端粒、端粒酶与肿瘤的关系及其检测方法
作者：赵颖海 陈小毅
单位：赵颖海(广东医学院病理学 教研室，湛江 524023)；陈小毅(广东医学院病理学 教研室，湛江 524023)
关键词：端粒；端粒酶；肿瘤；检测方法
广东医学院学报000223 文章编号：1005-4057 (2000 ) 02-0169-02
近几年，端粒(telomere，TLM)与端粒酶(telome rase，TLMA)的研究受到国际医学生物学界的高度重视。原因是它们与细胞衰老、 分裂和恶变有密切关系。因此有一些学者认为：TLM和TLMA系统的研究，将可 进一步了解肿瘤的发生机制，对于肿瘤的诊断和治疗以及估计预后都有重要的理论 和实际意义。
1 端粒、端粒酶的结构及功能研究状况
, http://www.100md.com
端粒是位于真核细胞染色体末端DNA和蛋白质的复合体。人类染色体端粒由5’ →3’方向简单重复的(TTAGGG)序列组成，重复次数约2000次。端粒 具有以下生物学功能：(1)保证DNA的完整复制，使真正的遗传信息得到完整 的复制；(2)维持染色体结构稳定，防止染色体异常重组而影响分裂；(3)与 染色体在细胞中的定位(使之不随机分布)有关；(4)TLM的长度可作为细胞 的“分裂时钟”反映细胞的分裂能力。
端粒酶是一种蛋白与小分子RNA组成的核糖核酸酶，具有逆转录酶的活性，不依 赖DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感，以自身RNA为模板合成端 粒重复序列。端粒酶的RNA是不编码蛋白质的核酸序列。Singer等分离并 克降了Hela细胞的端粒酶RNA，命名为hTR，长约560nt，其中11 nt5’(CUAACCCUAAC)3’作为模板，合成互补的端粒结构5’( TTAGGG)3’。在干细胞及肿瘤中hTR比正常细胞高表达，模板区的突变 导致端粒结构异常，用反义hTR转染的细胞发生凋亡或分化。1995年克隆了 人的端粒酶的RNA组分，发现人的端粒酶RNA模板区包括11个核苷酸(5’ GUAACCCUAAC)，与人的端粒顺序(TTAGGG)互补。
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端粒酶蛋白包括二个亚单位P80和P95，P80能 与端粒酶RNA特异性结合并与TLMA活性密切相关。Meyerson等(1 997年)报道从人端粒酶中克降到一种催化亚基基因hESTZ，发现在原发 性肿瘤，癌细胞株和端粒酶阳性组织中有高水平的表达，而在正常组织则无[1]。 同年Tahara等发现hESTZ与人端粒酶逆转录酶(hTRT)是同一物质 [2]。
2 人体细胞中端粒酶的生物学意义
2.1与体细胞衰老的关系
端粒酶在人的体细胞中是不表达的，端粒以200～300 bp/分裂的速度丢失， 结果导致细胞衰老。端粒酶的激活，能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老。
2.2 与生殖细胞、干细胞维持的关系
在具有繁殖潜能的生殖细胞、造血干细胞中有强的端粒酶活性，这些细胞的TLM 稳定，长度长于体细胞，精子内TLMA活性保持稳定，使精子TLM的长度终生 保持不变，将完整的遗传信息传递给子孙。
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3 端粒酶在人体肿瘤演进中的作用
端粒酶与细胞永生化的获得密切相关。细胞获得永生化必须克服两个危险期，即M1和 M2期。在M1期细胞端粒开始短缩，并启动终止细胞分裂的信号，正常人的双 倍体细胞不能进一步分裂，开始衰老死亡。癌基因SV40T抗原、抑癌基因p5 3和Rb的突变均能使细胞逃脱M1期，并获得额外增殖能力，此时TLMA阴性， TLM继续短缩，最终到达M2期。此时因端粒太短而致染色体极不稳定，于是大 多数细胞死亡。极少数细胞由于激活了TLMA，TLM功能得以恢复，染色体形 态稳定使细胞永生化。端粒缩短和端粒酶激活的情况有人称之为端粒危机[3]， 它是肿瘤细胞克降繁衍的强大驱动力，促进了肿瘤的进一步发展。
Kirn等发现，在来源于18种不同人体组织的培养细胞中，98/100株永 生化细胞TLMA阳性，22种频死细胞株TLMA均阴性；50个正常体细胞组 织标本TLMA全阴性；检测400多例来源于12种不同组织的原发肿瘤组织的 端粒酶，阳性率高达84.8%，而肿瘤周围正常的组织或良性病变中阳性率仅为 4.2%[4]，其端粒酶活性存在显著差异；而正常卵巢和睾丸组织及造血细 胞中有TLMA活性，表明在肿瘤恶性进展和永生化细胞的维持与TLMA的活化密 切相关。
, 百拇医药
随着TLMA检测方法的临床推广应用，一些研究发现，大多数恶性肿瘤(85%) 有TLMA活性，TLMA活化为浸润性肿瘤发展所必须的，TLMA阳性者95 %属进展期，通常较阴性者病变范围大、淋巴结转移多，术后4 a生存率为3 0%，预后明显不良；而TLMA阴性者80%属早期，术后4 a生存率超过7 5%。早期肿瘤表达TLMA活性提示有恶性发展潜能；反之则无，预后较佳。
