抗人直肠癌单克隆抗体的制备及应用研究
作者：杨卓平 周少雄
单位：524037 广东省湛江中心人民医院
关键词：抗体，单克隆；直肠肿瘤
实用医学杂志000207摘要 目的：制备鼠抗人直肠癌单克隆抗体。方法：以手术取得的新鲜直肠癌组织免疫Balb/c小鼠，用淋巴细胞杂交瘤技术获得能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。结果：制得了1株能稳定分泌高特异和高效价单抗的杂交瘤细胞系，其单抗相应抗原在直肠癌组织高度表达(>90%)，主要分布于细胞膜，胞浆少量分布，并可脱落至腺腔。结论：此单抗的成功研制为直肠癌早期诊断和进一步制备抗直肠癌独特型抗体提供了可能性。
本研究采用淋巴细胞杂交瘤技术制得了1株特异性强、效价高的抗直肠癌单抗，并观察其相应抗原在癌组织中的表达，为早诊早治提供可能，结果报道如下。
, http://www.100md.com 1 材料与方法
1.1 标本 新鲜直肠癌组织取自本院外科手术，经组织病理鉴定后用于制备免疫原，将同一标本部分冻存于液氮以备抗体筛选和抗原定位研究。
1.2 单抗制备 采用Kohler等[1]方法改进，首次免疫用新鲜直肠癌组织加福氏完全佐剂(乳剂)0.5 ml经腹部皮下注射雌性Balb/c小鼠，此后改用福氏不完全佐剂乳化抗原，隔周免疫注射1次共3次；3个月后加强免疫1次，3 d后取脾和自眼部取血并分离血清备用。将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1(10∶1)融合，筛选阳性克隆，阳性孔用有限稀释法进一步克隆化；将5×106个杂交瘤细胞接种于预先注射降植烷的雌性Balb/c小鼠腹腔，1周后取腹水测抗体效价，纯化后分装并冻存。
1.3 杂交瘤细胞鉴定 包括常规核型分析染色体和流式细胞术测定DNA含量[2]。
, 百拇医药
1.4 单抗特征分析 用单抗亚型鉴定试剂盒检测亚型，用间接免疫荧光法检测单抗效价。
1.5 单抗相应抗原的免疫组化定位 采用SP免疫组化试剂(Zymed 产品)对直肠癌、结肠癌、胃癌等癌组织及其癌旁组织、正常粘膜组织石蜡切片进行染色，阳性强度以积分数表示，根据细胞膜、浆或腺腔内粘液着色程度分别为：1分=浅棕色，2分=棕色，3分=深棕色。
1.6 CEA阻断试验 提纯的单抗在室温下与CEA抗原孵育3 h，再行免疫组化染色，观察CEA预反应对染色程度的影响。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 融合细胞接种于96孔板，融合率约80%，阳性率5%，其中C4孔克隆生长好且特异性强，有限稀释后阳性率达100%。C4株杂交瘤细胞经180 d连续培养，其单抗分泌持续、稳定，冻存细胞复苏后仍保持抗体分泌能力。核型分析显示C4株细胞染色体数为85～117条，每个细胞均有端着丝粒及中着丝粒染色体。流式细胞仪测定表明C4细胞DNA含量高于NS-1细胞。该杂交瘤细胞分泌的单抗命名为MC4。
, http://www.100md.com
2.2 单抗MC4的特征 亚类鉴定MC4为IgG1，抗体效价培养上清1∶160，腹水1∶107，MC4与CEA预反应不影响MC4与相应抗原反应。
2.3 单抗MC4的相应抗原定位 见表1。
表1 MC4相应抗原在不同组织中的表达
表1表明，MC4相应抗原在直肠癌组织中的表达阳性率显著高于癌旁组织、正常粘膜组织及其它癌组织(χ2检验，P<0.05)。MC4相应抗原在直肠癌组织中的表达量(平均阳性分数)也较癌旁、正常及其它癌组织为高(F检验，P<0.01)。观察组织切片的染色特点，直肠癌组织中除癌细胞膜、浆可呈阳性反应外，腺腔内粘液亦可见不同程度着色。
3 讨论
我们获得了1株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞，所分泌的单抗MC4属IgG1亚类。抗体效价高(上清1∶160，腹水1∶107)，选择性强，其相应抗原在直肠癌组织中的表达显著高于癌旁、正常及其它癌组织，这种高选择性源于制备单抗的免疫原是新鲜癌组织，抗原性保持良好，与体内肿瘤比较接近。该单抗MC4的相应抗原在直肠癌组织高表达，而在正常组织和其它肿瘤组织中低表达或不表达，提示其可用于制备抗直肠癌独特型抗体，也可用于直肠癌的诊断及治疗。由于MC4相应抗原可脱落于腺腔进入血液循环，表明可通过建立测定该抗原的血清学方法，辅助直肠癌的诊断。MC4与标准CEA抗原无反应性，表明MC4相应抗原是一种尚未确定的直肠癌标志物，进一步鉴定后可望用于直肠癌早诊及作为疗效、预后的判断指标。
参考文献
1，Kohler G,Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature,1975，256：495～411.
