人树突状细胞体外提呈凋亡胆管癌细胞抗原的研究
作者：吴刚 韩本立 裴雪涛
单位：吴刚(第三军医大学附属西南医院肝胆外科中心，重庆400038)；韩本立(第三军医大学附属西南医院肝胆外科中心，重庆400038)；裴雪涛(第三军医大学军事医学科 学院放射医学研究所实验血液研究室，北京100850)
关键词：树突状细胞；单核细胞；粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子；白细胞介素4；细胞凋亡；凋亡小体
第三军医大学学报000213
提要 目的：建立从人外周血诱导扩增树突状细胞(DC)及其从凋亡癌细胞提呈抗原的方法。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞，加入50ng/mlhGM-CSF，1 000ng/mlhIL-4,隔天1次，共4次，培养第3天，加入γ射线 照射过的胆管癌细胞，再继续体外培养1周后，用树 突状细胞富集柱收集DC。结果：DC高表达共刺激分子B7和 CD1a,表面具有典型不规则突起，DC捕捉凋亡小体、吞噬 凋亡小体，负载抗原的DC其激发同种异体T淋巴细胞增 殖的能力进一步增强。结论：用GM-CSF加IL-4能从人外周血诱导、扩增出DC，并可以有效提呈凋亡胆管癌 细胞的抗原，可望成为有效的肿瘤抗原装载DC的新途径。
, 百拇医药
中图法分类号R329.24;R329.25;R735.8 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0142-04
Acquirement of antigen from apoptotic cells by human dendritic cells from peripheral blood
WU Gang, HAN Ben-li,PEI Xue-tao
(Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
Abstract Objective: To seek an efficient way of antigen acquirement from apoptotic cells by human dendritic cells (DC) from peripheral blood. Methods: We obtained DC from peripheral blood monocytes maintaining the antigen capturing and processing capacity by using granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4). Then the immature DC and apoptotic hepatocholangioma cells were cocultured for 7 d. Results: These cells have typical dendritic morphology and express high levels of CD1a and B7. Furthermore, they acquire antigen from apoptotic cells and induce and increased T cell stimulatory capacity in MLR. Conclusion: We established DC from blood monocytes using GM-CSF and IL-4. DC can efficiently acquire antigen derived from apoptotic cells and induce increase of T cells.
, 百拇医药
Key words dendritic cell; monocyte; granulocyte/ macrophage colony-stimulating factor;interleukin 4; apoptosis; apoptotic body
