实验性动脉内膜损伤后抑制血管平滑肌细胞增生的研究
作者：刘闺男 刘利 齐国先 曾定尹
单位：刘闺男(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)；刘利(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)；齐国先(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)；曾定尹(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)
关键词：c-myc反义RNA；血管平滑肌细胞；动脉粥样硬化；血管再狭窄
中国医科大学学报000206 摘要 目的：观察血管内膜损伤后c-myc反义RNA在抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增生、迁移及防止动脉粥样硬化形成和血管再狭窄中的作用。方法：选雄性日本大白兔36只，经球囊造成腹主动脉内膜损伤的同时，局部给予c-myc反义RNA 、正义RNA及盐水，高胆固醇喂养12周处死。测量内膜厚度，计数增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数。结果：盐水及正义RNA对照组动脉内膜明显增厚(317 μm )，PCNA阳性细胞数明显增多(62%)，可见明显的粥样斑块灶形成。而反义RNA治疗组内膜增厚度为217 μm ，PCNA阳性细胞为30.5%，明显低于对照组(P<0.01)。结论：c-myc反义RNA具有显著抑制VSMC增生，减轻粥样斑块形成的作用。
, 百拇医药
The Effect of Inhibiting the Proliferation of Vascular Smooth
Muscle Cells after Injury of Arterial Intima
Liu Guinan, Liu Li, Qi Guoxian, Zeng Dingyin
(Department of Circulation, The First Clinical College,China Medical University,Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:To observe the effect of c-myc antisense RNA on inhibiting the proliferation and migration of vasculer smooth muscle cell(VSMC) after vascular intima was injured. Methods: The abdominal aorta intima of 36 male Japanese white rabbits in three groups was injured by balloon sac at the same time.The c-myc antisense RNA, sense RNA(1 mg per rabbit) and saline were injected into the blood of the rabbits in three groups. The rabbits were fed with hypercholesterol food and killed in 12 weeks. The abdominal aorta were cut into 4 μm thick paraffin sections and stained for PCNA by s-p immunohistochemistry. The thickness of the intima was measured by image analysis. Results:In the control groups of sense RNA and saline, the intima became thick significantly(317 μm), the formation of atherosclerotic plague was obvious and the number of PCNA positive cells in the intima and the media significantly increased(62%). But in the antisense RNA group, the thickness of the intima is only 217 μm and the number of PCNA positive cells were significantly lower than that of the control group (30.5%, P<0.01). Conclusion:c-myc antisense RNA could significantly inhibit the proliferation of VSMC and attenuate the formation of atherosclerotic plague.
, 百拇医药
KEY WORDS c-myc antisense RNA; smooth muscle cell; vascular restenosis; atherosclerosis
人类在治疗血管再狭窄与闭塞领域里已取得了长足的进步，特别是经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)、内膜切除、自体、异体乃至人工血管移植术等成功地挽救了众多患者的生命。但血管成形术后常常出现血管再狭窄，严重影响了上述术式的中晚期疗效[1]。
近年来随着分子生物学技术的发展，人们认识到许多生长因子参与调控血管平滑肌细胞(SMC)的增殖、迁移，导致血管内膜增厚造成狭窄和再狭窄，而与生长因子密切相关的某些原癌基因——早期应答基因可能是SMC增殖的始动环节[2,3]。
反义RNA是能特异地抑制某种基因表达的RNA。人工构建的反义RNA作为一种抑制特定基因表达的工具，已被应用于基础医学研究以及恶性肿瘤的治疗[4]。本研究模仿动脉粥样硬化形成及PTCA，造成动物血管内膜损伤后，局部血管内注入c-myc的反义RNA，观察其在防止动脉粥样硬化形成及血管再狭窄中的作用。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性纯种日本大白兔36只，4月龄，体重1.4～2.0 kg。随机分为空白对照组(6只)和实验组(30只)。前者喂普通颗粒饲料，后者喂高胆固醇饲料，剂量为每日1.5 g/kg。实验组又分为反义寡核苷酸治疗组、正义寡核苷酸对照及盐水对照组，每组各10只。喂养12周后处死，取腹主动脉，制成4 μm石蜡切片备用。