2，田爱琴，马湘玲，赵培荣，等. 马氏钳蝎毒对人食道癌细胞株细胞周期的影响. 河南医科大学学报，1997，32：18～20., 百拇医药
单位：524037 广东省湛江中心人民医院
关键词：抗体，单克隆；直肠肿瘤
实用医学杂志000207摘要 目的：制备鼠抗人直肠癌单克隆抗体。方法：以手术取得的新鲜直肠癌组织免疫Balb/c小鼠，用淋巴细胞杂交瘤技术获得能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。结果：制得了1株能稳定分泌高特异和高效价单抗的杂交瘤细胞系，其单抗相应抗原在直肠癌组织高度表达(>90%)，主要分布于细胞膜，胞浆少量分布，并可脱落至腺腔。结论：此单抗的成功研制为直肠癌早期诊断和进一步制备抗直肠癌独特型抗体提供了可能性。
本研究采用淋巴细胞杂交瘤技术制得了1株特异性强、效价高的抗直肠癌单抗，并观察其相应抗原在癌组织中的表达，为早诊早治提供可能，结果报道如下。
, http://www.100md.com 1 材料与方法
1.1 标本 新鲜直肠癌组织取自本院外科手术，经组织病理鉴定后用于制备免疫原，将同一标本部分冻存于液氮以备抗体筛选和抗原定位研究。
1.2 单抗制备 采用Kohler等[1]方法改进，首次免疫用新鲜直肠癌组织加福氏完全佐剂(乳剂)0.5 ml经腹部皮下注射雌性Balb/c小鼠，此后改用福氏不完全佐剂乳化抗原，隔周免疫注射1次共3次；3个月后加强免疫1次，3 d后取脾和自眼部取血并分离血清备用。将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1(10∶1)融合，筛选阳性克隆，阳性孔用有限稀释法进一步克隆化；将5×106个杂交瘤细胞接种于预先注射降植烷的雌性Balb/c小鼠腹腔，1周后取腹水测抗体效价，纯化后分装并冻存。
1.3 杂交瘤细胞鉴定 包括常规核型分析染色体和流式细胞术测定DNA含量[2]。
, 百拇医药
1.4 单抗特征分析 用单抗亚型鉴定试剂盒检测亚型，用间接免疫荧光法检测单抗效价。
1.5 单抗相应抗原的免疫组化定位 采用SP免疫组化试剂(Zymed 产品)对直肠癌、结肠癌、胃癌等癌组织及其癌旁组织、正常粘膜组织石蜡切片进行染色，阳性强度以积分数表示，根据细胞膜、浆或腺腔内粘液着色程度分别为：1分=浅棕色，2分=棕色，3分=深棕色。
1.6 CEA阻断试验 提纯的单抗在室温下与CEA抗原孵育3 h，再行免疫组化染色，观察CEA预反应对染色程度的影响。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 融合细胞接种于96孔板，融合率约80%，阳性率5%，其中C4孔克隆生长好且特异性强，有限稀释后阳性率达100%。C4株杂交瘤细胞经180 d连续培养，其单抗分泌持续、稳定，冻存细胞复苏后仍保持抗体分泌能力。核型分析显示C4株细胞染色体数为85～117条，每个细胞均有端着丝粒及中着丝粒染色体。流式细胞仪测定表明C4细胞DNA含量高于NS-1细胞。该杂交瘤细胞分泌的单抗命名为MC4。
, http://www.100md.com
2.2 单抗MC4的特征 亚类鉴定MC4为IgG1，抗体效价培养上清1∶160，腹水1∶107，MC4与CEA预反应不影响MC4与相应抗原反应。
2.3 单抗MC4的相应抗原定位 见表1。
表1 MC4相应抗原在不同组织中的表达
表1表明，MC4相应抗原在直肠癌组织中的表达阳性率显著高于癌旁组织、正常粘膜组织及其它癌组织(χ2检验，P<0.05)。MC4相应抗原在直肠癌组织中的表达量(平均阳性分数)也较癌旁、正常及其它癌组织为高(F检验，P<0.01)。观察组织切片的染色特点，直肠癌组织中除癌细胞膜、浆可呈阳性反应外，腺腔内粘液亦可见不同程度着色。
3 讨论
我们获得了1株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞，所分泌的单抗MC4属IgG1亚类。抗体效价高(上清1∶160，腹水1∶107)，选择性强，其相应抗原在直肠癌组织中的表达显著高于癌旁、正常及其它癌组织，这种高选择性源于制备单抗的免疫原是新鲜癌组织，抗原性保持良好，与体内肿瘤比较接近。该单抗MC4的相应抗原在直肠癌组织高表达，而在正常组织和其它肿瘤组织中低表达或不表达，提示其可用于制备抗直肠癌独特型抗体，也可用于直肠癌的诊断及治疗。由于MC4相应抗原可脱落于腺腔进入血液循环，表明可通过建立测定该抗原的血清学方法，辅助直肠癌的诊断。MC4与标准CEA抗原无反应性，表明MC4相应抗原是一种尚未确定的直肠癌标志物，进一步鉴定后可望用于直肠癌早诊及作为疗效、预后的判断指标。
参考文献
1，Kohler G,Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature,1975，256：495～411.
2，田爱琴，马湘玲，赵培荣，等. 马氏钳蝎毒对人食道癌细胞株细胞周期的影响. 河南医科大学学报，1997，32：18～20., 百拇医药