虽然多数恶性肿瘤组织中TLMA活性很高，但亦有少数无TLMA活性，一种可 能是这些细胞逃脱了M1期，具有一定的增殖能力，但TLMA尚未被激活，故并 非无限增殖，其恶性度相对较低。另一种可能是它们以其他方式完成端粒复制，如 利用反转录系统或救援途径等[5]。
Shama[6]等用促分化剂处理后使细胞分化，TLMA活性下降。Alba nell[7]用全反式视黄酸(ATRA)诱导NB细胞，对分化敏感的细胞群 落TLMA活性下降，对分化有抗性的则无变化。提示端粒酶活性与肿瘤细胞的分 化呈负相关。
, 百拇医药
4 端粒长度和端粒酶活性的测定
4.1端粒重复序列延伸方法(Telomereextensionas say) Morin[8]创建该方法。(1)制蛋白提取液；(2)进行端粒 重复序列合成，反应液含2 mM dATP、2 mM dTTP、3 mM α- 32 PdGTP，使同位素掺入；(3)行聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影； (4)阳性见梯度条带；(5)特点：稳定性好，但需样本量大，敏感性差，时间 长，需同位素量大，不利推广。
4.2 端粒重复序列扩增方法(TRAP)
Kim[4]等建立本方法。(1) 制备蛋白提取液；(2)端粒重复序列延伸，加入TS(Telomerase substract)引物；(3)加入CX引物和Taq酶进行PCR反应；( 4)在PCR反应中加α-32 PdCTP，使其掺入，进行放射自显影，或不 加同位素，直接电泳，而后银染显色；(5)特点：所需标本微小；敏感性提高近 103以上，可大量检测；同位素量小，还可用银染等方法取代同位素；但定量 困难，易出假阴性结果。
, 百拇医药
4.3 TRAP改良方法
因TRAP检测法存在上述缺点，近来有学者主要从两方面进行改良，一是加入内 对照以防止假阴性结果；二是与免疫荧光技术结合使结果量化。
4.3.1 加内对照TRAP法 Wright[9]等报道加内对照TRAP。 以150 bp大鼠肌浆蛋白基因片段为内对照，设计TS、CX与肌浆蛋白基 因的复合引物，进行PCR扩增，所扩增产物在5’和3’端分别含有TS合CX 序列，应用扩增产物作为内对照模板。在TRAP检测时，加此产物，结果可见1 86 bp内对照条带，内对照条带不出现，提示PCR反应存在问题，消除假阴 性结果。
4.3.2 端粒重复序列扩增——闪烁亲和法(TRAP-SPA) Savo yshy[10]等将TRAP法与SPA法结合。(1)制备蛋白提取液：(2) 端粒延伸与PCR扩增做如下改变：CX引物为生物素标志引物(Bio-CX)， α-32 PdGTP改为2 μ CiG[Me-3H]TTP，其它同前；( 3)扩增后加亲合素标志的荧光微球，使生物素标志3H掺入的扩增产物与荧光微 球亲和，激活产生光波信号，最后直接用液闪仪计数；(4)特点：检测速度快， 敏感性强，特异性高，可定量，便于大量检测：缺点是需要液闪计数，不利推广。
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4.3.3 荧光素标记的端粒重复序列扩增法 Ohyashiki等应用荧光 标记的TS引物，行端粒重复序列扩增，用DNA自动测序仪测得荧光曲线。该方 法较简便，可定量，但需要DNA自动测序仪，不易推广。
4.3.4 端粒重复序列扩增——酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA) Lungu[11]等采用生物素标记的TS引物行TRAP法扩增端粒重复序列。 用ELISA检测扩增产物：(1)5 μL扩增产物，20 μL变性试剂，加 入225 μL杂交混合液(含地高辛标记的检测探针)，充分混匀，取100 μ L混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上，振荡保温2 h；(2)离心洗涤后， 加入100 μL抗体；(3)离心洗涤后，加100 μL TMB显色，测定4 50 nm和690 nm的A值，根据A＝A450-A690计算。( 4)特点：敏感性强，特异性高，可定量，便于大量检测。
5 小结
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端粒酶的发现在理论上丰富和发展了分子肿瘤学，其检测的潜在临床应用价值亦受 到极大重视。由于端粒酶活性见于绝大多数恶性肿瘤，而人正常体细胞中未见该酶 的活性，因此，TLMA活性的检测可能会成为早期恶性肿瘤的诊断手段之一，T LMA亦可能成为良恶性肿瘤的鉴别和判断肿瘤预后的标志物，而建立在 抑制TLMA活性基础上的抗癌药物可能会得到高疗效和低副作用。