1.2 建立血管损伤模型 实验组所有动物均在846合剂(0.5 mg/kg)肌注麻醉后，暴露股动脉，穿刺血管，导入3.5 mm型球囊至腹主动脉。球囊扩张压力为607.95 kPa，仿PTCA造成动脉内膜损伤，损伤范围约40～50 mm，术后给予青霉素80万单位肌注。
1.3 试剂 寡核苷酸为c-myc原癌基因第二外显子转录的mRNA起始部位的反义和正义序列，为人工合成的含15个碱基的寡核苷酸，购于中科院上海细胞研究所。在行血管损伤时经球囊管微孔一次性给予，剂量为每支血管1 mg。Actin-(1A4)、PCNA(PC-10)、CD34鼠源性单克隆抗体及S-P试剂盒均购于福州迈新公司。
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1.4 染色方法及观察指标 进行HE、弹力纤维及S-P法免疫染色。PCNA需经高压锅抗原修复。选增厚最明显的动脉内膜部位，在LUZX型图像分析系统下测量厚度(μm)，计数内膜最明显处200个细胞PCNA核阳性细胞百分数，统计结果经t检验。
2 结果
2.1 动脉壁狭窄程度 HE切片观察见各实验组的动脉受损部位已完全内皮化，动脉壁呈不规则增厚，管腔狭窄，常以一侧壁增厚明显。其中盐水及正义寡核苷酸对照组动脉厚度及内膜厚度明显增大，且可见明显的粥样斑块灶形成。内皮细胞也明显增生，密度增大，有的呈立方形。而反义寡核苷酸治疗组却增厚不明显，内皮细胞虽有增生但大都呈扁平状，细胞密度较小，内膜内虽有小灶状或散在胞浆空亮的泡沫状细胞，但无典型的粥样斑块形成。免疫组化染色证明，内膜内大量增生的细胞胞浆呈Actin阳性，而内皮细胞呈CD34阳性。各组动脉厚度及内膜厚度检测结果见表1。
表1 各组动脉壁及内膜厚度图像分析测量结果
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Table 1 The thickness of abdominal aorta and intima measured by image analysis 组 别
n
动脉壁厚/内膜厚(μm,
±s)
1 空白对照
6
342.33±12.55/208.33± 7.73
2 盐水对照
10
546.40±14.97/317.70± 9.50
, 百拇医药
3 反义治疗
10
350.30±18.72/217.20± 8.23
4 正义对照
10
556.20±16.40/317.20±10.72
注：1与3比较P>0.05；2与3比较P<0.01；
3与4比较P<0.01；4与2比较P>0.05
2.2 PCNA阳性细胞观察 PCNA阳性定位于细胞核，呈褐色颗粒状。空白对照组阳性细胞数极少，偶见内皮或内膜内出现单个散在的阳性细胞核。盐水及正义对照组阳性细胞数都明显增多，主要分布在内膜及中膜，其内皮细胞也多呈阳性反应。反义治疗组PCNA阳性细胞数却明显少于对照组，计数结果见表2。
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表2 各组PCNA阳性细胞数计数结果
Table 2 The results of PCNA positive cells in groups 组 别
n
PCNA(+)细胞数(%)
1 空白对照
6
2.0± 1.6
2 盐水对照
10
62.5± 9.1
3 正义对照
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10
63.8±12.4
4 反义治疗
10
30.5± 7.9
注：1与2比较P<0.01；2与4比较P<0.01；
3与2比较P>0.05；4与3比较P<0.01
3 讨论
血管狭窄(包括动脉粥样硬化)和再狭窄的机制复杂，最终结果都是动脉SMC过度增生、迁移并分泌大量的细胞外基质而使内膜增厚。本研究中盐水对照及正义寡核苷酸对照组的动脉内膜明显增厚，而内膜增生的细胞绝大数为Actin阳性细胞也说明了这一点。如果仅有脂质的沉积而无SMC的增生、迁移和分泌，就不会形成典型的粥样斑块或病变程度明显降低。反义治疗组，其动脉增厚不明显，PCNA阳性细胞数显著下降，内膜内仅有小灶状泡沫细胞团。这是由于c-myc反义RNA封闭了c-myc蛋白的表达，使SMC增生和迁移较少，转变成泡沫状细胞也减少所致。这与Bennett所得结论是一致的[4]。因此抑制SMC的增生和迁移是防止动脉粥样硬化形成以及PTCA和血管移植术后等出现的血管再狭窄的重要步骤。
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抑制动脉壁SMC的增殖和迁移，近年来开展了大量的研究，其中局部给予血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的单克隆抗体以中和刺激、诱导SMC增生和迁移的PDGF或bFGF生长因子收到了一定效果。但动脉内膜增生是一个多因素参与的复杂的过程，受诸多由自泌和旁泌的细胞因子调控，而细胞生长因子的表达又受与生长相关的基因控制，早期应答基因c-myc，c-jun,c-fos可能都参与了这一过程[5]。c-myc是编码439个氨基酸残基蛋白质的原癌基因，其表达的c-myc蛋白与DNA结合后激活增殖基因，引起细胞的增殖。在损伤等始动因素作用下，c-myc基因出现扩增，转录的mRNA和翻译的蛋白质就会大量增加，不断地激活增殖基因使细胞过度增殖。反义RNA可以特异地与靶细胞基因所编码的mRNA结合，抑制靶RNA的转录和翻译，达到抑制生长的目的。本研究应用c-myc反义RNA进行封闭后，无论是动脉壁、内膜厚度，还是PCNA阳性细胞数都明显低于对照组，达到了显著抑制SMC增生的作用，明显地减轻了粥样斑块病变的程度，因此是防止动脉粥样硬化及血管再狭窄的理想手段。
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用反义RNA封闭与生长有关的靶基因具有专一性强，作用范围广，设计制备简单，人为可控性好及安全性高等优点。但SMC增生是受多种基因调控的，反义RNA尚不能完全抑制其增生。
参考文献
1，Badimon L, Alfon J, Royo T, et al. Cell biology of restenosis post-angioplasty. Z Kardiol, 1995, 84(4):149—156
