重组日本血吸虫副肌球蛋白的表达与纯化
作者：周金春 易新元 Kalinna BH McManus DP
单位：周金春(湖南医科大学血吸虫病研究室 长沙 410078)；易新元(湖南医科大学血吸虫病研究室 长沙 410078)；Kalinna BH(The Queens land Institute of Medical Research Queensland 4029,Australia)；McManus DP(The Queens land Institute of Medical Research Queensland 4029,Australia)
关键词：日本血吸虫；副肌球蛋白；抗原纯化*；基因重组
湖南医科大学学报000204[摘要] 用基因重组技术，将日本血吸虫副肌球蛋白(rSj97 )基因亚克隆至表达载体pQE30上。在IPTG诱导下，重组日本血吸虫副肌球蛋白在大肠杆菌中 得以高效表达。通过快速蛋白质液相色谱仪(FPLC)，经TALON柱和离子交换柱两步分离纯化 ，获得大量高纯度的重组日本血吸虫副肌球蛋白，为水牛现场试验提供了充足的抗原。
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[中图分类号] R532.21 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0106-03
Expression and purification of recombinant
Schistosoma japoni cum paramyosin
ZHOU Jin-chun, YI Xin-yuan
(Department of Parasitology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Kalinna BH, McManus DP
(The Queensland Institute of Medical Research Queensland 4029, Australia)
, 百拇医药
[Abstract] Paramyosin of Schistosoma japonicum was express ed at a high level in E.coli. The recombinant protein could be easily purifi ed f rom bacteria lysate by fast protein liquid chromatography(FPLC) on a TALON resin column, due to the protein being expressed with a tag of six histidine residue fused to the N-terminus. The protein was completely soluble and could be eluted under non-denaturing condition using imidazole . To eliminate imida zole and res idue of E.coli, the elution was further purified by ion-exchange chrom atography. The purified protein will be used in water buffaloes in the study on protective immunity against Schistosoma japonicum.
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[Key words] Schistosoma japonicum; paramyosin; antigen purification*; gene recombination
副肌球蛋白是存在于大多数无脊椎动物中的一种肌纤维蛋 白[1]。由于脊椎动物体内无此同源性蛋白不会引起自身免疫反应。因此认为这种 蛋白具有较好的疫苗潜能。血吸虫副肌球蛋白(Sm97和Sj97)已被公认为最有前途的疫苗候选 分子之一[2]。比较编码日本血吸虫不同株(大陆株、菲律宾株及日本株)副肌球蛋 白的核苷酸序列，发现仅有个别氨基酸的差异[3]。有研究表明血吸虫副肌球蛋白 与班氏丝虫[4]、蛔虫[5]及绦虫[6，7]等其它蠕虫的副肌球 蛋白在免疫学上有交叉反应性或基因上有高度同源性。因此，副肌球蛋白还可能成为抗多种 蠕虫的交叉免疫源。本室的合作伙伴，澳大利亚昆士兰医学研究所分子寄生虫学室已构建和 克隆出编码日本血吸虫副肌球蛋白(Sj97)全部开放阅读框架的cDNA，并已亚克隆至表达载体 pQE30。本文进一步报道利用FPLC对重组Sj97的纯化。
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1 材料与方法
1.1 阳性克隆菌 日本血吸虫副肌球蛋白基因(Pmy25)亚克隆至pQE30转染 的XL1-Blue菌株，由澳大利亚昆士兰医学研究所分子寄生虫学室提供。
1.2 表达 将含重组体的阳性菌接种于含氨苄青霉素(终浓度为100μg. ml-1)的LB培养液中，37℃震荡培养直至OD600达到0.7～0.9；加IPTG(终浓度为1 mM)诱导并继续培养4h。培养物在4℃以5000r.min-1离心15min，弃上清， 收集细菌沉淀。
