X线对培养脊髓神经元生存能力的影响
作者：白希壮 何维为 王星铎 原银栋
单位：白希壮(中国医科大学第一临床学院骨科，沈阳 110001)；王星铎(中国医科大学第一临床学院骨科，沈阳 110001)；原银栋(中国医科大学第一临床学院骨科，沈阳 110001)；何维为(中国医科大学脑研究所神经解剖研究室)
关键词：神经元；体外；射线
中国医科大学学报000211 摘要 目的：观察射线对神经元存活能力的影响。方法：应用大鼠E18脊髓细胞，在培养第2天进行4 Gy X线定量照射。结果：培养1、2、3、4周时，神经元分别占生存细胞的89.31%、96.78%、80.42%、46.42%，明显高于对照组。结论：该方法能获得较大数量的存活神经元细胞，可以增加对神经元研究观察的时间跨度，明显优越于细胞毒性药物加入培养基中的方法。
The Effect of X-irradiation on the Survival Ability of Cultured Spinal Cord Neurons
, http://www.100md.com
Bai Xizhuang, He Weiwei, Wang Xingduo, Yuan Yindong
(Department of Orthopaedic Surgery, The First Clinical College, China Medical University, Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:To observe the effect of X-irradiation on cultured spinal cord neurons. Methods：X-irradiation of 4 Gy dose were given to E18 spinal cord cell on the 2 nd day of culture. Results:The rates of survive neuron were 89.31% (1 week)、96.78%(2 week)、80.42% (3 week)、46.42% (4 week), which were much higher than those of the control. Conclusion: This method can increased the survival cells and the time astride of observing and studying neurons, which is much better than the method of cytotoxic drugs and worth using in culturing neurons.
, 百拇医药
KEY WORDS neuron; radiation; in vitro
体外神经细胞培养大量地被应用于神经细胞分化的研究中，目前认为原代的细胞培养物更接近体内神经细胞的正常发育状态，实验多选择分化潜能较大的胚胎及新生动物的脑组织，而对脊髓神经细胞的培养报道较少[1，2]。本实验应用孕18 d(E18)大鼠胚胎脊髓细胞，在培养第48 h时进行4 Gy定量照射，观察射线对神经元的生长及发育的影响。
1 材料与方法
无菌操作下，取(E18)大鼠胚胎，在显微镜下取胚胎脊髓并剥离脊膜和血管。将脊髓在无Ca2+、Mg2+的Hank液(CMT-Hank液)中剪碎，室温下静置10 min，在37℃水浴箱中用0.25%的胰蛋白酶(Sigma产品，活力1∶500，CMT-Hank液配制)消化30 min，然后加入少许含小牛血清培养液的DMEM，用吸管稍加吹打至胰酶液与培养液混匀，离心20 min(1 000 r/min)。用20%小牛血清培养液中止胰酶的消化作用，用孔径为75 μm的不锈钢网滤过，将滤过液稀释成5×105～10×105浓度的细胞悬液，而后将1 ml细胞悬液接种在6孔 培 养 板上，培养板上预先放入盖玻片，并在表面涂上多聚赖氨酸以增加细胞的贴壁能力。将接种的培养皿置CO2培养箱中，温度37℃，CO2浓度5%，湿度95%。在培养至48 h时对培养的细胞进行照射，照射剂量为4 Gy。之后继续培养，在3 d、1 W、2 W、3 W、4 W观察、计算神经元和背景细胞数量改变。
, http://www.100md.com
2 结果
根据上述实验筛选照射时机和剂量，在培养2 d时对培养的脊髓细胞进行照射，剂量为4 Gy。观察发现，在不同时间实验组和对照组中神经元和背景细胞在数量上变化很大，见表1及图1、2。
表1 X-射线对培养脊髓神经元生存能力
影响(
±s，n=10)
Table 1 The X-irradiation effect on survival abilityof
culture spinal cord neuon (±s，n=10) 培养
, 百拇医药
时间
对照组
实验组
neuron
shadow
N%
neuron
shadow
N%
3 d
2405±171
459±63
83.96
, http://www.100md.com
2371±154
589±18
80.15
1 W
1678±191
1705±171
49.59
2643±150
316±12
89.31
2 W
1237±118
, http://www.100md.com
2322±114
34.75
2829±199
94±6
96.78
3 W
276±22
3428±156
7.45
2007±139
488±16
80.42
, 百拇医药 4 W
87±8
3074±181
2.83
1642±127
