同年龄的老年鼠被区分为老年学习记忆损害鼠9只，老年学习记忆正常鼠10只，老年学习 记忆损害鼠平均逃避潜伏期较青年鼠和老年学习记忆正常鼠明显延长(P<0.05)，通过 5 d的训练其游泳轨迹仍是随机的(图1)，平台象限游泳距离百分比是28.7%，而青年鼠和老 年学习记忆正常鼠游泳轨迹主要集中在平台所在象限，平台象限游泳距离百分比分别是67. 7%和50.2%(P<0.01，P<0.05)。
2.2 定量及统计学分析 老年学习记忆损害鼠和老年学 习 记忆正常鼠海马结构CA1区、CA3区和齿状回PV阳性神经元数密度较青年鼠明显减少( P<0.01)，在CA3区和齿状回，老年学习记忆损害组的PV阳性神经元数密度较老年学 习 记忆正常组明显减少(P<0.05)，在颞皮质，老年损害组较青年组明显减少(P<0.05) (表1)，额皮质PV阳性神经元计数在三组间无显著差异。
, http://www.100md.com
线性回归分析结果显示除额皮质外，其它被检脑区PV阳性神经元数密度与大鼠在Morris水迷 宫中的平均逃避潜伏期、平台所在象限游泳距离百分比呈显著负相关和正相关关系，如齿状 回 (r=-0.64，P<0.01；r=0.72，P<0.01)，CA3区(r=-0.58， P<0.01；r=0.70，P<0.01)。
图1 大鼠在水迷宫中的游泳轨迹图(小 圆表示平台位置，大圆代表水池)
表1 大鼠不同脑区PV阳性神经元密度(N/mm2,
±s)
海马结构
颞皮质
, http://www.100md.com
CA1
CA3
齿状回
青年组
8.04±2.25
4.22±1.21
2.58±0.36
1.76±0.33
老年正常组
4.67±1.232)
2.69±1.012)
, 百拇医药
1.30 ±0.552)
1.40±0.45
老年损害组
3.26±1.312)
1.76±0.662)3)
0.72±0. 422)3)
1.10±0.251)
与青年鼠比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与老年正常鼠比较，3) P<0.05
3 讨 论
, 百拇医药 本结果显示大鼠老化过程中颞皮质和海马结构PV阳性神经元数密度明显减少，更有趣的是， 海马CA3区和齿状回PV阳性神经元数密度的减少与老年学习损害密切关联。因为我们观察 到相同年龄的老年大鼠，在上述两个脑区学习记忆受损的较学习记忆正常的大鼠PV阳性神经 元数密度明显减少。在老年大鼠额皮质没有观察到PV神经元的丢失，说明在老化过程中额皮 质 的PV神经元不受影响。本研究提示学习记忆相关脑区海马结构和颞皮质的PV神经元可能涉及 学习记忆过程，它的丢失可能是老年学习记忆损害的部分原因，CA3区和齿状回PV神经元 的丢失与老年学习记忆损害关系更为密切。
在大部分脑区PV存在于含GABA的非锥体细胞中，在新皮质和海马结构PV存在于中间神经元， 其轴突止于胞体、近端树突和轴突起始段〔7〕。本结果提示GABA能系统在老年学习 记忆损害过程中出现异常，但它如何参与老年学习记忆损害过程还不清楚，有电生理研究提 出不同的中间神经元类型参与两种不同受体介导的抑制作用：GABAA和GABAB受体，有人 假设终末止于胞体周围区的中间神经元负责GABAA受体介导的抑制，PV神经元可能属于此 类〔8〕，它所参与的GABAA受体介导的抑制作用受影响，可能与老年学习记忆损害 有关。
, 百拇医药
小白蛋白作为一种钙结合蛋白，在神经元内对钙起缓冲和调节作用，小白蛋白神经元数量的 减少，引起相关脑区总的小白蛋含量减少，可能将影响这些脑区钙的调节，如果钙的调节失 衡，将对脑的正常功能造成损害，这也可能是导致老年学习记忆损害的原因之一。 国家教委博士点基金资助项目
作者简介：洪岸，女，33岁，医学博士，副教授，硕士导师，从事老年痴呆基础研究
参考文献
1，Cottfries CG.Neurochemical aspects on aging and disease with cognitive impairment.J Neurosci Res，1990；27：541
2，Mc Gaugh JL.Involvement of hormonal and neuro modulatory systems in the regulation of memory storage.A Rev Neurosci，1989；12：255
, http://www.100md.com
3，Mazurkiewicz M.Effects of an in hibitor of GABA-aminotransferase on the spatial navigation deficit induced by m uscarinic blockade.Pharmac Biochem Bahav，1992；43：91
4，Ammassari Teule M.Amygdala and dorsal hippocampus lesions block the effects of GABA ergic drugs on memory storge.Brain Res，1991；551：104
5，Arai H，Emson PC,Mountjoy CQ et al.Loss of parvalbumin immunoreactive neurons from cortex in Alzheimer-type dementia.Brain Res，1987；418：164
, http://www.100md.com
