外参照PCR及其产物酶联杂交定量检测HBV DNA
作者：缪晓辉 戚中田 孔宪涛
单位：
关键词：肝炎病毒；乙型；聚合酶链反应；定量分析
摘 要摘 要：目的:建立一种敏感、特异和精确的乙型肝炎病毒(HBV)基因PCR及其产物的酶联杂交定量分析技术。方法: (1)常规PCR法扩增HBV DNA质粒和血清HBV DNA,引物(SP1，SP2)为一对HBV DNA S区基因特异引物，扩增片段长319 bp，SP2的5′端用生物素修饰。扩增条件经过严格优化组合,以最大限度减少非特异片段,包括引物二聚体的产生。设定5个不同梯度的HBV DNA外参照管, 制作标准曲线。(2)酶联杂交分析: PCR产物经100℃解链并稀释后，与捕获探针(长20 nt,3′端用氨基修饰,借氨基与DNA-BINDTM反应板结合)杂交；用亲和素-碱性磷酸酶及相应显色系统检测杂交信号。结果:目的片段含量较低的PCR产物,在琼脂糖凝胶电泳时未见光带,但可被后续的酶联杂交检出，故灵敏度可超过普通PCR定性法。结论:本定量方法操作相对简单，结果数据化，不受主观因素干扰，灵敏度很高，而且省时、省材。
, http://www.100md.com
分类号：R 512.620.4 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0120-04
Non-competitive PCR combining with enzyme-linked
hybridization for quantitative detection
of hepatitis B virus DNA
MIAO Xiao-Hui
(Department of Infectious Diseases, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
QI Zhong-Tian
(Department of Microbiology, Department of Basic Medicine)
KONG Xian-Tao
(Department of Laboratory Diagnosis, Changzheng Hospital)
ABSTRACT：Objective: To develop a sensitive, specific and accurate method for quantitative detection of hepatitis B virus DNA. Methods: 1. Design and synthesis of primers and probes: One pair of primers(SP1 and SP2) were designed according to the sequence of HBV S gene, by which a fragment of 319 bp in length can be amplified by PCR. The primer SP2 was modified with biotin at its 5′-end.A capturing probe of 20 nt long was synthesized and labeled with amine at its 3′-end, which can specifically hybridize with one strand of specific amplicon. 2. PCR procedures: Parameters and agents of amplification were sophisticatedly improved in order to reduce non-specific amplification including primer dimers. Five testing tubes of template in ten-folds dilution were prepared to make standard curve. 3. PCR products analysis by enzyme-linked hybridization: Denatured amplicon were hybridized with capture probe which has been coated on microdish previously, and then, the hybridizing signals were detected utilizing avidin-alkaline-phosphatase and its subtract. Results: Low amount of interest fragment in PCR products which was not identified by agarose gel electrophoresis could be detected by enzyme-linked hybridization, indicating that this method was more sensitive than qualitative PCR. Moreover, this method was proven to be highly specific since no elevated signal was observed by analysis of PCR products with non-specific amplicon. Conclusion: The technique of PCR combining with enzyme-linked hybridization is simple, highly sensitive and specific, reliable and less time-consuming.