作者简介：赵颖海，女，1979年10月出生，医学学士，助教
参考文献
[1] Meyerson M，Counter CM，Eaton EN ，et al.HEST2，the putative human telomer ase catalytic subnit gene，is up-regu lated in tumor cells and during immo rtalization.Cell，1997，90(4)：785～795
, http://www.100md.com
[2]Tahara H，Tahara E，Ide T，et al.Telomere and telomerase associated genes.Gran To Kagakn Ryoho，1997，24(15)：2196～2201
[3] Ishikawa F.Telomere crisis，the dr iving force in cancer cell evolution. Biochem Biophys Res Commun，1997，230： 1～6
[4] Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human tel omerase activity with immortal cells and cancer.Science，1994，266：2011～20 15
[5] Levis RW，Ganesan R，Houtchens K et al.Transposons in place of telomeri c repeats at a drosophila telomere.C ell，1993，75(6)：1083
, 百拇医药
[6] Sharma HW，Sokoloski JA，Perez JR，e t al.Differentiation of immortal cel ls inhibits telomerase activity.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：12343～123 46
[7] Albanell J，Han W，Mellado B，et al. Telomerase activity is repressed dur ing differentiation of maturation-se ntiative but not resistant human tum or cell lines.Cancer Res，1996，56(7)： 1503～1508
[8] Morin GB.The human telomere termi nal transferase enzyme is a ribonucl eoprotein that synthesizes TTAGGG re peats.Cell，1989，59：521～529
, 百拇医药
[9] Wright WE，Shay JW，Piatyszek MA.Mo difications of a telomeric repeat am plification protocol(TRAP)result in increased reliability，linearity and sensitvity.Nucleic Acids Res，1995，23 (18)：3794～3795
[10] Savoysky E，Akamatsu K，Tsuchiya M， et al.Detection of telomerase activi ty by combination of TRAP method and scintillation proximity assay(SPA). Nucleic Acids Res，1996，24(6)：1175～11 76
[11] Lungu O，Sun XW，Wright TC，et al.A polymerase chain reaction enzyme-li nked immunosorbent assay method for detecting human papillomaiirus in th e cernical carinomas and high-grade cerincal cancer precursors.Obstet Gy necol，1995，85：337～341
收稿日期：1999-10-11；修订日期：2000-01-22, 百拇医药
单位：赵颖海(广东医学院病理学 教研室，湛江 524023)；陈小毅(广东医学院病理学 教研室，湛江 524023)
关键词：端粒；端粒酶；肿瘤；检测方法
广东医学院学报000223 文章编号：1005-4057 (2000 ) 02-0169-02