6，Gage FH，Bjoklund A,Stenevi V et al.Intra hippocampal septal graftsameliorate learning impairments in aged rats.Science，1984；225：533
7，De Felipe J，Hendry SHC and Jones EG.Visualization of chandelier cell axons by parvalbumin immunoreactivity in monkey cerebral cortex.Pro natl Acad Sci USA，1989；86：2093
8，Miettinen R，Sirvio J,Riekkinen-Sr P et al.Neocortical,Hippocampal and septal parvalbumin and somatostatin containing neurons in young and aged rats:correlation with passive avoidance and water maze performance.Neurosci，1993；52(2)：367
收稿日期：1999-04-01
修回日期：1999-09-01, 百拇医药
单位：洪岸 李校坤 林剑(暨南大学生物工程研究所)；姚志彬 陈以慈(中山医科大学解剖教研室，广州 510098)
关键词：老年学习记忆损害；小白蛋白；海马；新皮质；大鼠
中国老年学杂志000216摘 要 目的 探讨老年学习记忆损害与海马和新皮质GABA能神经元亚型——小白蛋白(PV)神经元的关系。方法 通过Morris水迷宫行为检测将相同年龄老年大鼠分为老年学习记忆正常和损害两组，采用免疫组化方法定量计数各脑区PV神经元数密度。结果 老年记忆损害鼠CA3区和齿状回PV神经元数密度较老年正常鼠明显减少；PV神经元数密度与大鼠在水迷宫中的行为密切相关。结论 CA3区和齿状回PV神经元丢失可能是老年记忆损害的原因之一，提示GABA能系统可能参与老年学习记忆损害。
, http://www.100md.com
Experimental study of intravenous basis fibroblast growth factor decreasing acute injury resulting from focal cerebral ischemia
Hong An Yao Zhibin Li Xiaokun et al
(Bioengineering Institute of JiNian University,GuangZhou 510632)
Abstract：Objective To study the protective effects of intravenous basic fibroblast growth factor(bFGF) with different concentratin against acute injury following 3 hours of focal cerebral ischemia and reperfusion.Methods The model of focal cerebral ischemia/reperfusion was established by intraluminally sutring the right middle cerebral artery of mature Sprague-Dawley rats.BFGF(5,50,250 μg/kg/h) was infused by femoral vein for 3h,beginning during reperfusion after 3 hours of focal inchemia.After 24h,the rats were sacrificed and the volume of cerebral infarcts was determined by TTC staining and image analysis.Results We found that the volume of cerebral infarcts(contral without NS,25.66±1.89%，with NS,23.23±2.64%；bFGF 5 μg/kg/h,14.69±2.43%；bFGF 50 μg/kg/h,10.98±3.10%，bFGF 250 μg/kg/h，13.57±3.43%，mean±SEM) was less in rats treated with bFGF,and the infart volume was less in rats treated with bFGF 50 μg/kg/h compared with bFGF 5 μg/kg/h.Conclusion There data indicated that intravenous adiminstration of bFGF could ameliorate significantly acute injury resulting from focal cerebral ischemia and reperfusion,and there was dose-dependent effect.bFGF may provid its beneficial effect by limiting progression of injury in ischemic broder regions.