, http://www.100md.com
KEY WORDS：hepatitis B virus; polymerase chain reation; quantitative analysis▲
乙型肝炎患者血清HBV DNA在干扰素治疗前、中、后的含量及变化规律与治疗反应性及远期疗效有密切关系[1,2]，故HBV基因定量分析有重要价值。各种直接分子杂交定量技术有特异性强、操作简单等特点，但均存在着敏感度低的问题，如PCR法HBV DNA阳性血清标本的检出率在60 %左右，因而不能真实反映低水平HBV DNA复制状态；尤其是对那些在干扰素治疗后， HBV复制水平明显降低，但尚未完全清除者不宜采用杂交方法作定量分析[3]。PCR技术还存在假阳性过高及操作不规范等问题。本研究采用了外参照PCR，即非竞争PCR技术扩增HBV，并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物进行定量分析。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 主要材料 Taq酶及底物等，购自上海生工生物工程公司。 微量条排杂交(DNA-BINDTM)反应板，Corning Costar公司生产；链亲和素-碱性磷酸酶复合物(Sav-Ap)和高分子量DNA定量标准品，均为Gibco BRL公司产品。10份血清标本取自慢性HBV感染者，均为HBsAg，HBeAg及抗HBc IgM抗体阳性，PCR定性试验HBV DNA阳性。阴性血清取自健康献血员，HBV免疫标志物均阴性，PCR定性试验HBV DNA阴性。HBV DNA质粒pADR-1 DNA(由adr型HBV全基因经BamHⅠ酶切后克隆至pBR322载体)，本校微生物学教研室胡卫江博士馈赠。
1.2 探针和引物设计 PCR引物(SP1 ，SP2)为一对HBV S区基因特异引物，扩增该区第2 064～2 383位, 片段长319 bp，SP2的5′-端用生物素修饰。SP1:5′-TAGAC TCGTG GTGGA CTTC-3′，SP2:5′-biotin-CAACA AGAGG GAAAC ATAGA GG-3′。捕获探针：长度为20 nt,Tm=62℃，3′-端氨基修饰。该探针可与PCR产物特异片段杂交。序列:5′-CTCCC CCTAG AAAAT TGAGA-amine-3′。
, http://www.100md.com
以上探针和引物均经电子计算机软件HYBsimulator Version 4.0设计，由上海生工生物工程公司合成和修饰。
1.3 HBV DNA标准品制备 (1)HBV DNA质粒扩增和纯化: 质粒扩增按本室常规进行；质粒纯化采用柱分离加酚-氯仿抽提法。(2)质粒鉴定和定量:采用琼脂糖凝胶电泳与定量标准品对比法及紫外分光光度计法。
1.4 HBV DNA样品制备[4]血清标本用蛋白酶K裂解后，再用酚-氯仿抽提。
1.5 PCR条件 反应液组成:10×缓冲液 5 μl,15 mmol/L MgCl2 3.5 μl, dNTP各80 mmol/L,引物各300 nmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,模板10 μl,加双蒸水至50 μl。扩增条件:94℃,5 min；94℃,30 s；56℃,30 s；72℃,45 s，32个循环后72℃延伸3 min。
, http://www.100md.com
1.6 PCR产物微反应板酶联杂交 PCR产物微反应板酶联杂交法由本室建立。主要步骤包括：将捕获探针“包被”于DNA杂交板(DNA-BINDTM)并封闭后，加入经100℃解链并稀释后的PCR扩增产物，置反应板于52℃，杂交20 min；经充分洗涤后加入Sav-AP复合物，温育后洗涤，加底物显色；根据光密度(D)值判断产物的杂交信号强弱。
2 结果和讨论
2.1 PCR条件的优化
2.1.1 Mg2+、引物、dNTP浓度与PCR扩增的特异性 我们采用不同浓度的MgCl2、引物和dNTP组合，分别扩增0，10，100，1 000 fg HBV DNA质粒，经35个循环后作产物琼脂糖凝胶电泳，证实较低镁离子和引物浓度可避免杂带产生，dNTP在常规应用浓度范围内不是造成假阳性的主要因素。
, http://www.100md.com
2.1.2 退火温度 退火温度在55～57℃之间，PCR产物的特异性较高；低于55℃或高于58℃，在琼脂糖凝胶电泳时发现杂带，但产物酶联杂交的非特异杂交信号并无明显增加。
2.1.3 PCR扩增的循环次数 在一定循环数内，目的片段产物量随循环数增加，琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色可见亮度差别(图1)。我们设定了3种模板起始浓度及一个阴性对照管，将不同循环数的扩增产物作酶联杂交。结果表明，无论起始浓度多少，PCR产物量均在一定循环数后进入缓慢上升的“平台期”(图2)。为避免进入“平台期”，同时保证低浓度模板DNA的扩增效果，我们选择了32个循环数。
图1 不同循环数PCR产物凝胶电泳结果
, 百拇医药 Fig 1 Agarose gel electrophoresis analysis of
amplicon amplified in various PCR cycles
Lane 1: DNA molecule markers;Lane 2～8: 45,40,35,30,25,20 and 15 PCR cycles respectively
图2 与模板量和循环数相关的PCR产物酶联杂交饱和现象
Fig 2 Saturation related to the quantity of template and
, http://www.100md.com
the numbers of PCR cycle
