高效液相色谱法快速直接测定血清苯丙氨酸和酪氨酸
作者：唐爱国
单位：唐爱国(第二附属医院检验科 长沙 410011)
关键词：氨基酸；血清；色谱法；高效液相；苯丙酮尿症
湖南医科大学学报000242 [摘要] 目的：建立快速、直接、同时测定血清苯丙氨酸和 酪氨酸的方法。方法：血清标本加高氯酸去蛋白后取上清，采用固定流量洗脱高效液相色谱 紫外检测法测定。结果：苯丙氨酸的线性范围为6～1512μmol.L-1，最低检测 浓度为0.75μmol.L-1；平均回收率为98.6%，批内CV为3.68%，批间CV为4.01 %。酪氨酸的线性范围为5.4～1380μmol.L-1，最低检测浓度为0.7.μmol.L-1，平均回收率98.9%，批内CV为1.87%，批间CV为2.59%。健康儿童血清苯丙氨 酸浓度为(61.4±10.8)μmol.L-1，血清酪氨酸浓度为(131.8±28.0)μmol.L -1。健康成人血清苯丙氨酸浓度为(69.3±8.6)μmol.L-1，血清酪氨 酸浓度 为(83.6±9.4)μmol.L-1。4例苯丙酮尿症患儿的血清苯丙氨酸浓度为1296～1759μmol.L-1，血清酪氨酸为29.5～53.5μmol.L-1。结论：本方 法灵敏度高，特异性好，方法简便快速，适合临床使用。
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[中图分类号] R446.112 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0209-04
Rapid high performance liquid chromatography for determination of phenylalanine and tyrosine in serum
Tang Ai-guo
Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University(Changsha 410011)
[Abstract] Objective: To develop a rapid assay for the determi n ation of phenylalanine and tyrosine in serum. Methods: The serum sample was inje cted directly into High performance liquid chromatography(HPLC) system after pre cipitation of protein with perchloric acid, and monitored at 190nm with an ult raviolet detector. Results: Good linearity was observed in 6～1512μmol.L-1 range for phenylalanine, the intra-run and inter-run imprecisions(CV) w ere 3.68% and 4.01%, the recovery rate was 98.6%; good linearity was observed in 5.4 ～1380.0μmol.L-1 range for tyrosine, the intra-run and inter-run i mp recisions were 1.87% and 2.59%, the average recovery rate was 98.9%. Conclusion: This method is simple, rapid, sensitive, accurate, and suitable for clinical applica tion.
, 百拇医药
[Key words] amino acids; serum; chromatography,high perform ance liquid; phenylketonuria
在苯丙酮尿症(Phenylketonuria, PKU)等遗传代谢性疾病 的诊断、治疗和监测中血清(浆)苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)和酪氨酸(tyrosine, Tyr) 测定具有重要的临床意义。目前，国内主要采用荧光光度法[1]和高效液相色谱法 [2，3]测定。本文作者参照国外文献[4]，结合本室条件进行测定，以 期建立一种简便、快速的高效液相色谱法同时测定血清Phe和Tyr浓度。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 美国Waters公司PC800型高效液相色谱仪，包括M486紫外检测器，M5 10泵、M7125 Rheodyne进样阀及PC800色谱工作站；美国Millipore公司Milli-Q纯水器及江 苏太仓医疗器械厂TGLL-18台式高速离心机。
