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编号:10214042
同种异体肌腱移植的实验研究

     作者:王锡阳 李康华 王卫国

    单位:王锡阳(附属湘雅医院骨科 长沙 410008);李康华(附属湘雅医院骨科 长沙 410008);王卫国(附属湘雅医院骨科 长沙 410008)

    关键词:移植;同种;异体;冷冻干燥*;肌腱*;肌骨骼系统;豚鼠

    湖南医科大学学报000214[摘要] 采用淋巴细胞毒试验、淋巴细胞转化 试验及吞 噬细胞功能实验等多项细胞免疫学指标测定,以及组织形态学观察与生物力学测定,比较深 低 温冷冻与深低温冷冻干燥两种不同处理方式对同种异体肌腱移植的差异,并综合评价各种移 植的效果。结果显示:①深低温冷冻移植组及深低温冷冻干燥移植组的淋巴细胞死亡率、转 化率及吞噬细胞吞噬率均低于未经处理的同种异体移植组(P<0.05),而与自体肌腱移植 组差异无显著性(P>0.05);②深低温冷冻移植组、深低温冷冻干燥移植组及自体肌腱移 植组肌腱无明显坏死,但腱周出现轻度粘连和结合部膨大,未经处理的同种异体肌腱移植组 肌腱变性坏死;③光镜、电镜下未经处理的异体肌腱移植组肌腱腱束变性坏死,而深 低温冷冻移植组与冷冻干燥移植组则无明显差别。上述结果表明,深低温冷冻干燥或冷冻但 未经干燥的同种异体肌腱在免疫学、生物力学、形态学方面的表现与自体肌腱移植结果基本 相同,而未经处理的异体肌腱因免疫排斥反应大,移植后易变性坏死。

    [中图分类号] R686.1 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0138-03

    Experimental study of tendon allograft

    WANG Xi-yang, LI Kang-hua, WANG Wei-guo

    Department of Ortheopedics, Xiangya Hospital, Hunan Medi cal University(Changsha 410008)

    [Abstract] A series of immunologic tests, incl uding lymphocy te cell toxicity test, as well as lymphocyte transformation test, macrophage fun ction test, histological examination, and biomechanical measurement were carried out in gui ne a pigs to compare the effect of deep freezing(Group Ⅰ) with deep freezedrying(G roup Ⅱ) on tendon allografts. The results revealed that the lymphocyte mortalit y, lymphocytic-transformed rate and phagocytizing rate of the macrophages in G roup Ⅰ and Group Ⅱ were lower than those in non-processed allograft group(Gro up Ⅲ) and had no statistical difference among Group Ⅰ, Group Ⅱ and Group Ⅲ. As compared with the non-processed allograft, the freezed and freeze-dried all ografts showed ameliorated immunologic reactions, mild morphological lesion and better mechanical strength after transplantation. The results suggest that deep freezing and deep freeze-drying processings are valid measures in tendon allogr aft treatment.

    [Key words] transplantation,homologous,heterologous; freeze -drying.; tendon.; musculoskeletal system; guinea pigs

    在手部损伤中,肌腱损伤约占30%,肌腱缺损需行 肌腱移植者占25% [1]。肌腱缺损修复的传统方法是自体肌腱移植,存在取材有限、影响取材部位功能 等缺点。50年代以来,开展了同种异体肌腱移植的研究,但由于免疫排斥反应未能解决,使 得本项工作尚未有突破性进展。为降低肌腱的抗原性,曾先后采用三氯甲烷浸泡、乙烯氧培 养、脱氧鸟苷培养、r射线照射等方法[2~4],但都存在处理复杂、不易贮存、 对肌腱有损害等缺点,难于推广应用。后来发现深低温冷冻或冷冻干燥保存可明显降低肌腱 的抗原性,在此基础上Peer于1955年首先创立了同种异体肌腱库[5]。90年代早期 ,我国学者开始了对同种异体肌腱采用深低温冷冻或深低温冷冻干燥处理进行移植的实验研 究,取得了与自体肌腱移植基本相似的结果。以往的研究在免疫学方面,只作了淋巴细胞毒 实 验,仅能反映免疫排斥反应的一个方面,即体液免疫方面,而未能反映移植后的细胞免疫。 以往的实验也未深入研究电镜下的肌腱超微结构变化[6]。为此,本研究采用多项 免疫检测指标、不同层次的形态学观察及生物力学测试对同种异体肌腱移植进行实验研究,旨在深入了解深低温冷冻与深低温冷冻干燥同种异体肌腱的移植效果,为临床应用提供实验依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验方法