树突状细胞(Dendritic cells,DC)在抗原提呈方面起着重要的 作用。树突状细胞的分化发育过程存在二个不同的 阶段，作为未成熟的DC，具有摄取、处理抗原的能力 ，一旦发育为成熟DC，抗原捕获能力丧失，变成刺激 静息淋巴细胞激活初次免疫反应的免疫抗原递呈细 胞。早在90年代初，就有报道[1，2]DC具有胞饮能力和 表达FcγRII,因而具有捕获抗原的能力。最新研究发现[3]，包裹在凋亡小体外面的膜性物质是一种与原生存 细胞膜相一致的免疫原性物质，凋亡小体膜携带的 抗原能被DC的MHC-I分子所提呈。许多证据表明抗肿瘤 免疫机制失能不是由于缺乏肿瘤抗原而是由于这些 抗原不能有效提呈给T细胞产生特异性的免疫反应之 故。本研究进行了人外周血树突状细胞体外诱导扩 增及鉴定，DC提呈凋亡肿瘤细胞抗原的实验研究。目 的是通过DC吞噬凋亡小体获取肿瘤细胞抗原来阻止肿 瘤细胞免疫逃避，从而激发机体的自身免疫力，为 探索DC在肿瘤主动特异性免疫治疗中的重要作用打下 基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 γ-射线照射源：军事医学科学院放 射医学研究所60Co源，剂量率2.07～2.23Gy/min；淋巴细胞分 离液M450：英国进口分装，上海化学试剂厂；CD2、CD19 MagneticBeads磁性分离试剂盒：Coulter公司；鼠抗人单克隆 荧光抗体CD1a(PE)、B7(FITC)：Pharmingen公司；培养基( IMDM)：GibcolBrl公司。
1.1.2 细胞株 QBC939胆管癌细胞株由第三军医大学西南医 院王曙光博士惠赠。
1.2 方法
1.2.1 人外周血定向诱导分化和培养树突状细胞人外 周血肝素抗凝，4∶1比例与0.5%甲基纤维素混匀静置 约30min，将红细胞自然沉降至界限分明。收集吸出上 层(上清)有核细胞部分，Ficoll-Paque分离获取单个核 细胞，CD2、CD19免疫磁珠去除T、B淋巴细胞，制成1× 105/ml细胞悬液备用。24孔培养板每孔加1mlIMDM培养基， 37°C、5%CO2及饱和湿度的条件下，每孔单核细胞的初 始浓度2×104/ml，细胞因子GM-CSF50ng/ml、IL-4 1000ng/ml每48 h加入培养体系1次，连续4次，1周半量换液。
, 百拇医药
1.2.2 凋亡胆管癌细胞制备 取5×106胆管癌细胞4Gy照射6 h使细胞凋亡。
1.2.3 树突状细胞吞噬凋亡小体提呈抗原 IMDM培养基，37°C、5%CO2及饱和湿度的条件下，从人外周血定向诱 导分化和培养树突状细胞并在培养的第3天DC和凋亡胆 管癌细胞共培养，为了证明凋亡是抗原交叉提呈中 的重要环节，设计了DC和坏死胆管癌细胞共培养组( 胆管癌细胞加入低渗盐水在37°C、5%CO2及饱和湿度的 条件下培养30min)以及正常培养的胆管癌细胞，共培 养7d后，收集DC备用。
1.2.4 电镜观察于培养第11天收集共培养的DC用PBS洗涤2次 ，4%戊二醛固定后，PBS洗1次，制成悬液滴片，1%锇 酸固定，梯度酒精脱水，扫描电镜观察摄片。另取分化成熟的DC悬液离心，细胞沉淀用4%戊二醛固定及 1%锇酸固定，梯度酒精脱水，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察摄片。
1.2.5 DC的免疫刺激活性及负载抗原后的免疫刺激活性 从外周血单核细胞诱导、分化获得的DC分别以1×103/孔 ，5×103/孔，1×104/孔加入96孔圆底培养板，用单核细胞 作对照组，每组各3个复孔，每孔再加入同种T细胞1× 105，终体积为200μl,37°C、5%CO2及饱和湿度的条件下。 培养96h，于检测前18h加H3-TdR0.5μCi/孔。收集细胞， 液闪计数检测cpm值，结果用3孔平均值表示。我们也 检测了负载抗原后DC的免疫刺激活性，3组DC(受凋亡 胆管癌细胞刺激、坏死胆管癌细胞刺激、正常培养 的胆管癌细胞刺激)也作了比较。
, 百拇医药
2 结果
2.1 具有抗原递呈能力的DC体外培养
去除T、B细胞后的外周血单核细胞，加入在IMDM培养 基中，GM-CSF50ng/ml,IL-41000ng/ml48h1次，培养7d后，大 部分细胞悬浮不贴壁，形态不规则，相差显微镜可 见伸展的大量毛刺，为典型DC形态，见图1。表面标志 分析，大量细胞是均质的并高表达CD1a和B7，见图2。透 射电镜见DC伸展的突起，胞浆富含线粒体，见图3。
图1 DC体外 培养第7天的形态(×500)
Fig1 Typical appearance of DC cultured on 7th day(×500)
, http://www.100md.com
图2 培养第7天DC表型检测
Fig2 Surface phenotype of DC on 7th day of culture
图3 透射电镜下的树突状细胞(×7600)
Fig3 DC under transmission electron microscopy(×7600)
2.2 未成熟DC吞噬凋亡小体从凋亡胆管癌细胞提呈抗 原