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1.1.2 试剂及其配制 L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸均为美国Sig ma公司产品；乙腈、甲醇均为浙江临海化工厂产品(色谱纯)；其他化学试剂均为国产分析纯 ，使用Milli-Q纯水器处理过的超纯水配制，其中包括：①0.59mol.L-1高氯酸 溶液。②0.6mol.L-1三氯乙酸(TCA)溶液。③0.4mol.L-1磺基水杨酸溶液。 ④称取L-Phe 10.0mg，用0.59mol.L-1高氯酸溶液溶解并 稀释至10.0ml，制成6100μmol.L-1 Phe标准贮存液，分成小份加塞置-30℃ 冰箱保存。⑤称取L-Tyr 10.0mg，用0.59mo l.L-1高氯酸溶液溶解并稀释至10.0ml，制成5500μmol.L-1的Tyr标 准贮存液，分成小份加盖置-30℃冰箱保存。⑥取上述两种标准贮存液各1.0ml，加0.59 mol.L-1高氯酸溶液至100ml，制成标准应用液(含Phe 61μmol.L-1， Tyr 55μmol.L-1)，放4℃冰箱至少可存放2个月。⑦取乙腈40ml，加水至1000 ml，用0.45μ微孔滤膜过滤，制成4%乙腈(流动相)。使用前用超声波清洗器脱气处理1 5min。
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1.2 方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱为美国Waters公司NOVA-PAKC18不锈钢柱(3.9mm×150 mm)；流动相为4%乙腈溶液，流速为1ml.min-1；检测波长UV 190nm；进 样量为20μl。
1.2.2 血清样品的处理 吸取血清0.1ml于塑料小离心管内，加入等量 0.59mol.L-1高氯酸溶液，加盖后于旋涡混合器上混合30s，室温放置15min ，离心，12000r.min-1，5min，取上清液进样检测。
1.2.3 Phe和Tyr峰的定性和定量 Phe和Tyr峰采用峰保留值比较法和叠加 法定性分析；用外标法测峰面积进行定量分析，结果均由PC800色谱工作站计算并打印。
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1.3 统计学处理 检测结果用均数±标准差(
±s)表示；两组 间比较用t检验。
2 结 果
2.1 检测波长的选择 取Phe和Tyr混合标准应用液分别在190，195，200， 205，210，215，220，254nm处检测，结果显示，UV 190nm处可使Phe和Tyr均获得最灵 敏的响应。
2.2 流动相中乙腈含量的选择 配制不同乙腈含量(0%，2%，3%，4%，6%， 10%，15%)的流动相，再分别注入混合标准应用液测定，发现随着乙腈含量增加，Phe和Tyr 峰的保留时间相应地缩短，当乙腈含量为15%时，Tyr峰与高氯酸峰分离欠佳，而血清样品中 的Tyr和Phe峰均不能基线分离。作者选用4%乙腈作流动相，可使标准品和血清样品中Tyr和P he峰均可在5min内良好分离。此外如选用4%甲醇作为流动相，亦可使Thr和Phe峰良好分离 ，但保留时间均相应延长数分钟。
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2.3 流动相pH值改变对保留时间的影响 以pH值为6.5和4.5的4%乙腈作 流动相，分别注入混合标准应用液进行检测，发现在这两种pH值的流动相中，Tyr和Phe峰的 保留时间无明显变化，作者采用pH6.5的4%乙腈为流动相，省略调节pH的步骤。
2.4 标准品和血清样品中Tyr和Phe色谱分离结果 图1，图2示色谱峰分离 良好，Tyr峰前为其他物质峰，对测定无干扰。
图1 标准品色谱图
Fig.1 Standard chromatogram 2.14m in: Tyr; 3.58min: Phe
图2 血清标本色谱图
, 百拇医药
Fig.2 Serum sample chromatogram 2.13m in: Tyr; 3.58min: Phe
2.5 标准曲线 Phe标准溶液在6～1512μmol.L-1范围内，以 浓度(C)对其相对的峰面积(A)作回归分析，回归方程为：A=64452+3793C,r=0.9995。Ty r标准溶液在5.4～1380μmol.L-1范围内，回归方程为：A=143706+4110C,r =0.9966。均示线性良好。当信噪比为3时，血清Phe和Tyr的最低检测浓度分别为0.75 μmol.L-1和0.7μmol.L-1。