    1.1.1 实验动物与分组 选用成熟豚鼠60只(由湖南医科大学湘雅医院动物室提供 ),体重350~700g,平均436g。随机分为6组(A1,A2,B,C,D,E),每组10只。A 1,A2组合为A组,共20只,为肌腱提供组,其中A1组为深低温冷冻肌腱提供组,A2 组为深低温冷冻干燥肌腱提供组;B组为深低温冷冻移植组;C组为深低温冷冻干燥移植组; D组为未经处理的肌腱移植组;E组为自体肌腱移植组。

    1.1.2 移植 A1组深低温冷冻处理的跟腱20条,分别经16℃~20℃林格 氏液浸泡10~15min后,移植至B组动物的左右后肢。将A2组深低温冷冻干燥处理的跟腱 20条分别经林格氏液浸泡1h后,移植至C组动物的左右后肢。将D组动物随机两两配对,然后将甲动物左右后肢新鲜跟腱移植至乙动物左右后肢,乙动物左右后肢新鲜跟腱移植于甲动 物左右后肢。将E组动物左右后肢新鲜跟腱自体交换移植。

    1.1.3 同种异体肌腱的处理 (1)深低温冷冻处理:A1组动物沿后肢小 腿作直切口显露游离跟腱全长,于起止点处切断,分别标记,用生理盐水冲洗后,放入RMPI -1640细胞营养液中浸泡30min,取出置入容器内密封,然后置入-73℃冷冻冰箱7d。 (2 )深低温冷冻干燥处理:A2组按上述方法处理后,再进行冷冻干燥处理(冷冻干燥机的控制 条件为真空状态下-45℃,10个大气压、干燥时间20h),肌腱取出后,置入无菌容器内密 封,室温下避光保存。

    1.1.4 手术方法 所有动物每次手术均采用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,俯卧 位皮肤脱毛消毒,均作后肢直切口。取腱长度均为2cm,移植腱用0/5无创尼龙线“8”字 缝合,并于两端加固缝合2针。切口均用0/1丝线连续缝合、消毒。术后肢体不制动,按组编 号、分笼,同条件喂养。

    1.2 检测方法

    1.2.1 肌腱的生物力学测试 各组动物移植术后3周,取肌腱(包括用自制肌腱固 定器固定肌腱两端结合部肌腱)行垂直拉伸负荷测试。上端固定器固定于支架上, 下端固定器与砝码盘相连,事先测定下端固定器及砝码重量(分析天平),在盘中逐渐添加砝 码,测量结合部断裂时的最大拉伸负荷。