2，Ruef J, Hu ZY, Yin LY, et al. Induction of vascular endothelial growth factor in ballon-injured baboon arteries. Circ Res， 1997, 81(1):24-33
3，Del Rio M,Ruiz E, Tejerina T. Action of elgodiapine on atherosclerosis development, cell growth, and oncogene expression in vascular smooth muscle cells. Gen pharmacol， 1997, 28(3):468—474
, 百拇医药
4，Bennett MR,Anglin S,McEwan JR, et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in viva by c-myc antisense oligodeoxynuc-leotides. J Clin Invest， 1994, 93(2):828—833
5，Bauriedel G,Kandolf R, Welsch U,et al.Mechanism of restenosis after angioplasty. Z Kardiol， 1994, 83(4):31-41
(1999-02-25收稿), http://www.100md.com
单位：刘闺男(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)；刘利(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)；齐国先(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)；曾定尹(中国医科大学第一临床学院循环内科，沈阳 110001)
关键词：c-myc反义RNA；血管平滑肌细胞；动脉粥样硬化；血管再狭窄
中国医科大学学报000206 摘要 目的：观察血管内膜损伤后c-myc反义RNA在抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增生、迁移及防止动脉粥样硬化形成和血管再狭窄中的作用。方法：选雄性日本大白兔36只，经球囊造成腹主动脉内膜损伤的同时，局部给予c-myc反义RNA 、正义RNA及盐水，高胆固醇喂养12周处死。测量内膜厚度，计数增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数。结果：盐水及正义RNA对照组动脉内膜明显增厚(317 μm )，PCNA阳性细胞数明显增多(62%)，可见明显的粥样斑块灶形成。而反义RNA治疗组内膜增厚度为217 μm ，PCNA阳性细胞为30.5%，明显低于对照组(P<0.01)。结论：c-myc反义RNA具有显著抑制VSMC增生，减轻粥样斑块形成的作用。
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The Effect of Inhibiting the Proliferation of Vascular Smooth
Muscle Cells after Injury of Arterial Intima
Liu Guinan, Liu Li, Qi Guoxian, Zeng Dingyin
(Department of Circulation, The First Clinical College,China Medical University,Shenyang，110001)
ABSTRACT Objective:To observe the effect of c-myc antisense RNA on inhibiting the proliferation and migration of vasculer smooth muscle cell(VSMC) after vascular intima was injured. Methods: The abdominal aorta intima of 36 male Japanese white rabbits in three groups was injured by balloon sac at the same time.The c-myc antisense RNA, sense RNA(1 mg per rabbit) and saline were injected into the blood of the rabbits in three groups. The rabbits were fed with hypercholesterol food and killed in 12 weeks. The abdominal aorta were cut into 4 μm thick paraffin sections and stained for PCNA by s-p immunohistochemistry. The thickness of the intima was measured by image analysis. Results:In the control groups of sense RNA and saline, the intima became thick significantly(317 μm), the formation of atherosclerotic plague was obvious and the number of PCNA positive cells in the intima and the media significantly increased(62%). But in the antisense RNA group, the thickness of the intima is only 217 μm and the number of PCNA positive cells were significantly lower than that of the control group (30.5%, P<0.01). Conclusion:c-myc antisense RNA could significantly inhibit the proliferation of VSMC and attenuate the formation of atherosclerotic plague.