1890±163
46.42
图1 对照组背景细胞贴壁能力强，相互聚集，神经元发育差，胞体小，突起生长少(2周，×200)
Figure 1 There are a lot of shadow cells with strong adhesive and assemble ability in control group,but the neurons are small with a few of protruds in the same group(2 week,×200)
, 百拇医药
图2 实验组神经元突起逐渐形成网络结构，借突起相互联系(2周，×100)
Figure 2 The protruding of neuron cells are becoming net works, with it the
neuron communicate each other in experimental group (2 week,×200)
3 讨论
以往研究表明，将5-Fu和阿糖胞苷加入大脑神经细胞的培养液中，结果证明背景细胞在第1培养周内最为敏感，之后则有所下降，神经元的存活率在第2周时也是最高(92%)[3]，与本实验结果第2周时的最高值相近。Weiper重复上述实验证明，神经元由于不能在2周后维持较高的生存率，神经元的分化和轴突生长也相应受到抑制。采用射线照射，能对胶质细胞等背景细胞有较长时间的抑制作用，从而能促进神经元的生存、分化及生长。放射介入的脊髓神经细胞培养方法的建立，对基础研究和临床应用研究的重要价值在于，该方法能获得较大数量的存活神经元细胞，可以增加对神经组织研究观察的时间和某些药物实验介入的时间跨度，同时可以探讨非神经细胞对神经元生长和发育的直接和间接作用，这种方法明显优越于细胞毒性药物加入培养基中的方法，值得在神经细胞培养中加以推广。
, 百拇医药
参考文献
1，Ranson BR, Ardevon S, Tomas K, et al. Mouse spine cord in cell culture. I. Morphology and intrinsic neuronal electrophysiologic properties. J Neurophysiol, 1977,40(5):1132-1137
2，Cohen J, Mardin LI, Wander J, et al. Seperation of cell types from the developing cerebellum. Brain Res, 1988,149(8):279-288
3，Boivencent, Zhenner MN, Fudin GS, et al. Activation of the action 5-Fu, Ara C potential neurotoxins: an allosteric model. J Biol Chem, 1991,462:509-514
(1999-03-30收稿), 百拇医药
单位：白希壮(中国医科大学第一临床学院骨科，沈阳 110001)；王星铎(中国医科大学第一临床学院骨科，沈阳 110001)；原银栋(中国医科大学第一临床学院骨科，沈阳 110001)；何维为(中国医科大学脑研究所神经解剖研究室)
关键词：神经元；体外；射线
中国医科大学学报000211 摘要 目的：观察射线对神经元存活能力的影响。方法：应用大鼠E18脊髓细胞，在培养第2天进行4 Gy X线定量照射。结果：培养1、2、3、4周时，神经元分别占生存细胞的89.31%、96.78%、80.42%、46.42%，明显高于对照组。结论：该方法能获得较大数量的存活神经元细胞，可以增加对神经元研究观察的时间跨度，明显优越于细胞毒性药物加入培养基中的方法。
The Effect of X-irradiation on the Survival Ability of Cultured Spinal Cord Neurons
, http://www.100md.com
Bai Xizhuang, He Weiwei, Wang Xingduo, Yuan Yindong
(Department of Orthopaedic Surgery, The First Clinical College, China Medical University, Shenyang,110001)
ABSTRACT Objective:To observe the effect of X-irradiation on cultured spinal cord neurons. Methods：X-irradiation of 4 Gy dose were given to E18 spinal cord cell on the 2 nd day of culture. Results:The rates of survive neuron were 89.31% (1 week)、96.78%(2 week)、80.42% (3 week)、46.42% (4 week), which were much higher than those of the control. Conclusion: This method can increased the survival cells and the time astride of observing and studying neurons, which is much better than the method of cytotoxic drugs and worth using in culturing neurons.
