家兔角膜内皮细胞体外原代培养的实验研究
作者：谭浅 杜岱雪 许雪亮 蒋幼芹 祝和成
单位：谭浅(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)；杜岱雪(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)；许雪亮(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)；蒋幼芹(湖南医科大学第二附属医学 长沙 410011)；祝和成(湖南医科大学肿瘤研究所 长沙 410078)
关键词：内皮，角膜；细胞学；细胞，培养的；方法；显微镜检查，电子；动物；兔
湖南医学000205【摘 要】目的研究培养家兔角膜内皮细胞，为实验研究提供基础。方法体外培养家兔角膜内皮细胞并做电镜鉴定。结果细胞3 d后开始从组织块边缘生出，1周后组织块周围长出细胞晕，3周后开始融合，传代。结论经相差倒置显微镜和电镜证实为角膜内皮细胞。
【中图分类号】 R772.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001-9421(2000)02-0090-02
, http://www.100md.com
Experimental Study on the Prime-cultured Corneal Endothelial Cells in Rabbits
TAN Qian DU Daixue XU Xueliang
(Department of Ophthalmology,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410008,China)
JIANG Youqin
(Department of Ophthalmology,The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410011)
ZHU Hecheng
, 百拇医药
(Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha,4100078)
【Abstract】ObjectiveTo provide a sound basis for experimental research by cultivation of endothelial cells from rabbit cornea.MethodsEndothelial cells from rabbit cornea were cultivated in vitro and identified by electron microscopy.ResultsThe endothelial cells began to outgrow from borders of cell mass after 3 days of cultivation,and haloes were formed round the cell mass after 7 days.Subculture was carried out when cells became confluent after 3 weeks.ConclusionThe subcultured cells are confirmed as corneal endothelial cells under inverted phase-contrast microscope and electron microscope.
, 百拇医药
【Key words】 endothelium,corneal/cytology; cells,culture/methods; microscopy,electron; animals; rabbits
角膜内皮细胞在维持角膜透明性方面起着至关重要的作用，其形态是否完整，功能是否健全是临床上评价角膜功能的指标。通过角膜内皮细胞的体外试验，可观察药物及一些因素对角膜内皮活性的影响，而体外实验也有赖于良好的角膜内皮的培养。本研究应用组织块培养法，对角膜内皮细胞进行培养，为其进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器 胰蛋白酶(上海化学试剂供应站提供)，用D-Hanks液配制。RPMI 1640培养基(SIGMA公司出品)，按产品说明配制，抽滤除菌后4 ℃保存。小牛血清由湖南医科大学肿瘤研究所细胞培养中心提供。D-Hanks液按常规处方配制，高压消毒备用。庆大霉素(天津华津制药厂产)。1∶5 000升汞水、生理盐水(湖南医科大学湘雅医院药剂科)。CO2培养箱(TOABAI ESPEC公司BNA-321D型)。倒置相差显微镜、照相机(日本Olympus公司)。YJ-1450医用净
, 百拇医药
化台(苏州净化设备厂)。低速离心机(北京医用离心机厂)。解剖显微镜(江南光学仪器厂XTB-01型)。透射电镜(日本日立公司H-600型)。超薄切片机(瑞典LKBⅢ型)。其它：培养皿、培养瓶、吸管、液氮。