1.3 纯化
1.3.1 TALON柱层析 将细菌沉淀以1∶5(W/V)的比例溶解于缓冲液A(50mM Tris HCl, pH8.0)中，置于冰与冷水中反复冻融3次，以20Hz超声粉碎15min，再在4℃以1 000r.min-1离心20min，将上清与平衡了的TALON树脂混合后置室温低速旋转振 摇30min，以1500r.min-1离心1min，将沉淀装入1cm直径的玻璃柱中，将 柱装在FPLC(快速蛋白质液相色谱)仪上。先用缓冲液A洗去大肠杆菌蛋白，再以缓冲液B(0. 5M的咪唑溶于缓冲液A中)洗脱重组蛋白，用自动收集仪，以0.5ml.min-1的流速 ，按每管1ml收集洗脱液。从峰值各管中取少量样本进行SDS-PAGE。
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1.3.2 离子交换柱层析 混合含有重组蛋白的数管洗脱液，在缓冲液A中 于4℃透析过夜，离心去沉渣，上清装入离子交换柱中，缓冲液A同上，缓冲液B为1M NaCl于 缓冲液A中，将柱与FPLC仪连接进行离子交换层析。首先流出的是咪唑和残余大肠杆菌蛋白 ，再以缓冲液B洗脱副肌球蛋白，收集峰值管。从峰值管中取少量样本进行SDS-PAG E，将含重组蛋白量高的各管混合，即为纯化的重组副肌球蛋白。
2 结 果
重组副肌球蛋白在非变性状态下完全溶解在提取液(50mM Tris-HCl pH8.0)中。通过FPLC ，用缓冲液B将rSj97自TALON柱上洗下，记录器描出一个单一的尖峰(图1)。从峰值管中 取微量样本进行微胶电泳结果(图2)显示，经TALON柱层析后获得的重组蛋白为部分纯化产品 。经离子交换柱层析(图3)后，即获得高纯度的rSj97(图4)。
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图1 rSj97经TALON柱亲和层析时从FPLC上描下的曲线
Fig.1 rSj97 purified by FPLC using T ALON resion
图2 SDS-PAGE显示TALON柱亲和层析纯化后的rSj97
Fig.2 SDS-PAGE showing purified rSj97 b y TALON affinity chromatographn
图3 rSj97经离子交换柱层析时从FPLC上描下的曲线
Fig.3 rSj97 purified by FPLC using a n ion-exchange colum
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图4 SDS-PAGE显示经离子交换柱层析纯化后的 rSj97
Fig.4 SDS-PAGE showing purified rSj97 b y ion-exchange chromatography
3 讨 论
已有不少关于纯化血吸虫天然副肌球蛋白的报道，包括用盐析的生化纯化[8]，用 抗副肌球蛋白的单克隆抗体进行的免疫亲和层析[9]及SDS-PAGE凝胶电泳分离纯 化[10]等。随着分子生物学技术的渗透，对这一疫苗分子的研究也越来越深入。 1986年，由Lanar[8]首先克隆了编码约一半曼氏血吸虫副肌球蛋白分子(Sm97)的c DNA，随后Laclette等[7]获得了编码Sm97全长cDNA序列。编码日本血吸虫副肌球 蛋白(Sj97)的全部核苷酸序列首先由McManus[3]实验室获得，并已亚克隆至高效 表达载体pQE30上。
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pQE是一种原核生物表达载体，被广泛应用于重组蛋白的表达和纯化。它的基本原理是利用 表达载体上的6个组氨酸残端与固态的金属亲和层析树脂(immobilized metal affinity chr omatography, IMAC)有高度亲和力；重组蛋白可在变性或非变性状态下被纯化，即使被纯化 的重组蛋白含量很低也能被有效地纯化出来。由于与树脂的结合是可逆的，故被纯化的蛋白 可在极温和的条件下被洗脱。树脂的稳定性好，可反复使用多次，成本低。TALON是一种非 镍的IMAC树脂，比镍类树脂更优越，如镍类树脂有与不含6个组氨酸残端的宿主蛋白结合的 倾向[11]，而TALON比镍类树脂对含6个组氨酸残端的蛋白结合力低。因此，TALO N明显降低了与杂蛋白的结合力，可省略洗脱重组蛋白之前的烦琐洗涤过程；而且它比镍类 树脂洗脱重组蛋白的条件更温和，对保持重组蛋白的自然状态和完整性更有利。本研究采用 TALON树脂通过FPLC对重组日本血吸虫副肌球蛋白进行纯化获得大量纯化的rSj97，并已在水 牛的现场试验中取得很好的保护性效果(另文报道)。
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参考文献：
[1] Kagawa H, Gnegyo K, Mclachlan AD, et al. Paramyosin gene(unc-15) of caenorhabditie elegans: molecular cloning, nuclotide sequence an d models for thick filament structure[J]. J Mol Bio, 1989,207:311-333.