近几年，端粒(telomere，TLM)与端粒酶(telome rase，TLMA)的研究受到国际医学生物学界的高度重视。原因是它们与细胞衰老、 分裂和恶变有密切关系。因此有一些学者认为：TLM和TLMA系统的研究，将可 进一步了解肿瘤的发生机制，对于肿瘤的诊断和治疗以及估计预后都有重要的理论 和实际意义。
1 端粒、端粒酶的结构及功能研究状况
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端粒是位于真核细胞染色体末端DNA和蛋白质的复合体。人类染色体端粒由5’ →3’方向简单重复的(TTAGGG)序列组成，重复次数约2000次。端粒 具有以下生物学功能：(1)保证DNA的完整复制，使真正的遗传信息得到完整 的复制；(2)维持染色体结构稳定，防止染色体异常重组而影响分裂；(3)与 染色体在细胞中的定位(使之不随机分布)有关；(4)TLM的长度可作为细胞 的“分裂时钟”反映细胞的分裂能力。
端粒酶是一种蛋白与小分子RNA组成的核糖核酸酶，具有逆转录酶的活性，不依 赖DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感，以自身RNA为模板合成端 粒重复序列。端粒酶的RNA是不编码蛋白质的核酸序列。Singer等分离并 克降了Hela细胞的端粒酶RNA，命名为hTR，长约560nt，其中11 nt5’(CUAACCCUAAC)3’作为模板，合成互补的端粒结构5’( TTAGGG)3’。在干细胞及肿瘤中hTR比正常细胞高表达，模板区的突变 导致端粒结构异常，用反义hTR转染的细胞发生凋亡或分化。1995年克隆了 人的端粒酶的RNA组分，发现人的端粒酶RNA模板区包括11个核苷酸(5’ GUAACCCUAAC)，与人的端粒顺序(TTAGGG)互补。
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端粒酶蛋白包括二个亚单位P80和P95，P80能 与端粒酶RNA特异性结合并与TLMA活性密切相关。Meyerson等(1 997年)报道从人端粒酶中克降到一种催化亚基基因hESTZ，发现在原发 性肿瘤，癌细胞株和端粒酶阳性组织中有高水平的表达，而在正常组织则无[1]。 同年Tahara等发现hESTZ与人端粒酶逆转录酶(hTRT)是同一物质 [2]。
2 人体细胞中端粒酶的生物学意义
2.1与体细胞衰老的关系
端粒酶在人的体细胞中是不表达的，端粒以200～300 bp/分裂的速度丢失， 结果导致细胞衰老。端粒酶的激活，能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老。
2.2 与生殖细胞、干细胞维持的关系
在具有繁殖潜能的生殖细胞、造血干细胞中有强的端粒酶活性，这些细胞的TLM 稳定，长度长于体细胞，精子内TLMA活性保持稳定，使精子TLM的长度终生 保持不变，将完整的遗传信息传递给子孙。
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3 端粒酶在人体肿瘤演进中的作用
端粒酶与细胞永生化的获得密切相关。细胞获得永生化必须克服两个危险期，即M1和 M2期。在M1期细胞端粒开始短缩，并启动终止细胞分裂的信号，正常人的双 倍体细胞不能进一步分裂，开始衰老死亡。癌基因SV40T抗原、抑癌基因p5 3和Rb的突变均能使细胞逃脱M1期，并获得额外增殖能力，此时TLMA阴性， TLM继续短缩，最终到达M2期。此时因端粒太短而致染色体极不稳定，于是大 多数细胞死亡。极少数细胞由于激活了TLMA，TLM功能得以恢复，染色体形 态稳定使细胞永生化。端粒缩短和端粒酶激活的情况有人称之为端粒危机[3]， 它是肿瘤细胞克降繁衍的强大驱动力，促进了肿瘤的进一步发展。
Kirn等发现，在来源于18种不同人体组织的培养细胞中，98/100株永 生化细胞TLMA阳性，22种频死细胞株TLMA均阴性；50个正常体细胞组 织标本TLMA全阴性；检测400多例来源于12种不同组织的原发肿瘤组织的 端粒酶，阳性率高达84.8%，而肿瘤周围正常的组织或良性病变中阳性率仅为 4.2%[4]，其端粒酶活性存在显著差异；而正常卵巢和睾丸组织及造血细 胞中有TLMA活性，表明在肿瘤恶性进展和永生化细胞的维持与TLMA的活化密 切相关。
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随着TLMA检测方法的临床推广应用，一些研究发现，大多数恶性肿瘤(85%) 有TLMA活性，TLMA活化为浸润性肿瘤发展所必须的，TLMA阳性者95 %属进展期，通常较阴性者病变范围大、淋巴结转移多，术后4 a生存率为3 0%，预后明显不良；而TLMA阴性者80%属早期，术后4 a生存率超过7 5%。早期肿瘤表达TLMA活性提示有恶性发展潜能；反之则无，预后较佳。