1～3: The amount of template(50 μl) is
1, 10, 100 fg respectively; 4:Negative control
2.1.4 血清标本处理方式 我们将蛋白酶K裂解后的血清标本加入酚-氯仿，混匀后离心，取上清直接作PCR，结果扩增反应阳性，但有杂带和引物二聚体。若将标本再加氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀和洗涤以后，PCR的特异性和敏感性均提高。
2.2 产物微反应板酶联杂交条件及优化结果
2.2.1 敏感度 50 μl PCR产物，用杂交液作倍比稀释，结果显示，稀释度在1∶256时仍能检出杂交信号，但稀释度小于1∶8时，各孔D值反而下降，表明存在着过量抑制现象。为方便实验操作，我们每次取2 μl产物作杂交反应。
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2.2.2 特异性 本方法的特异性取决于PCR的特异性引物和捕获探针两个方面。结果显示,即使在PCR过程中产生非特异条带,也不增加产物酶联杂交后的D值,说明产物酶联杂交检测可提高特异性。
2.3 外参照标准曲线及精确度 将HBV DNA标准品稀释成不同浓度，每一种浓度设3个复管，PCR后每一反应管产物再用两个复孔作酶联杂交检测，根据D值的信号/噪声(S/N)比值制作标准曲线。将10份血清标本分作3个复管行PCR及产物酶联杂交，各管所测得的D值与标准曲线比较后得出量值(表1)。结果表明，HBV DNA标准品可作为外参照制作标准曲线，但管间差异较为明显，检测血清标本的结果亦然。另外，我们取相同量起始模板作10个PCR复管，然后分别取产物作杂交检测，按各反应管的平均D值求得CV值为21.4%。
表1 血清标本HBV DNA定量检测结果
Tab 1 Quantification of HBV DNA in serum from patients
, 百拇医药
[cB/(fmol.ml-1)]
Sample
1
(×10-6)
2
(×10-1)
3
(×10-2)
4
(×10-5)
5
, 百拇医药
(×10-4)
6
(×10-3)
7
(×10-3)
8
(×10-2)
9
(×10-6)
10
(×10-2)
, 百拇医药
Test 1
3.2
1.1
1.1
2.7
9.1
7.2
3.3
5.9
7.1
1.0
Test 2
3.1
, 百拇医药
3.3
1.5
7.1
3.1
4.0
8.8
8.4
7.0
2.2
Test 3
1.3
6.0
7.7
, 百拇医药
5.1
9.9
2.9
5.6
9.0
8.7
5.6
Mean value
2.53
3.47
3.43
4.97
7.37
, http://www.100md.com
4.70
5.90
7.77
7.60
2.93
根据上述实验结果，我们认为采用外参照法必须重视以下几点:第一，标本处理要求严格。血清标本必须经过酶消化和酚-氯仿抽提，否则很难避免非特异扩增产物的产生，尤其是引物二聚体的形成。虽然这种非特异扩增产物不会与捕获探针发生杂交反应，但仍有可能干扰酶联杂交检测结果；同时，为保证扩增的特异性，参与PCR反应的各种试剂浓度也均需经过优化选择。第二，用外参照(即克隆的HBV DNA)制作标准曲线时，应将参照物投入HBV DNA阴性血清中，按待检标本处理方法进行裂解抽提。第三，避免PCR扩增反应进入“平台期”。在此期，不同浓度标准外参照的扩增产物不再显示明显的递度差别，因而无法制作标准曲线。第四，PCR仪，尤其是非顶盖加热式PCR仪会产生较明显的管与管之间扩增效率的差异，结果解释宜慎重，最好作复管和复孔。我们将该法与终点稀释法和竞争PCR法进行重复性和精确性比较，结果发现该方法不如竞争PCR法，但优于终点稀释法。我们认为，如果对定量的精确性要求不十分严格，本研究所建立的外参照非竞争PCR法作HBV DNA定量不失为一种可选择的方法。它的最大特点是产物定量比较简单，结果数据化，不受主观因素干扰，而且省时、省材。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Hwang SJ, Lee SD, Lu RH, et al.Comparison of three different hybridization assays in the quantitative measurement of serum hepatitis B virus DNA[J].J Virol Methods. 1996, 62(2): 123-129.
[2]Jardi R, Buti M, Rodriguez-Frias F, et al.The value of quantitative detection of HBV-DNA amplified by PCR in the study of hepatitis B infection[J].J Hepatol. 1996, 24(6): 680-685.
[3]Jalava T, Lehtovaara P, Kallio A,et al.Quantification of hepatitis B virus DNA by competitive amplification and hybridization on microplates[J]. Biotechniques. 1993, 15(2): 134-139.
[4]Berninger M, Hammer M, Hoyer B, et al. An assay for the detection of the DNA genome of hepatitis B virus in serum[J].J Med Virol, 1982, 9(1):57-62.
