人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶C端片段在大肠杆菌中的表达及其抗体的制备
作者：叶治家 程天民 江智红 李伯良
单位：叶治家(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室)；程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；江智红(第三军医大学中国科学院生物化学研究所，上海200031)；李伯良(第三军医大学中国科学院生物化学研究所，上海200031)
关键词：酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶；羧基端片段；融合表达；抗体
第三军医大学学报000201
提要 目的：为了表达人ACATC端片段并制备其抗体。方法：将编码人ACAT羧基端包含第二跨膜(463-550氨基酸 残基)的cDNA片断克隆至不同的大肠杆菌表达载体中，构建了系列表达质粒，并在多种大肠杆菌中进行了表达研究。结果：在详细探索表达条件的基础上，经温敏诱导，成功地在大肠杆菌AR68中表达了N端融合 ProteinABCdomain的人ACAT羧基末端包含第二个跨膜区的片段 ，表达量约20mg/L菌液。通过优化纯化条件，经Sepharose4B-IgG亲和层析柱分离纯化得到表达产物，并制备获得其 阳性抗血清。结论：这些工作为进一步表达完整的 ACAT蛋白、研究ACAT基因表达调控及其结构与功能的关系奠定了基础。
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中图法分类号R378.2+1;R394.3 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0101-05
Expression of human ACAT C-terminal fragment in E. coli and preparation of
its antiserum
YE Zhi-jia, CHENG Tian-min, JIANG Zhi-hong, LI Bo-liang
(Department of (Radiation Medicine, Faculty of Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
, http://www.100md.com
Abstract Objective: To express ACAT C-terminal fragment containing the membrane anchoring region 2 (ACATc) and prepare its antiserum. Methods: The gene encoding ACATc was cloned into vector pBLPAV7. Then the plasmid pBLPAV7-ACATc was transferred into E. coli strain AR68. Results: The expressed product of ACARc fused with BC domains of protein A (PABC ACATc) was detected and purified by the affinity chromatography with Sepharose 4B-IgG column respectively. Conclusion: The antiserum against ACATc was prepared and can be used for the immunoassay of recombinant or natural ACAT.
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Key words acyl-coA; cholesterol acyltransferase; C-terminal fragment; fusion expression; antibody
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(Acyl-coenzymeA： cholesterolacyltransferase，ACAT；EC2.3.1.26)催化胆固醇与长链脂 肪酸形成胆固醇酯。ACAT在体内胆固醇的吸收、运输 、贮存等过程中发挥极其重要的作用，是调节体内 胆固醇代谢平衡的关键酶之一[1]。遗传及细胞生物学 实验表明，高胆固醇血症引起动脉管壁ACAT活性升高，导致巨噬细胞内胆固醇酯大量堆积，形 成泡沫细胞，是动脉粥样硬化症发生的早期事件[2]； ACAT突变可能导致智力低下。因此，对ACAT的研究越来 越引起重视。ACAT的概念早在1958年就被提出来了，其 在细胞内主要分布在粗面内质网膜上，且含量极低 ，遇去垢剂易失活，分离纯化极其困难[3]。使得对 ACAT的研究，多年来停留在细胞水平。1993年美国Dartmouth医 学院T.Y.Chang实验室，利用ACAT缺陷的突变CHO细胞株AC29克 隆了人ACAT的cDNA[4]，从而把ACAT的研究带入分子水平。 Chang[1]用抗ACATN端的抗体，经Westernblotting分析，检测ACAT在 体内的分布，结果出现分子量约45×103u单一的条带[5]，明显小 于理论分子量65×103u，这是否存在C端缺失还不得而知 。有实验结果表明ACATknockout小鼠，其成纤维细胞、巨 噬细胞以及肾上腺组织中胆固醇酯的合成明显减少 ，提示在这些组织细胞中，ACAT在其胆固醇酯合成过 程中起重要作用。但在肝脏胆固醇酯的合成基本不 受影响，并且体内糖皮质激素的水平也无明显变化 。表明在小鼠体内存在具有ACAT样活性的其它酶蛋白 分子。计算机分析得知，在已知的cDNA库中找到多种 与ACATC端具有同源结构的序列[6]。因此，重组表达ACAT C端片段并制备相应的抗体，对研究ACAT结构与功能的 关系以及寻找ACAT的同工酶或类似物有十分重要的意 义。目前，有关ACAT的C端表达及其抗体制备均未见有 文献报道。我们在进行大量表达及纯化条件摸索的 基础上，在大肠杆菌中成功表达了与葡萄球菌蛋白A BCdomain(ProteinABC,PABC)融合、包含第二个跨膜区的ACATC端片 段(PABC-ACATc)，经亲和层析纯化得到表达产物。再 用纯化的表达产物免疫大白兔制备了相应的抗血清 。