虽然多数恶性肿瘤组织中TLMA活性很高，但亦有少数无TLMA活性，一种可 能是这些细胞逃脱了M1期，具有一定的增殖能力，但TLMA尚未被激活，故并 非无限增殖，其恶性度相对较低。另一种可能是它们以其他方式完成端粒复制，如 利用反转录系统或救援途径等[5]。
Shama[6]等用促分化剂处理后使细胞分化，TLMA活性下降。Alba nell[7]用全反式视黄酸(ATRA)诱导NB细胞，对分化敏感的细胞群 落TLMA活性下降，对分化有抗性的则无变化。提示端粒酶活性与肿瘤细胞的分 化呈负相关。
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4 端粒长度和端粒酶活性的测定
4.1端粒重复序列延伸方法(Telomereextensionas say) Morin[8]创建该方法。(1)制蛋白提取液；(2)进行端粒 重复序列合成，反应液含2 mM dATP、2 mM dTTP、3 mM α- 32 PdGTP，使同位素掺入；(3)行聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影； (4)阳性见梯度条带；(5)特点：稳定性好，但需样本量大，敏感性差，时间 长，需同位素量大，不利推广。
4.2 端粒重复序列扩增方法(TRAP)
Kim[4]等建立本方法。(1) 制备蛋白提取液；(2)端粒重复序列延伸，加入TS(Telomerase substract)引物；(3)加入CX引物和Taq酶进行PCR反应；( 4)在PCR反应中加α-32 PdCTP，使其掺入，进行放射自显影，或不 加同位素，直接电泳，而后银染显色；(5)特点：所需标本微小；敏感性提高近 103以上，可大量检测；同位素量小，还可用银染等方法取代同位素；但定量 困难，易出假阴性结果。
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4.3 TRAP改良方法
因TRAP检测法存在上述缺点，近来有学者主要从两方面进行改良，一是加入内 对照以防止假阴性结果；二是与免疫荧光技术结合使结果量化。
4.3.1 加内对照TRAP法 Wright[9]等报道加内对照TRAP。 以150 bp大鼠肌浆蛋白基因片段为内对照，设计TS、CX与肌浆蛋白基 因的复合引物，进行PCR扩增，所扩增产物在5’和3’端分别含有TS合CX 序列，应用扩增产物作为内对照模板。在TRAP检测时，加此产物，结果可见1 86 bp内对照条带，内对照条带不出现，提示PCR反应存在问题，消除假阴 性结果。
4.3.2 端粒重复序列扩增——闪烁亲和法(TRAP-SPA) Savo yshy[10]等将TRAP法与SPA法结合。(1)制备蛋白提取液：(2) 端粒延伸与PCR扩增做如下改变：CX引物为生物素标志引物(Bio-CX)， α-32 PdGTP改为2 μ CiG[Me-3H]TTP，其它同前；( 3)扩增后加亲合素标志的荧光微球，使生物素标志3H掺入的扩增产物与荧光微 球亲和，激活产生光波信号，最后直接用液闪仪计数；(4)特点：检测速度快， 敏感性强，特异性高，可定量，便于大量检测：缺点是需要液闪计数，不利推广。
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4.3.3 荧光素标记的端粒重复序列扩增法 Ohyashiki等应用荧光 标记的TS引物，行端粒重复序列扩增，用DNA自动测序仪测得荧光曲线。该方 法较简便，可定量，但需要DNA自动测序仪，不易推广。
4.3.4 端粒重复序列扩增——酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA) Lungu[11]等采用生物素标记的TS引物行TRAP法扩增端粒重复序列。 用ELISA检测扩增产物：(1)5 μL扩增产物，20 μL变性试剂，加 入225 μL杂交混合液(含地高辛标记的检测探针)，充分混匀，取100 μ L混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上，振荡保温2 h；(2)离心洗涤后， 加入100 μL抗体；(3)离心洗涤后，加100 μL TMB显色，测定4 50 nm和690 nm的A值，根据A＝A450-A690计算。( 4)特点：敏感性强，特异性高，可定量，便于大量检测。
5 小结
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端粒酶的发现在理论上丰富和发展了分子肿瘤学，其检测的潜在临床应用价值亦受 到极大重视。由于端粒酶活性见于绝大多数恶性肿瘤，而人正常体细胞中未见该酶 的活性，因此，TLMA活性的检测可能会成为早期恶性肿瘤的诊断手段之一，T LMA亦可能成为良恶性肿瘤的鉴别和判断肿瘤预后的标志物，而建立在 抑制TLMA活性基础上的抗癌药物可能会得到高疗效和低副作用。