收稿日期：1999-08-23
修稿日期：1999-11-07, 百拇医药
单位：
关键词：肝炎病毒；乙型；聚合酶链反应；定量分析
摘 要摘 要：目的:建立一种敏感、特异和精确的乙型肝炎病毒(HBV)基因PCR及其产物的酶联杂交定量分析技术。方法: (1)常规PCR法扩增HBV DNA质粒和血清HBV DNA,引物(SP1，SP2)为一对HBV DNA S区基因特异引物，扩增片段长319 bp，SP2的5′端用生物素修饰。扩增条件经过严格优化组合,以最大限度减少非特异片段,包括引物二聚体的产生。设定5个不同梯度的HBV DNA外参照管, 制作标准曲线。(2)酶联杂交分析: PCR产物经100℃解链并稀释后，与捕获探针(长20 nt,3′端用氨基修饰,借氨基与DNA-BINDTM反应板结合)杂交；用亲和素-碱性磷酸酶及相应显色系统检测杂交信号。结果:目的片段含量较低的PCR产物,在琼脂糖凝胶电泳时未见光带,但可被后续的酶联杂交检出，故灵敏度可超过普通PCR定性法。结论:本定量方法操作相对简单，结果数据化，不受主观因素干扰，灵敏度很高，而且省时、省材。
, http://www.100md.com
分类号：R 512.620.4 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)02-0120-04
Non-competitive PCR combining with enzyme-linked
hybridization for quantitative detection
of hepatitis B virus DNA
MIAO Xiao-Hui
(Department of Infectious Diseases, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
, 百拇医药
QI Zhong-Tian
(Department of Microbiology, Department of Basic Medicine)
KONG Xian-Tao
(Department of Laboratory Diagnosis, Changzheng Hospital)
ABSTRACT：Objective: To develop a sensitive, specific and accurate method for quantitative detection of hepatitis B virus DNA. Methods: 1. Design and synthesis of primers and probes: One pair of primers(SP1 and SP2) were designed according to the sequence of HBV S gene, by which a fragment of 319 bp in length can be amplified by PCR. The primer SP2 was modified with biotin at its 5′-end.A capturing probe of 20 nt long was synthesized and labeled with amine at its 3′-end, which can specifically hybridize with one strand of specific amplicon. 2. PCR procedures: Parameters and agents of amplification were sophisticatedly improved in order to reduce non-specific amplification including primer dimers. Five testing tubes of template in ten-folds dilution were prepared to make standard curve. 3. PCR products analysis by enzyme-linked hybridization: Denatured amplicon were hybridized with capture probe which has been coated on microdish previously, and then, the hybridizing signals were detected utilizing avidin-alkaline-phosphatase and its subtract. Results: Low amount of interest fragment in PCR products which was not identified by agarose gel electrophoresis could be detected by enzyme-linked hybridization, indicating that this method was more sensitive than qualitative PCR. Moreover, this method was proven to be highly specific since no elevated signal was observed by analysis of PCR products with non-specific amplicon. Conclusion: The technique of PCR combining with enzyme-linked hybridization is simple, highly sensitive and specific, reliable and less time-consuming.