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1 材料与方法
1.1 质粒、菌种
包含人ACATcDNAK1的质粒pACAT15L由美国Dartmouth医学院T.Y.Chang实 验室惠赠；表达载体pMFLV3、pBLPAV7、pBLSPV3及大肠杆菌 BL21(DE3)、MC1061、AR68、RR1等均由中国科学院生物化学研究 所220组保存。
1.2 酶、化学试剂
DNA限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶购自Biolabs,丙烯 酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)为Fluka产品 ，PMSF购自BoehringerMannhein，Sephrose4B-IgG本实验室自制，新 西兰大耳兔购自中科院实验动物中心，其它试剂均 为进口或国产分析纯。
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1.3 细菌培养、质粒抽提、酶切反应、DNA电泳鉴定及 回收、连接反应、质粒转化
按文献[7]进行。
1.4 蛋白质分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按Laemmli[8]方法进行。
1.5 Westernblotting分析
按本实验室常规方法进行。
1.6 外源基因的表达
重组表达质粒转化大肠杆菌AR68,接种单个菌落于 2LB/AP培养液,32℃培养过夜，取过夜菌按20%接种量接 种于新鲜2LB/AP培养液，32℃培养2～3h，再在42℃继续培 养1、2、3、4、5h，进行温敏诱导表达，取样测OD600值 ，离心收集菌体，按每0.1OD菌加10μl水及等体积的SDS- PAGE上样缓冲液(2倍母液)悬浮菌体，煮沸5min，取20 μl进行SDS-PAGE电泳分析，鉴定有无表达。
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1.7 表达产物溶解性分析
收集表达菌，按每0.1OD菌加5μl缓冲液A(20mmol/LTris· HClpH7.8,2mmol/LEDTA,1mmol/LPMSF)悬浮细菌，超声波破菌，15000 r/min,4°C,离心15min，严格分离上清和沉淀，上清中加入 等体积的SDS-PAGE上样缓冲液(2倍母液)，沉淀悬浮 在与上清等体积的水及SDS-PAGE上样缓冲液(2倍母液 )中，煮沸5min，分别取20μl样品上样进行SDS-PAGE分析 ，确定表达产物的溶解性。
1.8 表达产物的纯化
收集50ml表达菌，将其悬浮于2ml缓冲液A中，超声破 菌，用等体积的缓冲液A稀释，18000r/min(4°C)离心20min， 保留上清。取约150μlSepharose4B-IgG树脂，预先用缓冲 液A(bufferA)平衡，将破菌上清与树脂混旋(4℃)2h，按 生化所220组常规方法进行亲和层析，以bufferA代替PBS， 收集最后一步洗脱液，-80℃冻结，冷冻干燥，取样 进行SDS-PAGE分析。
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1.9 抗体制备
取冷冻干燥样品2mg溶解在bufferA中，进行SDS-PAGE电泳 ，挖胶取表达产物条带，置-80℃30min，低温下磨碎 ，用bufferA(不含PMSF)悬浮，与等体积的佛氏完全佐 剂乳化。按常规方法免疫新西兰大耳兔，初次免疫 后1、2个月各加强免疫1次。
1.10 抗体特异性分析
取全菌蛋白电泳样品，用SDS-PAGE上样缓冲液稀释20倍 ，取20μl样品进行SDS-PAGE，用制备的抗体按常规方法 进行Westernblotting分析。
2 结果
2.1 表达质粒的构建
表达质粒pBLPAV7和pBLPAV8是在PLPromoter控制下的系列高效 融合表达载体，表达产物N-端融合ProteinABCdomain,便于 用IgG固相柱亲和纯化。为了校正阅读框架，先用EcoRⅠ 和HindⅢ从包含全长ACATcDNA的质粒中切出表达ACAT第二跨 膜及C端cDNA的片段(266bp)，补平后与经SmaI酶切的表达 载体pBLPAV8连接，筛选获得重组质粒pBLPAV8-ACATC；再用 EcoRⅠ和BamHⅠ从pBLPAV8-ACATC切出约266bp的DNA片段，与用EcoRⅠ 和BamHⅠ酶切的表达载体pBLPAV7连接，获得ACATC融合表达 质粒pBLPAV7-ACATC。构建流程见图1。
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图1ACATc表达质粒的构建
Fig1ConstructionofexpressionplasmidpBLPAV7-ACATc
2.2 融合ProteinABCdomain的ACATC端片段在E.coliAR68中的表达
将构建的表达质粒转化到不同的表达菌中，进行表 达研究，仅观察到pBLPAV7-ACATC表达质粒转化在AR68菌株 中有相应的表达条带，分子量约27×103u(与理论推算值 相符)。从诱导时间看，42°C诱导1h就能观察到表达条 带，且表达量最高，表达量约占全菌蛋白的1%(20mg/L)。 其后表达量减少见图2。
图2 ACATc表达产物SDS-PAGE分析
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Fig2 SDS-PAGE analysis of the expression products from AR68 harboring the plasmid pBLPAV7-ACATc
Lane1：Total bacterial proteins from cellsincubated at 32℃;