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KEY WORDS c-myc antisense RNA; smooth muscle cell; vascular restenosis; atherosclerosis
人类在治疗血管再狭窄与闭塞领域里已取得了长足的进步，特别是经皮经腔冠状动脉成形术(PTCA)、内膜切除、自体、异体乃至人工血管移植术等成功地挽救了众多患者的生命。但血管成形术后常常出现血管再狭窄，严重影响了上述术式的中晚期疗效[1]。
近年来随着分子生物学技术的发展，人们认识到许多生长因子参与调控血管平滑肌细胞(SMC)的增殖、迁移，导致血管内膜增厚造成狭窄和再狭窄，而与生长因子密切相关的某些原癌基因——早期应答基因可能是SMC增殖的始动环节[2,3]。
反义RNA是能特异地抑制某种基因表达的RNA。人工构建的反义RNA作为一种抑制特定基因表达的工具，已被应用于基础医学研究以及恶性肿瘤的治疗[4]。本研究模仿动脉粥样硬化形成及PTCA，造成动物血管内膜损伤后，局部血管内注入c-myc的反义RNA，观察其在防止动脉粥样硬化形成及血管再狭窄中的作用。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性纯种日本大白兔36只，4月龄，体重1.4～2.0 kg。随机分为空白对照组(6只)和实验组(30只)。前者喂普通颗粒饲料，后者喂高胆固醇饲料，剂量为每日1.5 g/kg。实验组又分为反义寡核苷酸治疗组、正义寡核苷酸对照及盐水对照组，每组各10只。喂养12周后处死，取腹主动脉，制成4 μm石蜡切片备用。
1.2 建立血管损伤模型 实验组所有动物均在846合剂(0.5 mg/kg)肌注麻醉后，暴露股动脉，穿刺血管，导入3.5 mm型球囊至腹主动脉。球囊扩张压力为607.95 kPa，仿PTCA造成动脉内膜损伤，损伤范围约40～50 mm，术后给予青霉素80万单位肌注。
1.3 试剂 寡核苷酸为c-myc原癌基因第二外显子转录的mRNA起始部位的反义和正义序列，为人工合成的含15个碱基的寡核苷酸，购于中科院上海细胞研究所。在行血管损伤时经球囊管微孔一次性给予，剂量为每支血管1 mg。Actin-(1A4)、PCNA(PC-10)、CD34鼠源性单克隆抗体及S-P试剂盒均购于福州迈新公司。
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1.4 染色方法及观察指标 进行HE、弹力纤维及S-P法免疫染色。PCNA需经高压锅抗原修复。选增厚最明显的动脉内膜部位，在LUZX型图像分析系统下测量厚度(μm)，计数内膜最明显处200个细胞PCNA核阳性细胞百分数，统计结果经t检验。
2 结果
2.1 动脉壁狭窄程度 HE切片观察见各实验组的动脉受损部位已完全内皮化，动脉壁呈不规则增厚，管腔狭窄，常以一侧壁增厚明显。其中盐水及正义寡核苷酸对照组动脉厚度及内膜厚度明显增大，且可见明显的粥样斑块灶形成。内皮细胞也明显增生，密度增大，有的呈立方形。而反义寡核苷酸治疗组却增厚不明显，内皮细胞虽有增生但大都呈扁平状，细胞密度较小，内膜内虽有小灶状或散在胞浆空亮的泡沫状细胞，但无典型的粥样斑块形成。免疫组化染色证明，内膜内大量增生的细胞胞浆呈Actin阳性，而内皮细胞呈CD34阳性。各组动脉厚度及内膜厚度检测结果见表1。
表1 各组动脉壁及内膜厚度图像分析测量结果
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Table 1 The thickness of abdominal aorta and intima measured by image analysis 组 别
n
动脉壁厚/内膜厚(μm,
±s)1 空白对照
6
342.33±12.55/208.33± 7.73
2 盐水对照
10
546.40±14.97/317.70± 9.50
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3 反义治疗
10
350.30±18.72/217.20± 8.23
4 正义对照
10
556.20±16.40/317.20±10.72
注：1与3比较P>0.05；2与3比较P<0.01；
3与4比较P<0.01；4与2比较P>0.05
2.2 PCNA阳性细胞观察 PCNA阳性定位于细胞核，呈褐色颗粒状。空白对照组阳性细胞数极少，偶见内皮或内膜内出现单个散在的阳性细胞核。盐水及正义对照组阳性细胞数都明显增多，主要分布在内膜及中膜，其内皮细胞也多呈阳性反应。反义治疗组PCNA阳性细胞数却明显少于对照组，计数结果见表2。
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表2 各组PCNA阳性细胞数计数结果