    1.2.2 肌腱移植3周后免疫水平测定 (1)淋巴细胞毒试验:取B,C,D,E 组动物外周血(心脏血)1.5~2ml,待血块凝固后离心(1500r.min-1)10min ,留取上层血清。A,D,E组动物经麻醉后取脾脏,用100目钢网磨碎,RMPI-1640培养基洗 涤3次,使淋巴细胞分离成单个核细胞,制成淋巴细胞悬液,浓度为2×106.ml-1 。将血清稀释成1∶8,取1μl血清加入鉴定板孔内,再加入淋巴细胞悬液1μl,在室 温下静置30~60min,再加入兔补体5μl,60min后用伊红染色。在倒置显微镜下观察 并计算淋巴细胞死亡百分率。淋巴细胞死亡率=(死亡细胞数/死亡细胞加未死亡的细胞总数) ×100%。(2)巨噬细胞吞噬功能试验:将RPMI-1640细胞培养液(含10%小牛血清)5ml注入 动物腹腔内,30min后取腹腔液3ml,1000r.min-1离心10min,弃去大 部分上清液,留下余液0.5~1ml,加入白色念珠菌0.1ml(细胞浓度为3×177.ml -1),混匀,置37℃水浴箱30min,每10min摇匀1次,1000r.min-1 离心6~8min,留沉淀液0.5ml,涂片经吉姆萨染色后,高位显微镜下检查,计数200个 巨噬细胞(MΦ),计算吞噬百分率。吞噬百分率=(吞噬白色念珠菌的巨噬细胞数/吞噬和未 吞噬白色念珠菌的巨噬细胞总数)×100%。(3)淋巴细胞增殖效应:按上法取脾细胞,调整细 胞浓度(5 ×105.ml-1),用96孔板(0.1ml/孔),加入含刀豆球蛋白A(ConA)的培基0.1 ml(终浓度为10μg.ml-1)。每一样品设3个复孔,并设未加ConA作对照,置37℃ , 5% CO2孵育箱培养48h,然后加3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),0.5μC i/孔 ,继续培养24h。收集细胞于玻璃纤维滤纸上 ,将其放入闪烁瓶中,加入1ml闪烁液, 用液闪仪测脉冲数(CPM),计算刺激指数(SI)。刺激指数(SI)=实验组CPM/对照组CPM。

    1.2.3 肌腱移植3周后形态学观察 各组肌腱于移植3周后麻醉,显露移植 部位,观察皮肤切口及周围组织反应、肌腱结合部愈合情况、移植肌腱颜色和粘连程度,并 取材在光镜(HE染色)及电镜下行形态学观察分析,综合评价肌腱修复情况。

    1.3 统计方法 实验数据采用方差分析Oneway ANOVA(F检验),有差异 存在即行Student-Newman Kuel's检验作两两比较。

    2 结 果

    本实验共用豚鼠60只。麻醉死亡2只,术后不明原因死亡10只,共死亡12只。其中A组4只、B 组3只、C组1只、D组2只、E组2只。移植65条肌腱。吻合口128个,均未见吻合口断裂。

    2.1 力学及免疫学测试结果 4种实验方法均示D组(未处理组)与 B,C,E组 的差异有显著性 (P<0.05),余两两比较结果差异无统计学意义(P>0.05)(表1) 。

    表1 生物力学、免疫学测试结果表(±s) 分组

    最大拉伸负

    荷(牛顿)

    淋巴细胞

    死亡率(%)

    刺激指数

    (%)

    吞噬百分率

    (%)

    B组(n=14)

    3.09±1.31

    34.0±5.5

    43.7±13.5

    23.2±9.7

    C组(n=18)

    2.85±0.98

    27.1±4.9

    67.0±18.7

    21.8±7.4

    D组(n=16)

    0.53±0.58

    75.8±11.1

    124.3±15.9

    37.3±2 0.9

    E组(n=16)