Lane2～6：Total bacterial proteins from cells incubated at42℃ for 1,2,3,4,5 hours;
Lane7：Protein molecular weight marker
2.3 表达产物的可溶性分析及其纯化
可溶性分析表明，表达产物约20%为可溶性蛋白。 根据表达产物N端融合有ProteinABCdomain的特点，用Sepharose 4B-IgG亲和层析纯化表达产物。表达产物极不稳定， 纯化的样品中有明显的降解条带。按常规的方法纯 化，几乎得不到表达产物,纯化样品主要为降解产物 (结果未列出)。为了抑制表达产物的降解，诱导表达 结束后，立即在菌液中加入蛋白酶抑制剂PMSF，终浓 度为2mmol/L，并置冰浴30min。在其后的操作过程中，以 缓冲溶液A代替PBS缓冲溶液。这样，表达产物降解的 现象被明显抑制。经亲和层析，可得到纯度达50%的 表达产物见图3。
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图3 ACATc表达产物经Sepharose 4B-IgG亲合层析后纯化样品的SDS-PAGE分析
Fig3 SDS-PAGE analysis of the expression products purified by Affinity Chromatography with Sepharose 4B-IgG column
Lane1：Total bacterial proteins from cells incubated at 32℃;
Lane2：Total bacterial proteins from cells incubated at 42℃；
Lane3：Pellet of expressed bacteria;
Lane4：Supernatant of expressed bacteria;
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Lane5：Purified protein;
Lane6：Protein molecular weight marker
2.4 ACATc抗体的制备及特异性分析
通过SDS-PAGE纯化得到表达产物PABC-ACATc,免疫大白兔 ，制备获得阳性抗血清，抗体稀释滴定为1：2650。利 用该抗血清，经Westernblotting方法检测全菌蛋白样品， 发现仅温敏诱导的、表达ACATc的细菌中存在相应的表 达产物条带及其降解产物条带，且42°C诱导1h表达量 最高，其后表达量减少，见图4。这些结果与全菌蛋 白的SDS-PAGE结果相一致。说明所获得的抗血清有很强 的专一性。用该抗血清检测ACAT在哺乳细胞分布的结 果将另文报道。
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图4 Western blotting分析
Fig4 Western blotting of expression products from AR68 harboring the plasmid pBLPAV7-ACATc Notes as in Fig 1
3 讨论
ACATcDNA编码550氨基酸残基，其中60%以上为疏水氨基 酸，疏水性极强，表达产物不易形成正确的折叠， 极易被水解。我们在表达完整ACAT分子未得结果的情 况下，将ACATC端包含第二个跨膜区的ACATC端片段与亲 水性较强的ProteinABCdomain进行融合表达，目的是增强表 达产物的稳定性，提高表达量。结果在蛋白酶缺陷 的AR68菌株中获得成功表达了PABC-ACATc。从诱导时间看 ，温敏诱导1h就能观察到表达条带，且表达量最高，表达量约占全菌蛋白的1%，其后表达量减少。从 Westernblotting结果分析，温敏诱导后，在表达菌中表达 产物的表达与降解并存。通常情况下，诱导表达后3～ 5h表达量最高。而表达产物PABC-ACATc温敏诱导1h，表达 量最高。这可能是因为温敏诱导后，随着时间的延 长，细菌中受HSP调节的蛋白酶被诱导，表达产物PABC-ACATc不稳定，易受蛋白酶攻击，被降解。因此，随着 时间的延长，表达产物的量逐渐减少。曾试图用蛋 白酶抑制剂抑制表达过程中的降解，但加入蛋白酶 抑制剂后表达亦被抑制(结果未列出)。根据表达 产物N端融合有ProteinABCdomain的特点，用Sepharose4B-IgG亲和 层析纯化表达产物[9]。按常规的方法纯化，几乎得不 到表达产物,纯化样品主要为降解产物(结果未列出)。 经过一系列纯化条件的摸索后，在纯化过程中加入 高浓度广谱的蛋白酶抑制剂PMSF、EDTA可有效防止表达产物的降解，纯化获得表达产物PABC-ACATc,并制备了相 应的抗体。这些工作为进一步重组表达完整的ACAT蛋白分子积累了经验，为进一步在蛋白水平研究ACAT的 表达调控、结构与功能的关系以及寻找ACAT的同工酶或类似物打下基础。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39425005)
作者简介：叶治家(1962.12)，男，湖北省黄岗市人，博士，讲师，主要从事真核基因表达调控的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68752261
参考文献
[1] Chang T Y, Chang Catherine C Y, Cheng D. Acyl coenzyme A:Cholesterol acyltransferase[J]. Annu Rev Biochem,1997, 66: 613- 625.
[2] Vardiella L, Michael S B, Goslden M. Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications for cholesterol deposition in atherosclerosis[J]. Annu Rev Biochem,1983,52:223-245.