2.6 精密度检测 取健康人血清数份，混合作批内、批间变异测定。结果 见表1。
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表1 精密度测定(±s；μmol .L-1)
n
Phe
CV(%)
Tyr
CV(% )
批内
20
70.5±2.6
3.68
, 百拇医药 85.2±1.6
1.87
批间
30
69.8±2.8
4.01
84.8±2.2
2.59
2.7 回收率测定 向Phe浓度为66.8μmol.L-1和Tyr浓度为86 .6μmol.L-1的血清标本中加入122μmol.L-1的Phe标准液和110μmo l.L-1的Tyr标准液，测得Phe的回收率为(98.6±2.4)%，Tyr的回收率为(98.9±2 .1)%。
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2.8 干扰试验 向血清样品和标准品中加入含量为48.9μmol.L-1 和489μmol.L-1的L-色氨酸标准液(用0.1mol.L-1 HCl配制)后进样 测定，未见明显的色氨酸峰，也未见其对Phe和Tyr的干扰。另取263.2μmol.L-1 肌酐标准液进样测定，也未见明显的肌酐峰及对Phe和Tyr的干扰。
2.9 蛋白沉淀剂的选择 分别取0.59mol.L-1高氯酸溶液，0.6 mol.L-1 TCA溶液和0.4mol.L-1磺基水杨酸溶液作为蛋白沉淀剂，与等 体积的血清标本混合后，室温放置15min，离心取上清液进样测定。发现在本文色谱条件 下宜选用0.59mol.L-1高氯酸溶液作蛋白沉淀剂，因其余两种溶液均有较大的试 剂峰而严重干扰测定。
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2.10 正常儿童和成人血清Tyr和Phe值 采用本法测定经体检证实为健康 的 儿童30例，年龄3～10(平均5.8)岁，男女各半，健康成人33例，年龄20～50(平均35.6)岁 ，男20例，女13例，结果见表2。
2.11 临床应用 本院儿科遗传代谢性疾病专科门诊患者5例，其中4例尿 液苯丙酮症筛选试验的三氯化铁试验和2，4-二硝基苯肼试验均为阳性，临床诊断为PKU病 ，另1例尿液三氯化铁试验阴性、2，4-二硝基苯肼试验阳性，临床诊断排除PKU病。对上述 病人的血清Phe和Tyr浓度进行检测，发现PKU病患儿的血清Phe水平均达正常儿童对照组的20 倍以上，血清Tyr浓度(29.5～53.5μmol.L-1)则低于对照组。非PKU病儿血清Ph e浓度正常，Tyr浓度稍低。4例PKU病患儿的血清Phe和Tyr测定结果见表3。PKU患儿的血清和 尿液色谱图中均可见显著的Phe峰(图3，图4)。
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图3 PKU患儿血清色谱图
Fig.3 Chromatogram of serum in child ren with PKU 2.11min: Tyr; 3.34min: Phe
图4 PKU患儿尿液色谱图
Fig.4 Chromatogram of urine in children with PKU 3.64min: Phe
表2 健康儿童和成人血清Tyr,Phe水平(±s；μmol.L-1) 组别
n
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Tyr
Phe
儿童(3～10岁)
33
131.8±28.0①
61.4±10.8
成人(20～50岁)
33
83.6±9.4
69.3±8.6
①与成人比较P<0.01表3 PKU患儿血清Phe和Tyr浓度(μmol.L -1) 病例编号
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Phe
Tyr
1
1465
53.5
2
1530
36.8
3
1296
37.3
4
1759
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29.5
3 讨 论
PKU病是一种呈世界性分布的遗传代谢性疾病，病人血清、脑脊液及尿液中苯丙氨酸含量明 显增高。若此病被尽早诊断，限食含苯丙氨酸的食物，则预后良好，否则半数病人寿命不超 过20岁，70%的患者在30岁以前死亡。对于PKU病的筛查，目前国内多采用三氯化铁试验，2 ， 4-二硝基苯肼试验及Guthrie细菌抑制试验等定性试验。但对于筛查试验阳性者须要定量测 定血液中的Phe浓度取得确证，判断治疗效果更须定期监测血中Phe浓度。PKU患者的血清Tyr 浓度通常降低，血清Phe/Tyr浓度比值明显增大。因此认为同时测定血清Tyr浓度对PKU病的 诊断、治疗监测有一定的价值。此外，血清Phe/Tyr浓度比值测定在识别PKU携带者、判断肝 病的严重程度，以及监测抗肿瘤药物氨甲蝶呤等方面均具有一定价值[5]。