与凋亡胆管癌细胞共培养的DC胞浆内可见吞噬的凋 亡小体，而与坏死胆管癌细胞共培养的DC胞浆内未见 吞噬的凋亡小体，见图4。
, http://www.100md.com
图4透射电镜显示DC吞噬凋亡小体(×7600)
Fig4 Transmission electron microscopy revealed apoptotic body in the cytoplasm of DC(×7600)
2.3 DC的
我们检测从外周血单核细胞分化、诱导的DC对T淋巴 细胞的刺激活性，也检测了提呈抗原后DC的免疫刺激 活性，并对分别受凋亡胆管癌细胞刺激、坏死胆管 癌细胞刺激和培养胆管癌细胞刺激的DC其免疫刺激活 性作了比较，见表1。结果表明，同种异体混合淋巴 细胞反应时，少量DC即可强烈激发T淋巴细胞的增殖， 在抗原负载DC后，其激发能力进一步增强(p<0.05)，见表1。而对照组由于是单核细胞而非DC，故并不能有效激发T淋巴细胞的增殖。
表1 DC的免疫刺激活性及其提呈抗原后的免疫刺激活性(min-1)
, http://www.100md.com
Tab1 Immuno-stimulating activity of DC before and after antigen acquirement(min-1)
Dose of DC
Allo MLR
Control(Monocyte)104
951±31
DC(Without any coculture with cancer cell)
103
1721±224*
, http://www.100md.com
5×103
2414±120*
104
2688±190*
DC(Cocultured with apoptotic cancer cell)
103
4597±189**
5×103
5695±240**
, 百拇医药
104
6805±127**
DC(Cocultured with necrosis cancer cell)
103
1775±172*
5×103
2436±223*
104
2681±245*
, 百拇医药 DC(Cocultured with cancer cell)
103
1749±230*
5×103
2413±231*
104
2715±267*
*:P<0.05 vs control;**:P<0.05 DC(Cocultured with apoptotic cancer cell) vs other groups
, 百拇医药
3 讨论
一般地讲，抗原提呈细胞被分为二类：专职的抗原 提呈细胞和非专职的抗原提呈细胞。非专职抗原提呈细胞不属于淋巴系统内的细胞，而专职抗原提呈 细胞，如树突状细胞、巨噬细胞(Macrophages,Mφ)和B细胞 ，则是免疫系统中不可缺少的重要组成部分。尽管 他们都有消化、处理和提呈抗原的共同特点，但是DC却在免疫系统中扮演了一个重要的角色,它是最有效的 专职抗原提呈细胞，能在体内激活静息T细胞，从而激发初次免疫反应。如果肿瘤抗原未被DC提呈就不能 激发有效的抗肿瘤免疫[4，5]。已有的研究证明[6]，在肿瘤患者体内存在肿瘤细胞逃避DC抗原提呈的机制。
DC可以从人不同组织的DC前体(如骨髓、脐带血和外 周血)加上不同的造血细胞因子组合的刺激而诱导、分化成熟。目前，在体外检测DC的重要标准有：CD1a,CD40,CD80,CD86和MHC-Ⅱ,以及刺激同种异体T细胞增殖的 混合淋巴细胞反应的能力[7]。
, 百拇医药
传统的MHC抗原的加工和提呈途径是：大多数MHC-Ⅰ提呈的多肽来自细胞内抗原酶解(主要由蛋白酶体 在胞质溶胶中酶解)成短肽(8～12aa)，再由抗原肽 转送者转送到粗面内质网与新生MHC-Ⅰ类分子重链和 β2-微球蛋白形成三聚体复合物，然后在细胞表面 被CD8+T细胞识别。而MHC-Ⅱ对细胞外抗原的加工和提 呈是通过细胞外抗原被APC内噬后在内室(Endocytic compartments)酸变性，内体(Endosomal)及溶酶体酶解成1条12～25aa的短肽并与内质网中合成后运来的MHC-Ⅱ类分子结合，再转运到APC表面为CD4+TH细胞识别[8，9]。最新研究[3]发现，包裹在凋亡小体外面的膜性物质是一 种与原生存细胞膜相一致的免疫原性物质，当凋亡小体被DC吞噬后，包裹在凋亡小体外面的免疫原性物 质就将抗原递呈给DC，通过MHC-I提呈凋亡肿瘤细胞抗原，刺激MHC-I限制的CTL。
本研究发现并证实了DC而非单核细胞可以有效提呈 凋亡胆管癌细胞的抗原(坏死胆管癌细胞和培养的 胆管癌细胞却不能有效地传递抗原给DC)，刺激MHC-I限制的CTLs[10]。
, 百拇医药