, 百拇医药
KEY WORDS neuron; radiation; in vitro
体外神经细胞培养大量地被应用于神经细胞分化的研究中，目前认为原代的细胞培养物更接近体内神经细胞的正常发育状态，实验多选择分化潜能较大的胚胎及新生动物的脑组织，而对脊髓神经细胞的培养报道较少[1，2]。本实验应用孕18 d(E18)大鼠胚胎脊髓细胞，在培养第48 h时进行4 Gy定量照射，观察射线对神经元的生长及发育的影响。
1 材料与方法
无菌操作下，取(E18)大鼠胚胎，在显微镜下取胚胎脊髓并剥离脊膜和血管。将脊髓在无Ca2+、Mg2+的Hank液(CMT-Hank液)中剪碎，室温下静置10 min，在37℃水浴箱中用0.25%的胰蛋白酶(Sigma产品，活力1∶500，CMT-Hank液配制)消化30 min，然后加入少许含小牛血清培养液的DMEM，用吸管稍加吹打至胰酶液与培养液混匀，离心20 min(1 000 r/min)。用20%小牛血清培养液中止胰酶的消化作用，用孔径为75 μm的不锈钢网滤过，将滤过液稀释成5×105～10×105浓度的细胞悬液，而后将1 ml细胞悬液接种在6孔 培 养 板上，培养板上预先放入盖玻片，并在表面涂上多聚赖氨酸以增加细胞的贴壁能力。将接种的培养皿置CO2培养箱中，温度37℃，CO2浓度5%，湿度95%。在培养至48 h时对培养的细胞进行照射，照射剂量为4 Gy。之后继续培养，在3 d、1 W、2 W、3 W、4 W观察、计算神经元和背景细胞数量改变。
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2 结果
根据上述实验筛选照射时机和剂量，在培养2 d时对培养的脊髓细胞进行照射，剂量为4 Gy。观察发现，在不同时间实验组和对照组中神经元和背景细胞在数量上变化很大，见表1及图1、2。
表1 X-射线对培养脊髓神经元生存能力
影响(
±s，n=10)Table 1 The X-irradiation effect on survival abilityof
culture spinal cord neuon (
±s，n=10) 培养, 百拇医药
时间
对照组
实验组
neuron
shadow
N%
neuron
shadow
N%
3 d
2405±171
459±63
83.96
, http://www.100md.com
2371±154
589±18
80.15
1 W
1678±191
1705±171
49.59
2643±150
316±12
89.31
2 W
1237±118
, http://www.100md.com
2322±114
34.75
2829±199
94±6
96.78
3 W
276±22
3428±156
7.45
2007±139
488±16
80.42
, 百拇医药 4 W
87±8
3074±181
2.83
1642±127
1890±163
46.42
图1 对照组背景细胞贴壁能力强，相互聚集，神经元发育差，胞体小，突起生长少(2周，×200)
Figure 1 There are a lot of shadow cells with strong adhesive and assemble ability in control group,but the neurons are small with a few of protruds in the same group(2 week,×200)
, 百拇医药
图2 实验组神经元突起逐渐形成网络结构，借突起相互联系(2周，×100)
Figure 2 The protruding of neuron cells are becoming net works, with it the
neuron communicate each other in experimental group (2 week,×200)
3 讨论
以往研究表明，将5-Fu和阿糖胞苷加入大脑神经细胞的培养液中，结果证明背景细胞在第1培养周内最为敏感，之后则有所下降，神经元的存活率在第2周时也是最高(92%)[3]，与本实验结果第2周时的最高值相近。Weiper重复上述实验证明，神经元由于不能在2周后维持较高的生存率，神经元的分化和轴突生长也相应受到抑制。采用射线照射，能对胶质细胞等背景细胞有较长时间的抑制作用，从而能促进神经元的生存、分化及生长。放射介入的脊髓神经细胞培养方法的建立，对基础研究和临床应用研究的重要价值在于，该方法能获得较大数量的存活神经元细胞，可以增加对神经组织研究观察的时间和某些药物实验介入的时间跨度，同时可以探讨非神经细胞对神经元生长和发育的直接和间接作用，这种方法明显优越于细胞毒性药物加入培养基中的方法，值得在神经细胞培养中加以推广。
, 百拇医药
参考文献
1，Ranson BR, Ardevon S, Tomas K, et al. Mouse spine cord in cell culture. I. Morphology and intrinsic neuronal electrophysiologic properties. J Neurophysiol, 1977,40(5):1132-1137
2，Cohen J, Mardin LI, Wander J, et al. Seperation of cell types from the developing cerebellum. Brain Res, 1988,149(8):279-288
3，Boivencent, Zhenner MN, Fudin GS, et al. Activation of the action 5-Fu, Ara C potential neurotoxins: an allosteric model. J Biol Chem, 1991,462:509-514
(1999-03-30收稿), 百拇医药