, http://www.100md.com
Key words Cerebral ischemia/reperfusion bFGFP Infarct volume Rat1
除胆碱能系统外，老年学习记忆减退的神经化学研究已揭示了多 种神经递质的异常〔1〕，有证据表明抑制性GABA神经递质系统参与学习记忆的损害 ，药理学研究发现动物被动逃避反应的保持因训练后注入GABA受体拮抗剂而被增强，因注入 激动剂而被损害〔2〕，高剂量的GABA能损害啮齿类动物的空间学习能力〔3〕 ，更有趣的是，海马受损减少了GABA能药物对大鼠记忆的调节作用，因而提示海马在某种程 度上可能介导GABA能药物对记忆的效应〔4〕，还有研究表明含小白蛋白(PV)(一种钙 结合蛋白，定位于GABA能神经元的一个亚型)的神经元在AD受影响〔5〕。上述结果提 示GABA能系统在学习记忆过程中起着一定作用，本研究试图通过对老年学习记忆损害大鼠PV 阳性神经元的定量研究探讨老年学习记忆缺陷是否与GABA能系统功能障碍有关，以及与PV的 关系如何。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 动物准备 雌性SD大鼠，24月龄19只，3月龄5只， 其中老年鼠为12月龄淘汰孕鼠再饲养1年，青年鼠为2月龄购回，饲养4 w。
1.2 行为检测 水迷宫由一直径130 cm，高50 cm的圆 形水池和自动录相记录系统组成，池壁上4个等距离点分水池为4个象限，平台放置于任一 象限中央，没于水面下1 cm，水池周围参照物保持不变。从任一象限将大鼠面向池壁放入 水池，自动录像记录系统记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)和游泳路径，找到平台后休 息1 min，再按序由下一象限入水进行下一次试验，每只鼠每天8次试验，连续5 d。第5天第 4次结束后，撤除平台记录1 min大鼠的游泳轨迹，并计算大鼠在原平台象限游泳距离占总距 离百分比，以青年组平均逃避潜伏期95%和99%正常值范围上限值为标准，将逃避潜伏期大 于99%上限值的老年鼠视为学习记忆损害，逃避潜伏期小于95%上限值的老年鼠视为学习记忆 正常〔6〕。
, http://www.100md.com
1.3 免疫细胞化学 经4%多聚甲醛灌注后，取脑，置灌 注液中后固定，4 ℃过夜，冠状切片，厚度为1.0～1.5 mm，上行酒精脱水，透明，石蜡 包埋 ，取含背侧海马相同脑平面的包埋块连续切片，厚度7 μm，隔3张取1张，裱于明胶玻片上 ，置58 ℃烤箱1 h，切片入0.3% H2O2，37 ℃ 30 min冲洗，0.5%～2.0%正常山羊血 清孵育，抗PV单克隆抗体(1∶2 000，sigma) 4℃孵育过夜，冲洗，入二抗(1∶200，Vector )，室温2 h冲洗，ABC(1∶100 Vector)，室温2 h，冲洗，DAB显色，常规脱水，透明，封片 。
1.4 定量及统计学处理 在光学显微镜下对海马CA1 区、CA3区、齿状回、颞皮质和额皮质的PV阳性神经元进行计数，在镜中装一标尺，使三 组大鼠相同脑区都有相同长度的计数范围，每例大鼠计数连续切片6张，取均值，再通过测 算脑区面积后得到PV阳性神经元数密度(N/mm2)，采用t检验和线性回归对三组大鼠各 脑区PV阳性神经元密度及其与水迷宫中行为的关系进行统计学分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 行为筛选 在Morris水迷宫行为检测过程中，19只 相同年龄的老年鼠被区分为老年学习记忆损害鼠9只，老年学习记忆正常鼠10只，老年学习 记忆损害鼠平均逃避潜伏期较青年鼠和老年学习记忆正常鼠明显延长(P<0.05)，通过 5 d的训练其游泳轨迹仍是随机的(图1)，平台象限游泳距离百分比是28.7%，而青年鼠和老 年学习记忆正常鼠游泳轨迹主要集中在平台所在象限，平台象限游泳距离百分比分别是67. 7%和50.2%(P<0.01，P<0.05)。
2.2 定量及统计学分析 老年学习记忆损害鼠和老年学 习 记忆正常鼠海马结构CA1区、CA3区和齿状回PV阳性神经元数密度较青年鼠明显减少( P<0.01)，在CA3区和齿状回，老年学习记忆损害组的PV阳性神经元数密度较老年学 习 记忆正常组明显减少(P<0.05)，在颞皮质，老年损害组较青年组明显减少(P<0.05) (表1)，额皮质PV阳性神经元计数在三组间无显著差异。
, http://www.100md.com
线性回归分析结果显示除额皮质外，其它被检脑区PV阳性神经元数密度与大鼠在Morris水迷 宫中的平均逃避潜伏期、平台所在象限游泳距离百分比呈显著负相关和正相关关系，如齿状 回 (r=-0.64，P<0.01；r=0.72，P<0.01)，CA3区(r=-0.58， P<0.01；r=0.70，P<0.01)。
图1 大鼠在水迷宫中的游泳轨迹图(小 圆表示平台位置，大圆代表水池)
表1 大鼠不同脑区PV阳性神经元密度(N/mm2,
±s)海马结构
颞皮质
, http://www.100md.com
CA1
CA3
齿状回
青年组
8.04±2.25
4.22±1.21
2.58±0.36
1.76±0.33