[2] Waine GJ, McManus DP. Schistosomiasis vaccine development-the current pi cture[J]. Bioessays, 1997,18(5):435-443.
[3] Becker MM, Kalinna BH, Yang W, et al. Gene cloning and complete nucle otide sequence of philippine Schistosoma japonicum paramyosin[J]. Acta Tro pica, 1995,59:143-147.
, 百拇医药
[4] Nanduri J, Kazura JW. Paramyosin-enhanced of Brugia malayi microfila ria in mice[J]. J Immunol, 1989,143(19):3359-3363.
[5] Wisnewski AV, Kresina TF. Induction of protective immunity to schistosomi asis with immunologically cross-reactive lumbricus molecules[J]. Int J Parasi tol, 1995,25(4):503-510.
[6] Kalinna B, McManus DP. An IgG(Fc gamma)-binding protein of Taeniacrassic eps(cestoda) exhibits sequence homology and antigenic similarity with shistosome paramyosin[J]. Parasitology, 1993,106:289-296.
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[7] Laclette JP, Landa A, Arcos L, et al. Paramyosin is the Sm(trematoda) homolgue of antigen B from Taenia solium(cestoda)[J]. Mol Biochem Parasit ol, 1991,44(2):287-295.
[8] Lanar DE, Pearce EJ, James SL, et al. Identifications of paramyosin a s schistosome antigen recognized by intradermally vaccinated mice[J]. Science, 1986,234:593-596.
[9] Pearce EJ, James SL, Hieny S, et al. Induction of protective immunity against Schistosoma mansoni by vaccination with schistosome paramyosin(Sm97 ), a non-surface parasite antigen[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,85(15):5678.
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[10] Flanigan TP, King CH, Lett RR, et al. Induction of resistanc e to Schistosoma mansoni infection in mice by purified parasite paramyosin[ J]. J Clin Invest, 1989,83(3):1010-1014.
[11] Kasher MS, Wakulchik M, Cook JA, et al. One-step purification of re combinant human papillowavirus Type 16E7 oncoprotein and its binding to the reti noblastoma gene product[J]. Bio Techniques, 1993,14:630-641., 百拇医药
单位：周金春(湖南医科大学血吸虫病研究室 长沙 410078)；易新元(湖南医科大学血吸虫病研究室 长沙 410078)；Kalinna BH(The Queens land Institute of Medical Research Queensland 4029,Australia)；McManus DP(The Queens land Institute of Medical Research Queensland 4029,Australia)
关键词：日本血吸虫；副肌球蛋白；抗原纯化*；基因重组
湖南医科大学学报000204[摘要] 用基因重组技术，将日本血吸虫副肌球蛋白(rSj97 )基因亚克隆至表达载体pQE30上。在IPTG诱导下，重组日本血吸虫副肌球蛋白在大肠杆菌中 得以高效表达。通过快速蛋白质液相色谱仪(FPLC)，经TALON柱和离子交换柱两步分离纯化 ，获得大量高纯度的重组日本血吸虫副肌球蛋白，为水牛现场试验提供了充足的抗原。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R532.21 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5625(2000)02-0106-03
Expression and purification of recombinant
Schistosoma japoni cum paramyosin
ZHOU Jin-chun, YI Xin-yuan
(Department of Parasitology, Hunan Medical University Changsha 410078)
Kalinna BH, McManus DP
(The Queensland Institute of Medical Research Queensland 4029, Australia)
, 百拇医药
[Abstract] Paramyosin of Schistosoma japonicum was express ed at a high level in E.coli. The recombinant protein could be easily purifi ed f rom bacteria lysate by fast protein liquid chromatography(FPLC) on a TALON resin column, due to the protein being expressed with a tag of six histidine residue fused to the N-terminus. The protein was completely soluble and could be eluted under non-denaturing condition using imidazole . To eliminate imida zole and res idue of E.coli, the elution was further purified by ion-exchange chrom atography. The purified protein will be used in water buffaloes in the study on protective immunity against Schistosoma japonicum.