众所周知，通过肿瘤的常规疗法(手术、放疗、化疗)往往难以获得根治，难于解决转移和复发的问题，且常有明显的损伤和毒副作用，如能激发、增强机体对肿瘤的主动免疫排斥反应，则有可能达到根治肿瘤的目的，而且这在本质上属于一种生理性 治疗措施。那么，在体内应该能建立类似于体外定向诱导分化DC和诱导肿瘤细胞凋亡的可控条件，获得大量高纯度的DC及体内诱导的能传递抗原给DC的肿瘤细胞凋亡小体，通过DC提呈抗原诱导特异性CTLs进行主动特异性免疫抗肿瘤治疗，将在肿瘤的免疫治疗上创造出较好的效果，这是值得我们进行深入研究、开发和应用的领域。
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(3982511)
作者简介：吴刚(1962.11)，男，重庆市人，博士，主治医师，讲师，主要从事树突细胞临床应用方面的研究，发表论文6篇。电话：(023)65335972
参考文献
, http://www.100md.com
[1]Levine T P, Chain B M. Endocytosis by antigen presenting cells: Dendritic cells are as endocytically active as other antigen pre-senting cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1992, 89(17):8 342-8 346.
[2]Girclomoni G, Simon J C, Bergstresser P R，et al. Freshly iso-lated spleen dendritic cells and epidermal Langerhans cells un-dergo similar phenotypic and functional changes during short-term culture[J].J Immunlo，1990,145(7):2 820-2 825.[3]Matthew L,Albert B S, Nina B. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs[J]. Na-ture， 1998，392(5):86-90.
, 百拇医药
[4]Cella M, Sallusto F, Lanzavecchia A. Origin mataration and antigen presenting function of dendritic cells[J]. Curr Opin Immunol，1997,9(1):10-16.
[5]Schuler G, Thumer B, Romani N. Dendritic cell: from ignored cell to major players in T-cell-mediated immunity[J]. Int Arch Allergy Immunol， 1997,112(4) :317-322.
[6]Thomas T, Walter J, Storkus M, et al. Gene-based strategies for the immunotherapy of cancer[J]. J Mol Med，1997，75(3):478-481.
, 百拇医药
[7]Peters J H, Gieseler R, Thiele B, et al. Dendritic cells: from ontogenetic orphans to myelomonocytic descendants[J]. Im-munology Today， 1996,17(6) :273- 278.
[8]Rammensce H G. Chemistry of peptides associated with MHC class I and II molecules[J]. Curr Opin Immunol，1995, 7(1):85-96.
[9]Falk K, Rotzschke O. Consensus motifs and peptide ligands of MHC class I molecules[J]. Semin Immunol, 1993,5(2):81-94.
[10]Watts C. Capture and processing of exogenous antigens for pre-sentation on MHC molecules[J]. Annu Rev Immunol，1997,15(7):821-825.