目前采用荧光法[1]只能单独测定Phe和Tyr，且涉及的试剂繁多，配制复杂，操作 时间长，并易受其他荧光物质的干扰。采用全自动化氨基酸分析仪测定，有操作流程长、平 衡时间长、成本高等缺点。国内外采用一些高效液相色谱法[2，3]及气相色谱法 [6]须将标本进行紫外衍生或气化等预处理，并大多需要复杂的双泵梯度洗脱操作 ，花费时间长，不适用于检测血清Phe和Tyr的临床需要。Hilton[5]介绍的直接测 定Phe和Tyr方法则存在标本预处理仍很复杂的缺点。
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Atherton等人[4]测定Phe的操作较简便、快速。笔者在该法的基础上对所用流动 相成分和pH值加以改变，即不加辛胺和浓高氯酸，采用外标法定量，缩短分析时间，进样后 在5min内即检测完毕。如适当缩短沉淀蛋白质所花费的时间，则从标本制备到分析完毕可 在15min内完成。本文测得的正常人血清Phe和Tyr浓度与国内外文献报道[2，3] 近似。
血清(浆)等体液标本不经化学衍生处理，直接用高效液相色谱紫外检测法检测Phe和Tyr时， 为避免非芳香族氨基酸等物质的干扰，需选择一个合适的紫外检测波长，国外文献有采用21 0nm,206nm和220nm等波长者[4，5，7]。作者经摸索选用190nm,表明在 此实验条件下可较特异地分离检测Phe和Tyr。
本试验的Phe和Tyr的浓度线性范围较宽，检测的峰面积与Phe和Tyr的浓度呈良好的线性关系 。本检测法灵敏度高(Phe和Tyr的最低检测限分别达0.75μmol.L-1和0.7μm ol.L-1 )，重复性好(变异系数均小于5%)，回收率高(达98%左右)，完全可满足检测的需要。
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本文通过测定血清中Phe浓度，协助临床确诊PKU病4例，排除PKU病1例。试验中还用本法测 定PKU病人尿液Phe，发现其Phe峰明显增大。但本法是否适于检测尿中Phe浓度尚待进一步探 讨。
参考文献：
[1] 王继贵主编.临床生化检验[M].长沙：湖南科学技术出版社， 1996：512-514.
[2] 袁倚盛，方明，沈敏.反相高效液相色谱法测定体液中氨基酸的初步报道[J].中 华医学检验杂志，1990，13(5)：263-266.
[3] 唐志毅，许维佳，杨振华，等.体液游离氨基酸反相高效液相色谱测定法[J].中 华医学检验杂志，1994，17(3)：140-143.
[4] Atherton ND, Green A. HPLC measurement of phenylalanine in plasma[J]. C lin Chem, 1988,34:2241-2244.
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[5] Hilton MA. Liquid-chromatographic direct determination of phenylalanine and tyrosine in serum or plasma, with application to patients with phenylketonur ia[J]. Clin Chem, 1982,28:1215-1218.
[6] Reilly AA, Bellisario R, Pass KA. Multivariate discrimination for phenylk etonuria(PKU) and non-PKU hyperphenylalaninemia after analysis of newborn's dri ed blood-spot speimens for six amino acid ion-exchange chromatography[J]. Cl in Chem, 1998,44:317-326.
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[7] Masfsumura S, Satsoka H, Makita M. Determination of amino acids in human by capilliary gas chromatography[J]. J Chromatogr, 1996,681:375-380.