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[Key words] Schistosoma japonicum; paramyosin; antigen purification*; gene recombination
副肌球蛋白是存在于大多数无脊椎动物中的一种肌纤维蛋 白[1]。由于脊椎动物体内无此同源性蛋白不会引起自身免疫反应。因此认为这种 蛋白具有较好的疫苗潜能。血吸虫副肌球蛋白(Sm97和Sj97)已被公认为最有前途的疫苗候选 分子之一[2]。比较编码日本血吸虫不同株(大陆株、菲律宾株及日本株)副肌球蛋 白的核苷酸序列，发现仅有个别氨基酸的差异[3]。有研究表明血吸虫副肌球蛋白 与班氏丝虫[4]、蛔虫[5]及绦虫[6，7]等其它蠕虫的副肌球 蛋白在免疫学上有交叉反应性或基因上有高度同源性。因此，副肌球蛋白还可能成为抗多种 蠕虫的交叉免疫源。本室的合作伙伴，澳大利亚昆士兰医学研究所分子寄生虫学室已构建和 克隆出编码日本血吸虫副肌球蛋白(Sj97)全部开放阅读框架的cDNA，并已亚克隆至表达载体 pQE30。本文进一步报道利用FPLC对重组Sj97的纯化。
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1 材料与方法
1.1 阳性克隆菌 日本血吸虫副肌球蛋白基因(Pmy25)亚克隆至pQE30转染 的XL1-Blue菌株，由澳大利亚昆士兰医学研究所分子寄生虫学室提供。
1.2 表达 将含重组体的阳性菌接种于含氨苄青霉素(终浓度为100μg. ml-1)的LB培养液中，37℃震荡培养直至OD600达到0.7～0.9；加IPTG(终浓度为1 mM)诱导并继续培养4h。培养物在4℃以5000r.min-1离心15min，弃上清， 收集细菌沉淀。
1.3 纯化
1.3.1 TALON柱层析 将细菌沉淀以1∶5(W/V)的比例溶解于缓冲液A(50mM Tris HCl, pH8.0)中，置于冰与冷水中反复冻融3次，以20Hz超声粉碎15min，再在4℃以1 000r.min-1离心20min，将上清与平衡了的TALON树脂混合后置室温低速旋转振 摇30min，以1500r.min-1离心1min，将沉淀装入1cm直径的玻璃柱中，将 柱装在FPLC(快速蛋白质液相色谱)仪上。先用缓冲液A洗去大肠杆菌蛋白，再以缓冲液B(0. 5M的咪唑溶于缓冲液A中)洗脱重组蛋白，用自动收集仪，以0.5ml.min-1的流速 ，按每管1ml收集洗脱液。从峰值各管中取少量样本进行SDS-PAGE。
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1.3.2 离子交换柱层析 混合含有重组蛋白的数管洗脱液，在缓冲液A中 于4℃透析过夜，离心去沉渣，上清装入离子交换柱中，缓冲液A同上，缓冲液B为1M NaCl于 缓冲液A中，将柱与FPLC仪连接进行离子交换层析。首先流出的是咪唑和残余大肠杆菌蛋白 ，再以缓冲液B洗脱副肌球蛋白，收集峰值管。从峰值管中取少量样本进行SDS-PAG E，将含重组蛋白量高的各管混合，即为纯化的重组副肌球蛋白。
2 结 果
重组副肌球蛋白在非变性状态下完全溶解在提取液(50mM Tris-HCl pH8.0)中。通过FPLC ，用缓冲液B将rSj97自TALON柱上洗下，记录器描出一个单一的尖峰(图1)。从峰值管中 取微量样本进行微胶电泳结果(图2)显示，经TALON柱层析后获得的重组蛋白为部分纯化产品 。经离子交换柱层析(图3)后，即获得高纯度的rSj97(图4)。
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图1 rSj97经TALON柱亲和层析时从FPLC上描下的曲线
Fig.1 rSj97 purified by FPLC using T ALON resion
图2 SDS-PAGE显示TALON柱亲和层析纯化后的rSj97
Fig.2 SDS-PAGE showing purified rSj97 b y TALON affinity chromatographn
图3 rSj97经离子交换柱层析时从FPLC上描下的曲线
Fig.3 rSj97 purified by FPLC using a n ion-exchange colum
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图4 SDS-PAGE显示经离子交换柱层析纯化后的 rSj97
Fig.4 SDS-PAGE showing purified rSj97 b y ion-exchange chromatography
3 讨 论
已有不少关于纯化血吸虫天然副肌球蛋白的报道，包括用盐析的生化纯化[8]，用 抗副肌球蛋白的单克隆抗体进行的免疫亲和层析[9]及SDS-PAGE凝胶电泳分离纯 化[10]等。随着分子生物学技术的渗透，对这一疫苗分子的研究也越来越深入。 1986年，由Lanar[8]首先克隆了编码约一半曼氏血吸虫副肌球蛋白分子(Sm97)的c DNA，随后Laclette等[7]获得了编码Sm97全长cDNA序列。编码日本血吸虫副肌球 蛋白(Sj97)的全部核苷酸序列首先由McManus[3]实验室获得，并已亚克隆至高效 表达载体pQE30上。