收稿日期：1999-07-19；修回日期：1999-12-22, 百拇医药
单位：吴刚(第三军医大学附属西南医院肝胆外科中心，重庆400038)；韩本立(第三军医大学附属西南医院肝胆外科中心，重庆400038)；裴雪涛(第三军医大学军事医学科 学院放射医学研究所实验血液研究室，北京100850)
关键词：树突状细胞；单核细胞；粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子；白细胞介素4；细胞凋亡；凋亡小体
第三军医大学学报000213
提要 目的：建立从人外周血诱导扩增树突状细胞(DC)及其从凋亡癌细胞提呈抗原的方法。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞，加入50ng/mlhGM-CSF，1 000ng/mlhIL-4,隔天1次，共4次，培养第3天，加入γ射线 照射过的胆管癌细胞，再继续体外培养1周后，用树 突状细胞富集柱收集DC。结果：DC高表达共刺激分子B7和 CD1a,表面具有典型不规则突起，DC捕捉凋亡小体、吞噬 凋亡小体，负载抗原的DC其激发同种异体T淋巴细胞增 殖的能力进一步增强。结论：用GM-CSF加IL-4能从人外周血诱导、扩增出DC，并可以有效提呈凋亡胆管癌 细胞的抗原，可望成为有效的肿瘤抗原装载DC的新途径。
, 百拇医药
中图法分类号R329.24;R329.25;R735.8 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0142-04
Acquirement of antigen from apoptotic cells by human dendritic cells from peripheral blood
WU Gang, HAN Ben-li,PEI Xue-tao
(Department of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
Abstract Objective: To seek an efficient way of antigen acquirement from apoptotic cells by human dendritic cells (DC) from peripheral blood. Methods: We obtained DC from peripheral blood monocytes maintaining the antigen capturing and processing capacity by using granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4). Then the immature DC and apoptotic hepatocholangioma cells were cocultured for 7 d. Results: These cells have typical dendritic morphology and express high levels of CD1a and B7. Furthermore, they acquire antigen from apoptotic cells and induce and increased T cell stimulatory capacity in MLR. Conclusion: We established DC from blood monocytes using GM-CSF and IL-4. DC can efficiently acquire antigen derived from apoptotic cells and induce increase of T cells.
, 百拇医药
Key words dendritic cell; monocyte; granulocyte/ macrophage colony-stimulating factor;interleukin 4; apoptosis; apoptotic body