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[3] Doolittle G M, Chang T Y. Solubilization, partial purification and reconstitution in phosphatidylcoline cholesterol liposomes of acylcoA: chrosterol acyltransferase[J]. Biochmistry, 1982, 21 (1):674-681.
[4] Chang Catherine C Y, Chen J, Chnag T Y. Molecular cloning and functional expression of human acylcoenzyme A: cholesterol acyltransferase cDNA in mutant Chinese hamster overy cells[J].J Biol Chem,1993,268(28):20 747-20 755.
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[5] Chang Catherine C Y, Chen J, Thomas M.Regulation and immunolocalization of acyl- coenzyme A: cholesterol acyltransferase in mammalian cells as studied with specific antibodies[J]. J Biol Chem，1995,270(1):1-7.
[6] Meiner V L，Cases S, Myers H M, et al. Disruption of acyl coenzyme A:cholesterol acyltransferase gene in mouse[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1996,93(23):14 041-14 046.
[7] Sambrook J, Fritsch E F, Mariatis T. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Press,1989.58-249.
[8] Leammli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature (London),1970,227 (2):680-686.
收稿日期：1999-05-20；修回日期：1999-07-15, http://www.100md.com
单位：叶治家(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室)；程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所；重庆400038)；江智红(第三军医大学中国科学院生物化学研究所，上海200031)；李伯良(第三军医大学中国科学院生物化学研究所，上海200031)
关键词：酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶；羧基端片段；融合表达；抗体
第三军医大学学报000201
提要 目的：为了表达人ACATC端片段并制备其抗体。方法：将编码人ACAT羧基端包含第二跨膜(463-550氨基酸 残基)的cDNA片断克隆至不同的大肠杆菌表达载体中，构建了系列表达质粒，并在多种大肠杆菌中进行了表达研究。结果：在详细探索表达条件的基础上，经温敏诱导，成功地在大肠杆菌AR68中表达了N端融合 ProteinABCdomain的人ACAT羧基末端包含第二个跨膜区的片段 ，表达量约20mg/L菌液。通过优化纯化条件，经Sepharose4B-IgG亲和层析柱分离纯化得到表达产物，并制备获得其 阳性抗血清。结论：这些工作为进一步表达完整的 ACAT蛋白、研究ACAT基因表达调控及其结构与功能的关系奠定了基础。
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中图法分类号R378.2+1;R394.3 文献标识码A
文章编号：1000-5404(2000)02-0101-05
Expression of human ACAT C-terminal fragment in E. coli and preparation of
its antiserum
YE Zhi-jia, CHENG Tian-min, JIANG Zhi-hong, LI Bo-liang
(Department of (Radiation Medicine, Faculty of Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038)
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Abstract Objective: To express ACAT C-terminal fragment containing the membrane anchoring region 2 (ACATc) and prepare its antiserum. Methods: The gene encoding ACATc was cloned into vector pBLPAV7. Then the plasmid pBLPAV7-ACATc was transferred into E. coli strain AR68. Results: The expressed product of ACARc fused with BC domains of protein A (PABC ACATc) was detected and purified by the affinity chromatography with Sepharose 4B-IgG column respectively. Conclusion: The antiserum against ACATc was prepared and can be used for the immunoassay of recombinant or natural ACAT.