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pQE是一种原核生物表达载体，被广泛应用于重组蛋白的表达和纯化。它的基本原理是利用 表达载体上的6个组氨酸残端与固态的金属亲和层析树脂(immobilized metal affinity chr omatography, IMAC)有高度亲和力；重组蛋白可在变性或非变性状态下被纯化，即使被纯化 的重组蛋白含量很低也能被有效地纯化出来。由于与树脂的结合是可逆的，故被纯化的蛋白 可在极温和的条件下被洗脱。树脂的稳定性好，可反复使用多次，成本低。TALON是一种非 镍的IMAC树脂，比镍类树脂更优越，如镍类树脂有与不含6个组氨酸残端的宿主蛋白结合的 倾向[11]，而TALON比镍类树脂对含6个组氨酸残端的蛋白结合力低。因此，TALO N明显降低了与杂蛋白的结合力，可省略洗脱重组蛋白之前的烦琐洗涤过程；而且它比镍类 树脂洗脱重组蛋白的条件更温和，对保持重组蛋白的自然状态和完整性更有利。本研究采用 TALON树脂通过FPLC对重组日本血吸虫副肌球蛋白进行纯化获得大量纯化的rSj97，并已在水 牛的现场试验中取得很好的保护性效果(另文报道)。
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参考文献：
[1] Kagawa H, Gnegyo K, Mclachlan AD, et al. Paramyosin gene(unc-15) of caenorhabditie elegans: molecular cloning, nuclotide sequence an d models for thick filament structure[J]. J Mol Bio, 1989,207:311-333.
[2] Waine GJ, McManus DP. Schistosomiasis vaccine development-the current pi cture[J]. Bioessays, 1997,18(5):435-443.
[3] Becker MM, Kalinna BH, Yang W, et al. Gene cloning and complete nucle otide sequence of philippine Schistosoma japonicum paramyosin[J]. Acta Tro pica, 1995,59:143-147.
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[4] Nanduri J, Kazura JW. Paramyosin-enhanced of Brugia malayi microfila ria in mice[J]. J Immunol, 1989,143(19):3359-3363.
[5] Wisnewski AV, Kresina TF. Induction of protective immunity to schistosomi asis with immunologically cross-reactive lumbricus molecules[J]. Int J Parasi tol, 1995,25(4):503-510.
[6] Kalinna B, McManus DP. An IgG(Fc gamma)-binding protein of Taeniacrassic eps(cestoda) exhibits sequence homology and antigenic similarity with shistosome paramyosin[J]. Parasitology, 1993,106:289-296.
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[7] Laclette JP, Landa A, Arcos L, et al. Paramyosin is the Sm(trematoda) homolgue of antigen B from Taenia solium(cestoda)[J]. Mol Biochem Parasit ol, 1991,44(2):287-295.
[8] Lanar DE, Pearce EJ, James SL, et al. Identifications of paramyosin a s schistosome antigen recognized by intradermally vaccinated mice[J]. Science, 1986,234:593-596.
[9] Pearce EJ, James SL, Hieny S, et al. Induction of protective immunity against Schistosoma mansoni by vaccination with schistosome paramyosin(Sm97 ), a non-surface parasite antigen[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,85(15):5678.
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[10] Flanigan TP, King CH, Lett RR, et al. Induction of resistanc e to Schistosoma mansoni infection in mice by purified parasite paramyosin[ J]. J Clin Invest, 1989,83(3):1010-1014.
[11] Kasher MS, Wakulchik M, Cook JA, et al. One-step purification of re combinant human papillowavirus Type 16E7 oncoprotein and its binding to the reti noblastoma gene product[J]. Bio Techniques, 1993,14:630-641., 百拇医药