树突状细胞(Dendritic cells,DC)在抗原提呈方面起着重要的 作用。树突状细胞的分化发育过程存在二个不同的 阶段，作为未成熟的DC，具有摄取、处理抗原的能力 ，一旦发育为成熟DC，抗原捕获能力丧失，变成刺激 静息淋巴细胞激活初次免疫反应的免疫抗原递呈细 胞。早在90年代初，就有报道[1，2]DC具有胞饮能力和 表达FcγRII,因而具有捕获抗原的能力。最新研究发现[3]，包裹在凋亡小体外面的膜性物质是一种与原生存 细胞膜相一致的免疫原性物质，凋亡小体膜携带的 抗原能被DC的MHC-I分子所提呈。许多证据表明抗肿瘤 免疫机制失能不是由于缺乏肿瘤抗原而是由于这些 抗原不能有效提呈给T细胞产生特异性的免疫反应之 故。本研究进行了人外周血树突状细胞体外诱导扩 增及鉴定，DC提呈凋亡肿瘤细胞抗原的实验研究。目 的是通过DC吞噬凋亡小体获取肿瘤细胞抗原来阻止肿 瘤细胞免疫逃避，从而激发机体的自身免疫力，为 探索DC在肿瘤主动特异性免疫治疗中的重要作用打下 基础。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 γ-射线照射源：军事医学科学院放 射医学研究所60Co源，剂量率2.07～2.23Gy/min；淋巴细胞分 离液M450：英国进口分装，上海化学试剂厂；CD2、CD19 MagneticBeads磁性分离试剂盒：Coulter公司；鼠抗人单克隆 荧光抗体CD1a(PE)、B7(FITC)：Pharmingen公司；培养基( IMDM)：GibcolBrl公司。
1.1.2 细胞株 QBC939胆管癌细胞株由第三军医大学西南医 院王曙光博士惠赠。
1.2 方法
1.2.1 人外周血定向诱导分化和培养树突状细胞人外 周血肝素抗凝，4∶1比例与0.5%甲基纤维素混匀静置 约30min，将红细胞自然沉降至界限分明。收集吸出上 层(上清)有核细胞部分，Ficoll-Paque分离获取单个核 细胞，CD2、CD19免疫磁珠去除T、B淋巴细胞，制成1× 105/ml细胞悬液备用。24孔培养板每孔加1mlIMDM培养基， 37°C、5%CO2及饱和湿度的条件下，每孔单核细胞的初 始浓度2×104/ml，细胞因子GM-CSF50ng/ml、IL-4 1000ng/ml每48 h加入培养体系1次，连续4次，1周半量换液。
, 百拇医药
1.2.2 凋亡胆管癌细胞制备 取5×106胆管癌细胞4Gy照射6 h使细胞凋亡。
1.2.3 树突状细胞吞噬凋亡小体提呈抗原 IMDM培养基，37°C、5%CO2及饱和湿度的条件下，从人外周血定向诱 导分化和培养树突状细胞并在培养的第3天DC和凋亡胆 管癌细胞共培养，为了证明凋亡是抗原交叉提呈中 的重要环节，设计了DC和坏死胆管癌细胞共培养组( 胆管癌细胞加入低渗盐水在37°C、5%CO2及饱和湿度的 条件下培养30min)以及正常培养的胆管癌细胞，共培 养7d后，收集DC备用。
1.2.4 电镜观察于培养第11天收集共培养的DC用PBS洗涤2次 ，4%戊二醛固定后，PBS洗1次，制成悬液滴片，1%锇 酸固定，梯度酒精脱水，扫描电镜观察摄片。另取分化成熟的DC悬液离心，细胞沉淀用4%戊二醛固定及 1%锇酸固定，梯度酒精脱水，经超薄切片铅铀染色后透射电镜观察摄片。
1.2.5 DC的免疫刺激活性及负载抗原后的免疫刺激活性 从外周血单核细胞诱导、分化获得的DC分别以1×103/孔 ，5×103/孔，1×104/孔加入96孔圆底培养板，用单核细胞 作对照组，每组各3个复孔，每孔再加入同种T细胞1× 105，终体积为200μl,37°C、5%CO2及饱和湿度的条件下。 培养96h，于检测前18h加H3-TdR0.5μCi/孔。收集细胞， 液闪计数检测cpm值，结果用3孔平均值表示。我们也 检测了负载抗原后DC的免疫刺激活性，3组DC(受凋亡 胆管癌细胞刺激、坏死胆管癌细胞刺激、正常培养 的胆管癌细胞刺激)也作了比较。
, 百拇医药
2 结果
2.1 具有抗原递呈能力的DC体外培养
去除T、B细胞后的外周血单核细胞，加入在IMDM培养 基中，GM-CSF50ng/ml,IL-41000ng/ml48h1次，培养7d后，大 部分细胞悬浮不贴壁，形态不规则，相差显微镜可 见伸展的大量毛刺，为典型DC形态，见图1。表面标志 分析，大量细胞是均质的并高表达CD1a和B7，见图2。透 射电镜见DC伸展的突起，胞浆富含线粒体，见图3。
图1 DC体外 培养第7天的形态(×500)
Fig1 Typical appearance of DC cultured on 7th day(×500)
, http://www.100md.com
图2 培养第7天DC表型检测
Fig2 Surface phenotype of DC on 7th day of culture
图3 透射电镜下的树突状细胞(×7600)
Fig3 DC under transmission electron microscopy(×7600)
2.2 未成熟DC吞噬凋亡小体从凋亡胆管癌细胞提呈抗 原
与凋亡胆管癌细胞共培养的DC胞浆内可见吞噬的凋 亡小体，而与坏死胆管癌细胞共培养的DC胞浆内未见 吞噬的凋亡小体，见图4。