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Key words acyl-coA; cholesterol acyltransferase; C-terminal fragment; fusion expression; antibody
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(Acyl-coenzymeA： cholesterolacyltransferase，ACAT；EC2.3.1.26)催化胆固醇与长链脂 肪酸形成胆固醇酯。ACAT在体内胆固醇的吸收、运输 、贮存等过程中发挥极其重要的作用，是调节体内 胆固醇代谢平衡的关键酶之一[1]。遗传及细胞生物学 实验表明，高胆固醇血症引起动脉管壁ACAT活性升高，导致巨噬细胞内胆固醇酯大量堆积，形 成泡沫细胞，是动脉粥样硬化症发生的早期事件[2]； ACAT突变可能导致智力低下。因此，对ACAT的研究越来 越引起重视。ACAT的概念早在1958年就被提出来了，其 在细胞内主要分布在粗面内质网膜上，且含量极低 ，遇去垢剂易失活，分离纯化极其困难[3]。使得对 ACAT的研究，多年来停留在细胞水平。1993年美国Dartmouth医 学院T.Y.Chang实验室，利用ACAT缺陷的突变CHO细胞株AC29克 隆了人ACAT的cDNA[4]，从而把ACAT的研究带入分子水平。 Chang[1]用抗ACATN端的抗体，经Westernblotting分析，检测ACAT在 体内的分布，结果出现分子量约45×103u单一的条带[5]，明显小 于理论分子量65×103u，这是否存在C端缺失还不得而知 。有实验结果表明ACATknockout小鼠，其成纤维细胞、巨 噬细胞以及肾上腺组织中胆固醇酯的合成明显减少 ，提示在这些组织细胞中，ACAT在其胆固醇酯合成过 程中起重要作用。但在肝脏胆固醇酯的合成基本不 受影响，并且体内糖皮质激素的水平也无明显变化 。表明在小鼠体内存在具有ACAT样活性的其它酶蛋白 分子。计算机分析得知，在已知的cDNA库中找到多种 与ACATC端具有同源结构的序列[6]。因此，重组表达ACAT C端片段并制备相应的抗体，对研究ACAT结构与功能的 关系以及寻找ACAT的同工酶或类似物有十分重要的意 义。目前，有关ACAT的C端表达及其抗体制备均未见有 文献报道。我们在进行大量表达及纯化条件摸索的 基础上，在大肠杆菌中成功表达了与葡萄球菌蛋白A BCdomain(ProteinABC,PABC)融合、包含第二个跨膜区的ACATC端片 段(PABC-ACATc)，经亲和层析纯化得到表达产物。再 用纯化的表达产物免疫大白兔制备了相应的抗血清 。
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1 材料与方法
1.1 质粒、菌种
包含人ACATcDNAK1的质粒pACAT15L由美国Dartmouth医学院T.Y.Chang实 验室惠赠；表达载体pMFLV3、pBLPAV7、pBLSPV3及大肠杆菌 BL21(DE3)、MC1061、AR68、RR1等均由中国科学院生物化学研究 所220组保存。
1.2 酶、化学试剂
DNA限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶购自Biolabs,丙烯 酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)为Fluka产品 ，PMSF购自BoehringerMannhein，Sephrose4B-IgG本实验室自制，新 西兰大耳兔购自中科院实验动物中心，其它试剂均 为进口或国产分析纯。
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1.3 细菌培养、质粒抽提、酶切反应、DNA电泳鉴定及 回收、连接反应、质粒转化
按文献[7]进行。
1.4 蛋白质分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按Laemmli[8]方法进行。
1.5 Westernblotting分析
按本实验室常规方法进行。
1.6 外源基因的表达
重组表达质粒转化大肠杆菌AR68,接种单个菌落于 2LB/AP培养液,32℃培养过夜，取过夜菌按20%接种量接 种于新鲜2LB/AP培养液，32℃培养2～3h，再在42℃继续培 养1、2、3、4、5h，进行温敏诱导表达，取样测OD600值 ，离心收集菌体，按每0.1OD菌加10μl水及等体积的SDS- PAGE上样缓冲液(2倍母液)悬浮菌体，煮沸5min，取20 μl进行SDS-PAGE电泳分析，鉴定有无表达。