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KEY WORDS：hepatitis B virus; polymerase chain reation; quantitative analysis▲
乙型肝炎患者血清HBV DNA在干扰素治疗前、中、后的含量及变化规律与治疗反应性及远期疗效有密切关系[1,2]，故HBV基因定量分析有重要价值。各种直接分子杂交定量技术有特异性强、操作简单等特点，但均存在着敏感度低的问题，如PCR法HBV DNA阳性血清标本的检出率在60 %左右，因而不能真实反映低水平HBV DNA复制状态；尤其是对那些在干扰素治疗后， HBV复制水平明显降低，但尚未完全清除者不宜采用杂交方法作定量分析[3]。PCR技术还存在假阳性过高及操作不规范等问题。本研究采用了外参照PCR，即非竞争PCR技术扩增HBV，并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物进行定量分析。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 主要材料 Taq酶及底物等，购自上海生工生物工程公司。 微量条排杂交(DNA-BINDTM)反应板，Corning Costar公司生产；链亲和素-碱性磷酸酶复合物(Sav-Ap)和高分子量DNA定量标准品，均为Gibco BRL公司产品。10份血清标本取自慢性HBV感染者，均为HBsAg，HBeAg及抗HBc IgM抗体阳性，PCR定性试验HBV DNA阳性。阴性血清取自健康献血员，HBV免疫标志物均阴性，PCR定性试验HBV DNA阴性。HBV DNA质粒pADR-1 DNA(由adr型HBV全基因经BamHⅠ酶切后克隆至pBR322载体)，本校微生物学教研室胡卫江博士馈赠。
1.2 探针和引物设计 PCR引物(SP1 ，SP2)为一对HBV S区基因特异引物，扩增该区第2 064～2 383位, 片段长319 bp，SP2的5′-端用生物素修饰。SP1:5′-TAGAC TCGTG GTGGA CTTC-3′，SP2:5′-biotin-CAACA AGAGG GAAAC ATAGA GG-3′。捕获探针：长度为20 nt,Tm=62℃，3′-端氨基修饰。该探针可与PCR产物特异片段杂交。序列:5′-CTCCC CCTAG AAAAT TGAGA-amine-3′。
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以上探针和引物均经电子计算机软件HYBsimulator Version 4.0设计，由上海生工生物工程公司合成和修饰。
1.3 HBV DNA标准品制备 (1)HBV DNA质粒扩增和纯化: 质粒扩增按本室常规进行；质粒纯化采用柱分离加酚-氯仿抽提法。(2)质粒鉴定和定量:采用琼脂糖凝胶电泳与定量标准品对比法及紫外分光光度计法。
1.4 HBV DNA样品制备[4]血清标本用蛋白酶K裂解后，再用酚-氯仿抽提。
1.5 PCR条件 反应液组成:10×缓冲液 5 μl,15 mmol/L MgCl2 3.5 μl, dNTP各80 mmol/L,引物各300 nmol/L,Taq DNA聚合酶1 U,模板10 μl,加双蒸水至50 μl。扩增条件:94℃,5 min；94℃,30 s；56℃,30 s；72℃,45 s，32个循环后72℃延伸3 min。
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1.6 PCR产物微反应板酶联杂交 PCR产物微反应板酶联杂交法由本室建立。主要步骤包括：将捕获探针“包被”于DNA杂交板(DNA-BINDTM)并封闭后，加入经100℃解链并稀释后的PCR扩增产物，置反应板于52℃，杂交20 min；经充分洗涤后加入Sav-AP复合物，温育后洗涤，加底物显色；根据光密度(D)值判断产物的杂交信号强弱。
2 结果和讨论
2.1 PCR条件的优化
2.1.1 Mg2+、引物、dNTP浓度与PCR扩增的特异性 我们采用不同浓度的MgCl2、引物和dNTP组合，分别扩增0，10，100，1 000 fg HBV DNA质粒，经35个循环后作产物琼脂糖凝胶电泳，证实较低镁离子和引物浓度可避免杂带产生，dNTP在常规应用浓度范围内不是造成假阳性的主要因素。
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2.1.2 退火温度 退火温度在55～57℃之间，PCR产物的特异性较高；低于55℃或高于58℃，在琼脂糖凝胶电泳时发现杂带，但产物酶联杂交的非特异杂交信号并无明显增加。
2.1.3 PCR扩增的循环次数 在一定循环数内，目的片段产物量随循环数增加，琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色可见亮度差别(图1)。我们设定了3种模板起始浓度及一个阴性对照管，将不同循环数的扩增产物作酶联杂交。结果表明，无论起始浓度多少，PCR产物量均在一定循环数后进入缓慢上升的“平台期”(图2)。为避免进入“平台期”，同时保证低浓度模板DNA的扩增效果，我们选择了32个循环数。
图1 不同循环数PCR产物凝胶电泳结果
, 百拇医药 Fig 1 Agarose gel electrophoresis analysis of
amplicon amplified in various PCR cycles
Lane 1: DNA molecule markers;Lane 2～8: 45,40,35,30,25,20 and 15 PCR cycles respectively
图2 与模板量和循环数相关的PCR产物酶联杂交饱和现象
Fig 2 Saturation related to the quantity of template and
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the numbers of PCR cycle