[8] Amin MR, Tomita Y, Onodera R. Rapid determination of phenylalanine and it s related compounds in rumen fluid by high-performance liquid chromatography[J ]. J Chromatogr, 1995,663:201-207., 百拇医药
单位：唐爱国(第二附属医院检验科 长沙 410011)
关键词：氨基酸；血清；色谱法；高效液相；苯丙酮尿症
湖南医科大学学报000242 [摘要] 目的：建立快速、直接、同时测定血清苯丙氨酸和 酪氨酸的方法。方法：血清标本加高氯酸去蛋白后取上清，采用固定流量洗脱高效液相色谱 紫外检测法测定。结果：苯丙氨酸的线性范围为6～1512μmol.L-1，最低检测 浓度为0.75μmol.L-1；平均回收率为98.6%，批内CV为3.68%，批间CV为4.01 %。酪氨酸的线性范围为5.4～1380μmol.L-1，最低检测浓度为0.7.μmol.L-1，平均回收率98.9%，批内CV为1.87%，批间CV为2.59%。健康儿童血清苯丙氨 酸浓度为(61.4±10.8)μmol.L-1，血清酪氨酸浓度为(131.8±28.0)μmol.L -1。健康成人血清苯丙氨酸浓度为(69.3±8.6)μmol.L-1，血清酪氨 酸浓度 为(83.6±9.4)μmol.L-1。4例苯丙酮尿症患儿的血清苯丙氨酸浓度为1296～1759μmol.L-1，血清酪氨酸为29.5～53.5μmol.L-1。结论：本方 法灵敏度高，特异性好，方法简便快速，适合临床使用。
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[中图分类号] R446.112 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0209-04
Rapid high performance liquid chromatography for determination of phenylalanine and tyrosine in serum
Tang Ai-guo
Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University(Changsha 410011)
[Abstract] Objective: To develop a rapid assay for the determi n ation of phenylalanine and tyrosine in serum. Methods: The serum sample was inje cted directly into High performance liquid chromatography(HPLC) system after pre cipitation of protein with perchloric acid, and monitored at 190nm with an ult raviolet detector. Results: Good linearity was observed in 6～1512μmol.L-1 range for phenylalanine, the intra-run and inter-run imprecisions(CV) w ere 3.68% and 4.01%, the recovery rate was 98.6%; good linearity was observed in 5.4 ～1380.0μmol.L-1 range for tyrosine, the intra-run and inter-run i mp recisions were 1.87% and 2.59%, the average recovery rate was 98.9%. Conclusion: This method is simple, rapid, sensitive, accurate, and suitable for clinical applica tion.
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[Key words] amino acids; serum; chromatography,high perform ance liquid; phenylketonuria
在苯丙酮尿症(Phenylketonuria, PKU)等遗传代谢性疾病 的诊断、治疗和监测中血清(浆)苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)和酪氨酸(tyrosine, Tyr) 测定具有重要的临床意义。目前，国内主要采用荧光光度法[1]和高效液相色谱法 [2，3]测定。本文作者参照国外文献[4]，结合本室条件进行测定，以 期建立一种简便、快速的高效液相色谱法同时测定血清Phe和Tyr浓度。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 美国Waters公司PC800型高效液相色谱仪，包括M486紫外检测器，M5 10泵、M7125 Rheodyne进样阀及PC800色谱工作站；美国Millipore公司Milli-Q纯水器及江 苏太仓医疗器械厂TGLL-18台式高速离心机。