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1.7 表达产物溶解性分析
收集表达菌，按每0.1OD菌加5μl缓冲液A(20mmol/LTris· HClpH7.8,2mmol/LEDTA,1mmol/LPMSF)悬浮细菌，超声波破菌，15000 r/min,4°C,离心15min，严格分离上清和沉淀，上清中加入 等体积的SDS-PAGE上样缓冲液(2倍母液)，沉淀悬浮 在与上清等体积的水及SDS-PAGE上样缓冲液(2倍母液 )中，煮沸5min，分别取20μl样品上样进行SDS-PAGE分析 ，确定表达产物的溶解性。
1.8 表达产物的纯化
收集50ml表达菌，将其悬浮于2ml缓冲液A中，超声破 菌，用等体积的缓冲液A稀释，18000r/min(4°C)离心20min， 保留上清。取约150μlSepharose4B-IgG树脂，预先用缓冲 液A(bufferA)平衡，将破菌上清与树脂混旋(4℃)2h，按 生化所220组常规方法进行亲和层析，以bufferA代替PBS， 收集最后一步洗脱液，-80℃冻结，冷冻干燥，取样 进行SDS-PAGE分析。
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1.9 抗体制备
取冷冻干燥样品2mg溶解在bufferA中，进行SDS-PAGE电泳 ，挖胶取表达产物条带，置-80℃30min，低温下磨碎 ，用bufferA(不含PMSF)悬浮，与等体积的佛氏完全佐 剂乳化。按常规方法免疫新西兰大耳兔，初次免疫 后1、2个月各加强免疫1次。
1.10 抗体特异性分析
取全菌蛋白电泳样品，用SDS-PAGE上样缓冲液稀释20倍 ，取20μl样品进行SDS-PAGE，用制备的抗体按常规方法 进行Westernblotting分析。
2 结果
2.1 表达质粒的构建
表达质粒pBLPAV7和pBLPAV8是在PLPromoter控制下的系列高效 融合表达载体，表达产物N-端融合ProteinABCdomain,便于 用IgG固相柱亲和纯化。为了校正阅读框架，先用EcoRⅠ 和HindⅢ从包含全长ACATcDNA的质粒中切出表达ACAT第二跨 膜及C端cDNA的片段(266bp)，补平后与经SmaI酶切的表达 载体pBLPAV8连接，筛选获得重组质粒pBLPAV8-ACATC；再用 EcoRⅠ和BamHⅠ从pBLPAV8-ACATC切出约266bp的DNA片段，与用EcoRⅠ 和BamHⅠ酶切的表达载体pBLPAV7连接，获得ACATC融合表达 质粒pBLPAV7-ACATC。构建流程见图1。
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图1ACATc表达质粒的构建
Fig1ConstructionofexpressionplasmidpBLPAV7-ACATc
2.2 融合ProteinABCdomain的ACATC端片段在E.coliAR68中的表达
将构建的表达质粒转化到不同的表达菌中，进行表 达研究，仅观察到pBLPAV7-ACATC表达质粒转化在AR68菌株 中有相应的表达条带，分子量约27×103u(与理论推算值 相符)。从诱导时间看，42°C诱导1h就能观察到表达条 带，且表达量最高，表达量约占全菌蛋白的1%(20mg/L)。 其后表达量减少见图2。
图2 ACATc表达产物SDS-PAGE分析
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Fig2 SDS-PAGE analysis of the expression products from AR68 harboring the plasmid pBLPAV7-ACATc
Lane1：Total bacterial proteins from cellsincubated at 32℃;
Lane2～6：Total bacterial proteins from cells incubated at42℃ for 1,2,3,4,5 hours;
Lane7：Protein molecular weight marker
2.3 表达产物的可溶性分析及其纯化
可溶性分析表明，表达产物约20%为可溶性蛋白。 根据表达产物N端融合有ProteinABCdomain的特点，用Sepharose 4B-IgG亲和层析纯化表达产物。表达产物极不稳定， 纯化的样品中有明显的降解条带。按常规的方法纯 化，几乎得不到表达产物,纯化样品主要为降解产物 (结果未列出)。为了抑制表达产物的降解，诱导表达 结束后，立即在菌液中加入蛋白酶抑制剂PMSF，终浓 度为2mmol/L，并置冰浴30min。在其后的操作过程中，以 缓冲溶液A代替PBS缓冲溶液。这样，表达产物降解的 现象被明显抑制。经亲和层析，可得到纯度达50%的 表达产物见图3。