老年正常组
4.67±1.232)
2.69±1.012)
, 百拇医药
1.30 ±0.552)
1.40±0.45
老年损害组
3.26±1.312)
1.76±0.662)3)
0.72±0. 422)3)
1.10±0.251)
与青年鼠比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与老年正常鼠比较，3) P<0.05
3 讨 论
, 百拇医药 本结果显示大鼠老化过程中颞皮质和海马结构PV阳性神经元数密度明显减少，更有趣的是， 海马CA3区和齿状回PV阳性神经元数密度的减少与老年学习损害密切关联。因为我们观察 到相同年龄的老年大鼠，在上述两个脑区学习记忆受损的较学习记忆正常的大鼠PV阳性神经 元数密度明显减少。在老年大鼠额皮质没有观察到PV神经元的丢失，说明在老化过程中额皮 质 的PV神经元不受影响。本研究提示学习记忆相关脑区海马结构和颞皮质的PV神经元可能涉及 学习记忆过程，它的丢失可能是老年学习记忆损害的部分原因，CA3区和齿状回PV神经元 的丢失与老年学习记忆损害关系更为密切。
在大部分脑区PV存在于含GABA的非锥体细胞中，在新皮质和海马结构PV存在于中间神经元， 其轴突止于胞体、近端树突和轴突起始段〔7〕。本结果提示GABA能系统在老年学习 记忆损害过程中出现异常，但它如何参与老年学习记忆损害过程还不清楚，有电生理研究提 出不同的中间神经元类型参与两种不同受体介导的抑制作用：GABAA和GABAB受体，有人 假设终末止于胞体周围区的中间神经元负责GABAA受体介导的抑制，PV神经元可能属于此 类〔8〕，它所参与的GABAA受体介导的抑制作用受影响，可能与老年学习记忆损害 有关。
, 百拇医药
小白蛋白作为一种钙结合蛋白，在神经元内对钙起缓冲和调节作用，小白蛋白神经元数量的 减少，引起相关脑区总的小白蛋含量减少，可能将影响这些脑区钙的调节，如果钙的调节失 衡，将对脑的正常功能造成损害，这也可能是导致老年学习记忆损害的原因之一。 国家教委博士点基金资助项目
作者简介：洪岸，女，33岁，医学博士，副教授，硕士导师，从事老年痴呆基础研究
参考文献
1，Cottfries CG.Neurochemical aspects on aging and disease with cognitive impairment.J Neurosci Res，1990；27：541
2，Mc Gaugh JL.Involvement of hormonal and neuro modulatory systems in the regulation of memory storage.A Rev Neurosci，1989；12：255
, http://www.100md.com
3，Mazurkiewicz M.Effects of an in hibitor of GABA-aminotransferase on the spatial navigation deficit induced by m uscarinic blockade.Pharmac Biochem Bahav，1992；43：91
4，Ammassari Teule M.Amygdala and dorsal hippocampus lesions block the effects of GABA ergic drugs on memory storge.Brain Res，1991；551：104
5，Arai H，Emson PC,Mountjoy CQ et al.Loss of parvalbumin immunoreactive neurons from cortex in Alzheimer-type dementia.Brain Res，1987；418：164
, http://www.100md.com
6，Gage FH，Bjoklund A,Stenevi V et al.Intra hippocampal septal graftsameliorate learning impairments in aged rats.Science，1984；225：533
7，De Felipe J，Hendry SHC and Jones EG.Visualization of chandelier cell axons by parvalbumin immunoreactivity in monkey cerebral cortex.Pro natl Acad Sci USA，1989；86：2093
8，Miettinen R，Sirvio J,Riekkinen-Sr P et al.Neocortical,Hippocampal and septal parvalbumin and somatostatin containing neurons in young and aged rats:correlation with passive avoidance and water maze performance.Neurosci，1993；52(2)：367
收稿日期：1999-04-01
修回日期：1999-09-01, 百拇医药