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1.1.2 试剂及其配制 L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸均为美国Sig ma公司产品；乙腈、甲醇均为浙江临海化工厂产品(色谱纯)；其他化学试剂均为国产分析纯 ，使用Milli-Q纯水器处理过的超纯水配制，其中包括：①0.59mol.L-1高氯酸 溶液。②0.6mol.L-1三氯乙酸(TCA)溶液。③0.4mol.L-1磺基水杨酸溶液。 ④称取L-Phe 10.0mg，用0.59mol.L-1高氯酸溶液溶解并 稀释至10.0ml，制成6100μmol.L-1 Phe标准贮存液，分成小份加塞置-30℃ 冰箱保存。⑤称取L-Tyr 10.0mg，用0.59mo l.L-1高氯酸溶液溶解并稀释至10.0ml，制成5500μmol.L-1的Tyr标 准贮存液，分成小份加盖置-30℃冰箱保存。⑥取上述两种标准贮存液各1.0ml，加0.59 mol.L-1高氯酸溶液至100ml，制成标准应用液(含Phe 61μmol.L-1， Tyr 55μmol.L-1)，放4℃冰箱至少可存放2个月。⑦取乙腈40ml，加水至1000 ml，用0.45μ微孔滤膜过滤，制成4%乙腈(流动相)。使用前用超声波清洗器脱气处理1 5min。
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1.2 方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱为美国Waters公司NOVA-PAKC18不锈钢柱(3.9mm×150 mm)；流动相为4%乙腈溶液，流速为1ml.min-1；检测波长UV 190nm；进 样量为20μl。
1.2.2 血清样品的处理 吸取血清0.1ml于塑料小离心管内，加入等量 0.59mol.L-1高氯酸溶液，加盖后于旋涡混合器上混合30s，室温放置15min ，离心，12000r.min-1，5min，取上清液进样检测。
1.2.3 Phe和Tyr峰的定性和定量 Phe和Tyr峰采用峰保留值比较法和叠加 法定性分析；用外标法测峰面积进行定量分析，结果均由PC800色谱工作站计算并打印。
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1.3 统计学处理 检测结果用均数±标准差(
±s)表示；两组 间比较用t检验。2 结 果
2.1 检测波长的选择 取Phe和Tyr混合标准应用液分别在190，195，200， 205，210，215，220，254nm处检测，结果显示，UV 190nm处可使Phe和Tyr均获得最灵 敏的响应。
2.2 流动相中乙腈含量的选择 配制不同乙腈含量(0%，2%，3%，4%，6%， 10%，15%)的流动相，再分别注入混合标准应用液测定，发现随着乙腈含量增加，Phe和Tyr 峰的保留时间相应地缩短，当乙腈含量为15%时，Tyr峰与高氯酸峰分离欠佳，而血清样品中 的Tyr和Phe峰均不能基线分离。作者选用4%乙腈作流动相，可使标准品和血清样品中Tyr和P he峰均可在5min内良好分离。此外如选用4%甲醇作为流动相，亦可使Thr和Phe峰良好分离 ，但保留时间均相应延长数分钟。
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2.3 流动相pH值改变对保留时间的影响 以pH值为6.5和4.5的4%乙腈作 流动相，分别注入混合标准应用液进行检测，发现在这两种pH值的流动相中，Tyr和Phe峰的 保留时间无明显变化，作者采用pH6.5的4%乙腈为流动相，省略调节pH的步骤。
2.4 标准品和血清样品中Tyr和Phe色谱分离结果 图1，图2示色谱峰分离 良好，Tyr峰前为其他物质峰，对测定无干扰。
图1 标准品色谱图
Fig.1 Standard chromatogram 2.14m in: Tyr; 3.58min: Phe
图2 血清标本色谱图
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Fig.2 Serum sample chromatogram 2.13m in: Tyr; 3.58min: Phe
2.5 标准曲线 Phe标准溶液在6～1512μmol.L-1范围内，以 浓度(C)对其相对的峰面积(A)作回归分析，回归方程为：A=64452+3793C,r=0.9995。Ty r标准溶液在5.4～1380μmol.L-1范围内，回归方程为：A=143706+4110C,r =0.9966。均示线性良好。当信噪比为3时，血清Phe和Tyr的最低检测浓度分别为0.75 μmol.L-1和0.7μmol.L-1。