, http://www.100md.com
图4透射电镜显示DC吞噬凋亡小体(×7600)
Fig4 Transmission electron microscopy revealed apoptotic body in the cytoplasm of DC(×7600)
2.3 DC的
我们检测从外周血单核细胞分化、诱导的DC对T淋巴 细胞的刺激活性，也检测了提呈抗原后DC的免疫刺激 活性，并对分别受凋亡胆管癌细胞刺激、坏死胆管 癌细胞刺激和培养胆管癌细胞刺激的DC其免疫刺激活 性作了比较，见表1。结果表明，同种异体混合淋巴 细胞反应时，少量DC即可强烈激发T淋巴细胞的增殖， 在抗原负载DC后，其激发能力进一步增强(p<0.05)，见表1。而对照组由于是单核细胞而非DC，故并不能有效激发T淋巴细胞的增殖。
表1 DC的免疫刺激活性及其提呈抗原后的免疫刺激活性(min-1)
, http://www.100md.com
Tab1 Immuno-stimulating activity of DC before and after antigen acquirement(min-1)
Dose of DC
Allo MLR
Control(Monocyte)104
951±31
DC(Without any coculture with cancer cell)
103
1721±224*
, http://www.100md.com
5×103
2414±120*
104
2688±190*
DC(Cocultured with apoptotic cancer cell)
103
4597±189**
5×103
5695±240**
, 百拇医药
104
6805±127**
DC(Cocultured with necrosis cancer cell)
103
1775±172*
5×103
2436±223*
104
2681±245*
, 百拇医药 DC(Cocultured with cancer cell)
103
1749±230*
5×103
2413±231*
104
2715±267*
*:P<0.05 vs control;**:P<0.05 DC(Cocultured with apoptotic cancer cell) vs other groups
, 百拇医药
3 讨论
一般地讲，抗原提呈细胞被分为二类：专职的抗原 提呈细胞和非专职的抗原提呈细胞。非专职抗原提呈细胞不属于淋巴系统内的细胞，而专职抗原提呈 细胞，如树突状细胞、巨噬细胞(Macrophages,Mφ)和B细胞 ，则是免疫系统中不可缺少的重要组成部分。尽管 他们都有消化、处理和提呈抗原的共同特点，但是DC却在免疫系统中扮演了一个重要的角色,它是最有效的 专职抗原提呈细胞，能在体内激活静息T细胞，从而激发初次免疫反应。如果肿瘤抗原未被DC提呈就不能 激发有效的抗肿瘤免疫[4，5]。已有的研究证明[6]，在肿瘤患者体内存在肿瘤细胞逃避DC抗原提呈的机制。
DC可以从人不同组织的DC前体(如骨髓、脐带血和外 周血)加上不同的造血细胞因子组合的刺激而诱导、分化成熟。目前，在体外检测DC的重要标准有：CD1a,CD40,CD80,CD86和MHC-Ⅱ,以及刺激同种异体T细胞增殖的 混合淋巴细胞反应的能力[7]。
, 百拇医药
传统的MHC抗原的加工和提呈途径是：大多数MHC-Ⅰ提呈的多肽来自细胞内抗原酶解(主要由蛋白酶体 在胞质溶胶中酶解)成短肽(8～12aa)，再由抗原肽 转送者转送到粗面内质网与新生MHC-Ⅰ类分子重链和 β2-微球蛋白形成三聚体复合物，然后在细胞表面 被CD8+T细胞识别。而MHC-Ⅱ对细胞外抗原的加工和提 呈是通过细胞外抗原被APC内噬后在内室(Endocytic compartments)酸变性，内体(Endosomal)及溶酶体酶解成1条12～25aa的短肽并与内质网中合成后运来的MHC-Ⅱ类分子结合，再转运到APC表面为CD4+TH细胞识别[8，9]。最新研究[3]发现，包裹在凋亡小体外面的膜性物质是一 种与原生存细胞膜相一致的免疫原性物质，当凋亡小体被DC吞噬后，包裹在凋亡小体外面的免疫原性物 质就将抗原递呈给DC，通过MHC-I提呈凋亡肿瘤细胞抗原，刺激MHC-I限制的CTL。
本研究发现并证实了DC而非单核细胞可以有效提呈 凋亡胆管癌细胞的抗原(坏死胆管癌细胞和培养的 胆管癌细胞却不能有效地传递抗原给DC)，刺激MHC-I限制的CTLs[10]。
, 百拇医药