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图3 ACATc表达产物经Sepharose 4B-IgG亲合层析后纯化样品的SDS-PAGE分析
Fig3 SDS-PAGE analysis of the expression products purified by Affinity Chromatography with Sepharose 4B-IgG column
Lane1：Total bacterial proteins from cells incubated at 32℃;
Lane2：Total bacterial proteins from cells incubated at 42℃；
Lane3：Pellet of expressed bacteria;
Lane4：Supernatant of expressed bacteria;
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Lane5：Purified protein;
Lane6：Protein molecular weight marker
2.4 ACATc抗体的制备及特异性分析
通过SDS-PAGE纯化得到表达产物PABC-ACATc,免疫大白兔 ，制备获得阳性抗血清，抗体稀释滴定为1：2650。利 用该抗血清，经Westernblotting方法检测全菌蛋白样品， 发现仅温敏诱导的、表达ACATc的细菌中存在相应的表 达产物条带及其降解产物条带，且42°C诱导1h表达量 最高，其后表达量减少，见图4。这些结果与全菌蛋 白的SDS-PAGE结果相一致。说明所获得的抗血清有很强 的专一性。用该抗血清检测ACAT在哺乳细胞分布的结 果将另文报道。
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图4 Western blotting分析
Fig4 Western blotting of expression products from AR68 harboring the plasmid pBLPAV7-ACATc Notes as in Fig 1
3 讨论
ACATcDNA编码550氨基酸残基，其中60%以上为疏水氨基 酸，疏水性极强，表达产物不易形成正确的折叠， 极易被水解。我们在表达完整ACAT分子未得结果的情 况下，将ACATC端包含第二个跨膜区的ACATC端片段与亲 水性较强的ProteinABCdomain进行融合表达，目的是增强表 达产物的稳定性，提高表达量。结果在蛋白酶缺陷 的AR68菌株中获得成功表达了PABC-ACATc。从诱导时间看 ，温敏诱导1h就能观察到表达条带，且表达量最高，表达量约占全菌蛋白的1%，其后表达量减少。从 Westernblotting结果分析，温敏诱导后，在表达菌中表达 产物的表达与降解并存。通常情况下，诱导表达后3～ 5h表达量最高。而表达产物PABC-ACATc温敏诱导1h，表达 量最高。这可能是因为温敏诱导后，随着时间的延 长，细菌中受HSP调节的蛋白酶被诱导，表达产物PABC-ACATc不稳定，易受蛋白酶攻击，被降解。因此，随着 时间的延长，表达产物的量逐渐减少。曾试图用蛋 白酶抑制剂抑制表达过程中的降解，但加入蛋白酶 抑制剂后表达亦被抑制(结果未列出)。根据表达 产物N端融合有ProteinABCdomain的特点，用Sepharose4B-IgG亲和 层析纯化表达产物[9]。按常规的方法纯化，几乎得不 到表达产物,纯化样品主要为降解产物(结果未列出)。 经过一系列纯化条件的摸索后，在纯化过程中加入 高浓度广谱的蛋白酶抑制剂PMSF、EDTA可有效防止表达产物的降解，纯化获得表达产物PABC-ACATc,并制备了相 应的抗体。这些工作为进一步重组表达完整的ACAT蛋白分子积累了经验，为进一步在蛋白水平研究ACAT的 表达调控、结构与功能的关系以及寻找ACAT的同工酶或类似物打下基础。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39425005)
作者简介：叶治家(1962.12)，男，湖北省黄岗市人，博士，讲师，主要从事真核基因表达调控的研究，发表论文10余篇。电话：(023)68752261
参考文献
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收稿日期：1999-05-20；修回日期：1999-07-15, http://www.100md.com