2.6 精密度检测 取健康人血清数份，混合作批内、批间变异测定。结果 见表1。
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表1 精密度测定(
±s；μmol .L-1)n
Phe
CV(%)
Tyr
CV(% )
批内
20
70.5±2.6
3.68
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1.87
批间
30
69.8±2.8
4.01
84.8±2.2
2.59
2.7 回收率测定 向Phe浓度为66.8μmol.L-1和Tyr浓度为86 .6μmol.L-1的血清标本中加入122μmol.L-1的Phe标准液和110μmo l.L-1的Tyr标准液，测得Phe的回收率为(98.6±2.4)%，Tyr的回收率为(98.9±2 .1)%。
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2.8 干扰试验 向血清样品和标准品中加入含量为48.9μmol.L-1 和489μmol.L-1的L-色氨酸标准液(用0.1mol.L-1 HCl配制)后进样 测定，未见明显的色氨酸峰，也未见其对Phe和Tyr的干扰。另取263.2μmol.L-1 肌酐标准液进样测定，也未见明显的肌酐峰及对Phe和Tyr的干扰。
2.9 蛋白沉淀剂的选择 分别取0.59mol.L-1高氯酸溶液，0.6 mol.L-1 TCA溶液和0.4mol.L-1磺基水杨酸溶液作为蛋白沉淀剂，与等 体积的血清标本混合后，室温放置15min，离心取上清液进样测定。发现在本文色谱条件 下宜选用0.59mol.L-1高氯酸溶液作蛋白沉淀剂，因其余两种溶液均有较大的试 剂峰而严重干扰测定。
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2.10 正常儿童和成人血清Tyr和Phe值 采用本法测定经体检证实为健康 的 儿童30例，年龄3～10(平均5.8)岁，男女各半，健康成人33例，年龄20～50(平均35.6)岁 ，男20例，女13例，结果见表2。
2.11 临床应用 本院儿科遗传代谢性疾病专科门诊患者5例，其中4例尿 液苯丙酮症筛选试验的三氯化铁试验和2，4-二硝基苯肼试验均为阳性，临床诊断为PKU病 ，另1例尿液三氯化铁试验阴性、2，4-二硝基苯肼试验阳性，临床诊断排除PKU病。对上述 病人的血清Phe和Tyr浓度进行检测，发现PKU病患儿的血清Phe水平均达正常儿童对照组的20 倍以上，血清Tyr浓度(29.5～53.5μmol.L-1)则低于对照组。非PKU病儿血清Ph e浓度正常，Tyr浓度稍低。4例PKU病患儿的血清Phe和Tyr测定结果见表3。PKU患儿的血清和 尿液色谱图中均可见显著的Phe峰(图3，图4)。
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图3 PKU患儿血清色谱图
Fig.3 Chromatogram of serum in child ren with PKU 2.11min: Tyr; 3.34min: Phe
图4 PKU患儿尿液色谱图
Fig.4 Chromatogram of urine in children with PKU 3.64min: Phe
表2 健康儿童和成人血清Tyr,Phe水平(
±s；μmol.L-1) 组别n
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Tyr
Phe
儿童(3～10岁)
33
131.8±28.0①
61.4±10.8
成人(20～50岁)
33
83.6±9.4
69.3±8.6
①与成人比较P<0.01表3 PKU患儿血清Phe和Tyr浓度(μmol.L -1) 病例编号
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Phe
Tyr
1
1465
53.5
2
1530
36.8
3
1296
37.3
4
1759
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29.5
3 讨 论
PKU病是一种呈世界性分布的遗传代谢性疾病，病人血清、脑脊液及尿液中苯丙氨酸含量明 显增高。若此病被尽早诊断，限食含苯丙氨酸的食物，则预后良好，否则半数病人寿命不超 过20岁，70%的患者在30岁以前死亡。对于PKU病的筛查，目前国内多采用三氯化铁试验，2 ， 4-二硝基苯肼试验及Guthrie细菌抑制试验等定性试验。但对于筛查试验阳性者须要定量测 定血液中的Phe浓度取得确证，判断治疗效果更须定期监测血中Phe浓度。PKU患者的血清Tyr 浓度通常降低，血清Phe/Tyr浓度比值明显增大。因此认为同时测定血清Tyr浓度对PKU病的 诊断、治疗监测有一定的价值。此外，血清Phe/Tyr浓度比值测定在识别PKU携带者、判断肝 病的严重程度，以及监测抗肿瘤药物氨甲蝶呤等方面均具有一定价值[5]。