作者简介：赵颖海，女，1979年10月出生，医学学士，助教
参考文献
[1] Meyerson M，Counter CM，Eaton EN ，et al.HEST2，the putative human telomer ase catalytic subnit gene，is up-regu lated in tumor cells and during immo rtalization.Cell，1997，90(4)：785～795
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[2]Tahara H，Tahara E，Ide T，et al.Telomere and telomerase associated genes.Gran To Kagakn Ryoho，1997，24(15)：2196～2201
[3] Ishikawa F.Telomere crisis，the dr iving force in cancer cell evolution. Biochem Biophys Res Commun，1997，230： 1～6
[4] Kim NW，Piatyszek MA，Prowse KR，et al.Specific association of human tel omerase activity with immortal cells and cancer.Science，1994，266：2011～20 15
[5] Levis RW，Ganesan R，Houtchens K et al.Transposons in place of telomeri c repeats at a drosophila telomere.C ell，1993，75(6)：1083
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[6] Sharma HW，Sokoloski JA，Perez JR，e t al.Differentiation of immortal cel ls inhibits telomerase activity.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92：12343～123 46
[7] Albanell J，Han W，Mellado B，et al. Telomerase activity is repressed dur ing differentiation of maturation-se ntiative but not resistant human tum or cell lines.Cancer Res，1996，56(7)： 1503～1508
[8] Morin GB.The human telomere termi nal transferase enzyme is a ribonucl eoprotein that synthesizes TTAGGG re peats.Cell，1989，59：521～529
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[9] Wright WE，Shay JW，Piatyszek MA.Mo difications of a telomeric repeat am plification protocol(TRAP)result in increased reliability，linearity and sensitvity.Nucleic Acids Res，1995，23 (18)：3794～3795
[10] Savoysky E，Akamatsu K，Tsuchiya M， et al.Detection of telomerase activi ty by combination of TRAP method and scintillation proximity assay(SPA). Nucleic Acids Res，1996，24(6)：1175～11 76
[11] Lungu O，Sun XW，Wright TC，et al.A polymerase chain reaction enzyme-li nked immunosorbent assay method for detecting human papillomaiirus in th e cernical carinomas and high-grade cerincal cancer precursors.Obstet Gy necol，1995，85：337～341
收稿日期：1999-10-11；修订日期：2000-01-22, 百拇医药