1～3: The amount of template(50 μl) is
1, 10, 100 fg respectively; 4:Negative control
2.1.4 血清标本处理方式 我们将蛋白酶K裂解后的血清标本加入酚-氯仿，混匀后离心，取上清直接作PCR，结果扩增反应阳性，但有杂带和引物二聚体。若将标本再加氯仿-异戊醇抽提、乙醇沉淀和洗涤以后，PCR的特异性和敏感性均提高。
2.2 产物微反应板酶联杂交条件及优化结果
2.2.1 敏感度 50 μl PCR产物，用杂交液作倍比稀释，结果显示，稀释度在1∶256时仍能检出杂交信号，但稀释度小于1∶8时，各孔D值反而下降，表明存在着过量抑制现象。为方便实验操作，我们每次取2 μl产物作杂交反应。
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2.2.2 特异性 本方法的特异性取决于PCR的特异性引物和捕获探针两个方面。结果显示,即使在PCR过程中产生非特异条带,也不增加产物酶联杂交后的D值,说明产物酶联杂交检测可提高特异性。
2.3 外参照标准曲线及精确度 将HBV DNA标准品稀释成不同浓度，每一种浓度设3个复管，PCR后每一反应管产物再用两个复孔作酶联杂交检测，根据D值的信号/噪声(S/N)比值制作标准曲线。将10份血清标本分作3个复管行PCR及产物酶联杂交，各管所测得的D值与标准曲线比较后得出量值(表1)。结果表明，HBV DNA标准品可作为外参照制作标准曲线，但管间差异较为明显，检测血清标本的结果亦然。另外，我们取相同量起始模板作10个PCR复管，然后分别取产物作杂交检测，按各反应管的平均D值求得CV值为21.4%。
表1 血清标本HBV DNA定量检测结果
Tab 1 Quantification of HBV DNA in serum from patients
, 百拇医药
[cB/(fmol.ml-1)]
Sample
1
(×10-6)
2
(×10-1)
3
(×10-2)
4
(×10-5)
5
, 百拇医药
(×10-4)
6
(×10-3)
7
(×10-3)
8
(×10-2)
9
(×10-6)
10
(×10-2)
, 百拇医药
Test 1
3.2
1.1
1.1
2.7
9.1
7.2
3.3
5.9
7.1
1.0
Test 2
3.1
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3.3
1.5
7.1
3.1
4.0
8.8
8.4
7.0
2.2
Test 3
1.3
6.0
7.7
, 百拇医药
5.1
9.9
2.9
5.6
9.0
8.7
5.6
Mean value
2.53
3.47
3.43
4.97
7.37
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4.70
5.90
7.77
7.60
2.93
根据上述实验结果，我们认为采用外参照法必须重视以下几点:第一，标本处理要求严格。血清标本必须经过酶消化和酚-氯仿抽提，否则很难避免非特异扩增产物的产生，尤其是引物二聚体的形成。虽然这种非特异扩增产物不会与捕获探针发生杂交反应，但仍有可能干扰酶联杂交检测结果；同时，为保证扩增的特异性，参与PCR反应的各种试剂浓度也均需经过优化选择。第二，用外参照(即克隆的HBV DNA)制作标准曲线时，应将参照物投入HBV DNA阴性血清中，按待检标本处理方法进行裂解抽提。第三，避免PCR扩增反应进入“平台期”。在此期，不同浓度标准外参照的扩增产物不再显示明显的递度差别，因而无法制作标准曲线。第四，PCR仪，尤其是非顶盖加热式PCR仪会产生较明显的管与管之间扩增效率的差异，结果解释宜慎重，最好作复管和复孔。我们将该法与终点稀释法和竞争PCR法进行重复性和精确性比较，结果发现该方法不如竞争PCR法，但优于终点稀释法。我们认为，如果对定量的精确性要求不十分严格，本研究所建立的外参照非竞争PCR法作HBV DNA定量不失为一种可选择的方法。它的最大特点是产物定量比较简单，结果数据化，不受主观因素干扰，而且省时、省材。
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参考文献：
[1]Hwang SJ, Lee SD, Lu RH, et al.Comparison of three different hybridization assays in the quantitative measurement of serum hepatitis B virus DNA[J].J Virol Methods. 1996, 62(2): 123-129.
[2]Jardi R, Buti M, Rodriguez-Frias F, et al.The value of quantitative detection of HBV-DNA amplified by PCR in the study of hepatitis B infection[J].J Hepatol. 1996, 24(6): 680-685.
[3]Jalava T, Lehtovaara P, Kallio A,et al.Quantification of hepatitis B virus DNA by competitive amplification and hybridization on microplates[J]. Biotechniques. 1993, 15(2): 134-139.
[4]Berninger M, Hammer M, Hoyer B, et al. An assay for the detection of the DNA genome of hepatitis B virus in serum[J].J Med Virol, 1982, 9(1):57-62.
收稿日期：1999-08-23
修稿日期：1999-11-07, 百拇医药