目前采用荧光法[1]只能单独测定Phe和Tyr，且涉及的试剂繁多，配制复杂，操作 时间长，并易受其他荧光物质的干扰。采用全自动化氨基酸分析仪测定，有操作流程长、平 衡时间长、成本高等缺点。国内外采用一些高效液相色谱法[2，3]及气相色谱法 [6]须将标本进行紫外衍生或气化等预处理，并大多需要复杂的双泵梯度洗脱操作 ，花费时间长，不适用于检测血清Phe和Tyr的临床需要。Hilton[5]介绍的直接测 定Phe和Tyr方法则存在标本预处理仍很复杂的缺点。
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Atherton等人[4]测定Phe的操作较简便、快速。笔者在该法的基础上对所用流动 相成分和pH值加以改变，即不加辛胺和浓高氯酸，采用外标法定量，缩短分析时间，进样后 在5min内即检测完毕。如适当缩短沉淀蛋白质所花费的时间，则从标本制备到分析完毕可 在15min内完成。本文测得的正常人血清Phe和Tyr浓度与国内外文献报道[2，3] 近似。
血清(浆)等体液标本不经化学衍生处理，直接用高效液相色谱紫外检测法检测Phe和Tyr时， 为避免非芳香族氨基酸等物质的干扰，需选择一个合适的紫外检测波长，国外文献有采用21 0nm,206nm和220nm等波长者[4，5，7]。作者经摸索选用190nm,表明在 此实验条件下可较特异地分离检测Phe和Tyr。
本试验的Phe和Tyr的浓度线性范围较宽，检测的峰面积与Phe和Tyr的浓度呈良好的线性关系 。本检测法灵敏度高(Phe和Tyr的最低检测限分别达0.75μmol.L-1和0.7μm ol.L-1 )，重复性好(变异系数均小于5%)，回收率高(达98%左右)，完全可满足检测的需要。
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本文通过测定血清中Phe浓度，协助临床确诊PKU病4例，排除PKU病1例。试验中还用本法测 定PKU病人尿液Phe，发现其Phe峰明显增大。但本法是否适于检测尿中Phe浓度尚待进一步探 讨。
参考文献：
[1] 王继贵主编.临床生化检验[M].长沙：湖南科学技术出版社， 1996：512-514.
[2] 袁倚盛，方明，沈敏.反相高效液相色谱法测定体液中氨基酸的初步报道[J].中 华医学检验杂志，1990，13(5)：263-266.
[3] 唐志毅，许维佳，杨振华，等.体液游离氨基酸反相高效液相色谱测定法[J].中 华医学检验杂志，1994，17(3)：140-143.
[4] Atherton ND, Green A. HPLC measurement of phenylalanine in plasma[J]. C lin Chem, 1988,34:2241-2244.
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[5] Hilton MA. Liquid-chromatographic direct determination of phenylalanine and tyrosine in serum or plasma, with application to patients with phenylketonur ia[J]. Clin Chem, 1982,28:1215-1218.
[6] Reilly AA, Bellisario R, Pass KA. Multivariate discrimination for phenylk etonuria(PKU) and non-PKU hyperphenylalaninemia after analysis of newborn's dri ed blood-spot speimens for six amino acid ion-exchange chromatography[J]. Cl in Chem, 1998,44:317-326.
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[7] Masfsumura S, Satsoka H, Makita M. Determination of amino acids in human by capilliary gas chromatography[J]. J Chromatogr, 1996,681:375-380.
[8] Amin MR, Tomita Y, Onodera R. Rapid determination of phenylalanine and it s related compounds in rumen fluid by high-performance liquid chromatography[J ]. J Chromatogr, 1995,663:201-207., 百拇医药