Table 2 The results of PCNA positive cells in groups 组 别
n
PCNA(+)细胞数(%)
1 空白对照
6
2.0± 1.6
2 盐水对照
10
62.5± 9.1
3 正义对照
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63.8±12.4
4 反义治疗
10
30.5± 7.9
注：1与2比较P<0.01；2与4比较P<0.01；
3与2比较P>0.05；4与3比较P<0.01
3 讨论
血管狭窄(包括动脉粥样硬化)和再狭窄的机制复杂，最终结果都是动脉SMC过度增生、迁移并分泌大量的细胞外基质而使内膜增厚。本研究中盐水对照及正义寡核苷酸对照组的动脉内膜明显增厚，而内膜增生的细胞绝大数为Actin阳性细胞也说明了这一点。如果仅有脂质的沉积而无SMC的增生、迁移和分泌，就不会形成典型的粥样斑块或病变程度明显降低。反义治疗组，其动脉增厚不明显，PCNA阳性细胞数显著下降，内膜内仅有小灶状泡沫细胞团。这是由于c-myc反义RNA封闭了c-myc蛋白的表达，使SMC增生和迁移较少，转变成泡沫状细胞也减少所致。这与Bennett所得结论是一致的[4]。因此抑制SMC的增生和迁移是防止动脉粥样硬化形成以及PTCA和血管移植术后等出现的血管再狭窄的重要步骤。
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抑制动脉壁SMC的增殖和迁移，近年来开展了大量的研究，其中局部给予血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的单克隆抗体以中和刺激、诱导SMC增生和迁移的PDGF或bFGF生长因子收到了一定效果。但动脉内膜增生是一个多因素参与的复杂的过程，受诸多由自泌和旁泌的细胞因子调控，而细胞生长因子的表达又受与生长相关的基因控制，早期应答基因c-myc，c-jun,c-fos可能都参与了这一过程[5]。c-myc是编码439个氨基酸残基蛋白质的原癌基因，其表达的c-myc蛋白与DNA结合后激活增殖基因，引起细胞的增殖。在损伤等始动因素作用下，c-myc基因出现扩增，转录的mRNA和翻译的蛋白质就会大量增加，不断地激活增殖基因使细胞过度增殖。反义RNA可以特异地与靶细胞基因所编码的mRNA结合，抑制靶RNA的转录和翻译，达到抑制生长的目的。本研究应用c-myc反义RNA进行封闭后，无论是动脉壁、内膜厚度，还是PCNA阳性细胞数都明显低于对照组，达到了显著抑制SMC增生的作用，明显地减轻了粥样斑块病变的程度，因此是防止动脉粥样硬化及血管再狭窄的理想手段。
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用反义RNA封闭与生长有关的靶基因具有专一性强，作用范围广，设计制备简单，人为可控性好及安全性高等优点。但SMC增生是受多种基因调控的，反义RNA尚不能完全抑制其增生。
参考文献
1，Badimon L, Alfon J, Royo T, et al. Cell biology of restenosis post-angioplasty. Z Kardiol, 1995, 84(4):149—156
2，Ruef J, Hu ZY, Yin LY, et al. Induction of vascular endothelial growth factor in ballon-injured baboon arteries. Circ Res， 1997, 81(1):24-33
3，Del Rio M,Ruiz E, Tejerina T. Action of elgodiapine on atherosclerosis development, cell growth, and oncogene expression in vascular smooth muscle cells. Gen pharmacol， 1997, 28(3):468—474
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4，Bennett MR,Anglin S,McEwan JR, et al. Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in viva by c-myc antisense oligodeoxynuc-leotides. J Clin Invest， 1994, 93(2):828—833
5，Bauriedel G,Kandolf R, Welsch U,et al.Mechanism of restenosis after angioplasty. Z Kardiol， 1994, 83(4):31-41
(1999-02-25收稿), http://www.100md.com