众所周知，通过肿瘤的常规疗法(手术、放疗、化疗)往往难以获得根治，难于解决转移和复发的问题，且常有明显的损伤和毒副作用，如能激发、增强机体对肿瘤的主动免疫排斥反应，则有可能达到根治肿瘤的目的，而且这在本质上属于一种生理性 治疗措施。那么，在体内应该能建立类似于体外定向诱导分化DC和诱导肿瘤细胞凋亡的可控条件，获得大量高纯度的DC及体内诱导的能传递抗原给DC的肿瘤细胞凋亡小体，通过DC提呈抗原诱导特异性CTLs进行主动特异性免疫抗肿瘤治疗，将在肿瘤的免疫治疗上创造出较好的效果，这是值得我们进行深入研究、开发和应用的领域。
基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目(3982511)
作者简介：吴刚(1962.11)，男，重庆市人，博士，主治医师，讲师，主要从事树突细胞临床应用方面的研究，发表论文6篇。电话：(023)65335972
参考文献
, http://www.100md.com
[1]Levine T P, Chain B M. Endocytosis by antigen presenting cells: Dendritic cells are as endocytically active as other antigen pre-senting cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1992, 89(17):8 342-8 346.
[2]Girclomoni G, Simon J C, Bergstresser P R，et al. Freshly iso-lated spleen dendritic cells and epidermal Langerhans cells un-dergo similar phenotypic and functional changes during short-term culture[J].J Immunlo，1990,145(7):2 820-2 825.[3]Matthew L,Albert B S, Nina B. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs[J]. Na-ture， 1998，392(5):86-90.
, 百拇医药
[4]Cella M, Sallusto F, Lanzavecchia A. Origin mataration and antigen presenting function of dendritic cells[J]. Curr Opin Immunol，1997,9(1):10-16.
[5]Schuler G, Thumer B, Romani N. Dendritic cell: from ignored cell to major players in T-cell-mediated immunity[J]. Int Arch Allergy Immunol， 1997,112(4) :317-322.
[6]Thomas T, Walter J, Storkus M, et al. Gene-based strategies for the immunotherapy of cancer[J]. J Mol Med，1997，75(3):478-481.
, 百拇医药
[7]Peters J H, Gieseler R, Thiele B, et al. Dendritic cells: from ontogenetic orphans to myelomonocytic descendants[J]. Im-munology Today， 1996,17(6) :273- 278.
[8]Rammensce H G. Chemistry of peptides associated with MHC class I and II molecules[J]. Curr Opin Immunol，1995, 7(1):85-96.
[9]Falk K, Rotzschke O. Consensus motifs and peptide ligands of MHC class I molecules[J]. Semin Immunol, 1993,5(2):81-94.
[10]Watts C. Capture and processing of exogenous antigens for pre-sentation on MHC molecules[J]. Annu Rev Immunol，1997,15(7):821-825.
收稿日期：1999-07-19；修回日期：1999-12-22, 百拇医药