    3.71±1.47

    23.8±10.9

    39.3±17.7

    1 3.2±5.5

    2.2 形态组织学变化 各组肌腱移植后组织形态学改变可归纳如下(表2 )。表2 各组肌腱移植后组织形态学观察结果 分组

    肉眼观

    光镜

    电镜

    B组

    皮肤大部分无红 肿,无明显渗出。

    肌腱有光泽,结合部膨大愈合。

    腱束结构清楚,无变性坏死及水肿,毛细血管 充血,有少数淋巴细胞及单核细胞浸润。

    胶原原纤维大多呈平行排列 ,腱细胞胞质较厚,可见大量微丝、游离核蛋白体和粗面内质网。

    C组

    肌腱有光泽,接合部稍膨大,与周围有粘连。

    肌腱腱束结构清晰,未见变性坏死,间质无明显水肿,可见新生毛细血管及成纤维细 胞增生,炎症反应不明显,仅见少量淋巴细胞和少量嗜酸性白细胞浸润。

    排列整 齐的胶原纤维束超微形态与B组无明显差异,但间质中常见增生活跃的成纤维细胞,胞质内 可见大量扩张的粗面内质网。

    D组

    切口皮肤红肿,渗出明显,部分裂开,腱束肿大, 失去光 泽。

    肌腱腱束变性、坏死、间质水肿,结构模糊不清。

    胶原原纤 维排列混乱,肿胀变粗,横纹周期变长,腱细胞亦出现肿胀、崩解。

    E组

    切口愈合好,肌腱有光泽,结合部愈合,粘连轻。

    结构清楚,间质无水肿,可见大量新生毛细血管增生,毛细血管间有大量成纤维细胞 增生及少量间质细胞,仅有少量的淋巴细胞浸润。

    胶原纤维束及腱细胞的形态 结构与B组基本相同,并可见增生的成纤维细胞。

    3 讨 论

    异体肌腱移植成败的关键是受者对移植免疫排斥反应的强弱。异体移植中引起免疫排斥反应 的主要成份是主要组织相容性抗原(在人类为HLA分子)[7,8],这些抗原须经抗 原呈递细胞(Antigen pressenting cell, APC),通常是指巨噬细胞、树突状细胞以及移 植物的残留白细胞,将这些抗原分子递呈给T细胞,以启动宿主对移植物的排斥反应,而移 植物残留的APC是触发排斥反应的重要因素。Minami等[9]采用补体依赖性细胞毒 性试验,证实了肌腱组织的抗原性不在胶原纤维,而在其细胞成份,因为采用冷冻、冷冻干 燥及化学等方法处理可破坏肌腱中细胞成份,即降低其抗原性。本研究结果表明,深低温冷 冻或冷冻干燥的同种异体肌腱移植后的淋巴细胞毒试验、淋巴细胞转化试验及巨噬细胞吞噬 功能试验的结果均与自体肌腱移植无差异,并显著优于未经处理的异体肌腱,因而为临床 应用上述方法的安全性提供了可靠的实验依据。

    移植肌腱于深低温冷冻,冷冻干燥处理后,早期断裂负荷及弹性刚度有所降低,以后逐渐增 加,3周后其力学指标与自体肌腱移植者相近。这是由于移植后早期,吻合端 水肿软化,断端间隙中的肉芽组织又非常幼嫩,不足以抵抗外力,随后水肿消失,肉 芽组织逐渐被新生的胶原原纤维所替代[10,11]。本实验在生物力学测试中也 证实,深低温冷冻干燥或冷冻但未经干燥处理的同种异体肌腱在拉伸力学性能上虽稍低于自 体移植肌 腱,但无统计学差异(P>0.05),这说明移植3周后,深低温冷冻干燥或冷冻但未经干燥 处理的力学表现与自体肌腱相似。

    形态学观察中,经深低温冷冻处理后的同种异体肌腱移植与自体肌腱移植大致相同。而未经 处理的同种异体肌腱移植切口皮肤红肿,渗出明显,部分裂开,腱束肿大,失去光泽。光镜 下,深低温冷冻处理后的同种异体肌腱的腱束结构清楚,无明显变性坏死,结合部有大量新 生毛细血管或成纤维细胞增生,电镜下见胶原原纤维呈平行排列,腱细胞细胞器活跃。光镜 下未经处理组可见明显变性坏死,间质水肿,结构模糊不清;电镜下胶原原纤维肿胀、紊乱 ,横纹周期变长,腱细胞肿胀崩解。本实验连接部胶原原纤维和腱细胞的超微形态观察结 果提示,经深低温冷冻处理后的肌腱与受体肌腱具有相容性,但光镜下仍可见连接部有少量 淋巴细胞及单核细胞的浸润,故其慢性或迟发性的细胞免疫是否会影响移植后的同种异体肌 腱的存活尚有待进一步研究。

    通过多指标的免疫学检测、不同层次的形态学观察及生物力学测试等实验,发现经深低温冷 冻处理后,无论经干燥处理与否,均能较好降低其组织的抗原性,减轻排斥反应,且各方面 的性质与自体肌腱移植无明显差异,两种方法处理后的同种异体肌腱在免疫学、形态学、 生物力学上的表现亦无明显差异,这与以往的实验研究结果相符。经深低温冷冻后再行干 燥处理有使用方便,易保存等优点,但干燥处理过程复杂,耗价大。当然,两者的临床效果 是否存在差异,特别是远期疗效的差异目前尚无法判定。

    参考文献:

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