1.1.2 取材 家兔由湖南医科大学动物室提供，体重1～1.5 kg，空气静脉栓塞处死后立即取出眼球。
1.2 方法
1.2.1 原代培养 将眼球用1∶5 000升汞溶液漂洗两次后移入无菌操作台，用含庆大霉素1万 u/100 ml生理盐水的溶液浸泡30 min，沿角膜缘外1 mm剪下角膜片，内皮细胞层朝上，用大头针固定在角膜片外侧的巩膜上。解剖显微镜10倍下，沿角膜缘内1 mm剥离出角膜后弹力层，内皮面朝下贴于培养皿底部，将组织块切割成1 mm×2 mm大小组织块后，后弹力层展平，待组织块与培养皿底部吸牢后，加入含20%牛血清的RPMI 1640培养基，使液面刚能盖住组织块而又不至使组织块浮起。放入37 ℃，5% CO2培养箱中孵育。48 h后加培养基，以后每隔3 d换培养液1次。
, 百拇医药
1.2.2 细胞传代 观察到细胞长满培养皿的底部后取出，去培养基，用D-Hanks液冲洗两遍，加入0.2%胰蛋白酶与细胞充分接触后弃去，将培养皿放入37 ℃ 5% CO2孵育箱中，放置8～10 min，取出，视细胞间联接消失，细胞变圆后，用含15%牛血清的RPMI 1640培养基吹打至细胞脱落，移入50 ml培养瓶中，置入37 ℃，5% CO2培养箱中3～4 d，待细胞汇合，长满瓶底，用同样方法传代。
1.2.3 普通光镜观察 3 d后在倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，同时用Olympus照相机摄像。
1.2.4 电镜观察 将原代培养细胞用刮匙刮下，离心(1"000 r/min,8 min)后，去上清液，用2.5%戊二醛(0.1 mmol/L PBS pH 7.2)固定12 h，钅 我酸后固定1 h，梯度丙酮脱水，Epon-812环氧树脂浸泡、包埋，(瑞典)LKB Ⅲ型超薄切片机切片，醋酸双氧铀—枸橼酸铅电子染色，H-600(日立)透射电镜观察。
, 百拇医药
1.2.5 低温保存内皮细胞 将5～6代的传代细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用含15%牛血清的D-Hanks液吹打，并收集离心(1"000 r/min,8 min)，用含20%小牛血清的RPMI 1640和二甲亚枫(DMSO)以9∶1的比例混合，加入细胞中，吹打混匀，移入冻存管，先置-20 ℃保存，2 h后取出，放入液氮瓶口5 min，液氮瓶中央20 min，液氮面5 min，再投入液氮中。
1.2.6 细胞复苏 取出内皮细胞立即放入37 ℃水浴箱中复温，复温后缓慢滴入含20%牛血清的RPMI 1640液，边滴边混匀，接种细胞于50 ml培养瓶中，置37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育，24 h待细胞贴壁后更换15%小牛血清的1640培基。
2 结果
2.1 相差倒置显微镜观察 培养3 d后即可见内皮细胞从组织块边缘移出，形态为多角形，有伪足，后弹力层表面的内皮细胞排列较整齐，边缘结构清楚，细胞大小近于一致，形状为六角形(封四图1)。1周后组织块周围开始形成生长晕，细胞形状仍不规则，多角形、核有时呈圆形。3周后，细胞长满瓶底，呈生长密集状，并可见细胞间的汇合，镶嵌排列呈单层，细胞远离组织块者逐渐变大，但形态基本不变，呈六角形，也可见三角形，四角形，与天然的内皮细胞有许多相似之处(封四图2)。传代后的内皮细胞呈多角形，细胞间有连接，但细胞形态已不如原代细胞规则(封四图3)。
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2.2 电镜观察 细胞间联接可见闭合小体，细胞间镶嵌，细胞浆内有丰实的细胞器，如线粒体，golgi式体和细胞内空泡(封四图4)。
低温保存后的复苏细胞，存活率约50%，细胞形态与传代细胞无异，待长满瓶底后开始实验。作者观察到保存液中加入bFGF的细胞贴壁较多，细胞复苏后的生长状态较好。
3 讨论
角膜内皮细胞的体外培养技术经过不断改进，已成功培养了单层的角膜内皮细胞[1～4]，甚至通过SV40抗体的转染而成功地建立了细胞株[5]。国内也有培养兔和人的角膜内皮细胞应用于实验研究的报道[6～9]，如能寻求一种更简便易行的培养和保存内皮细胞的方法，对实验研究和临床应用有着重大意义。作者通过组织块培养法原代培养角膜内皮细胞，获得了成功。在培养前，于角膜缘内1 mm取角膜内皮细胞，使其从Descemt膜分离，贴于瓶底，让其贴壁生长，形态学观察为单层的内皮细胞，形状近似六角形与天然的角膜内皮细胞极相似。电镜下细胞内的高尔基体，粗、滑面内质网较多，细胞间有伪足伸出，镶嵌排列，并可见闭合小体连接。证实无纤维细胞的污染。
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原代培养时一定要注意无菌操作，防止其它微生物的污染；组织块贴壁时要注意平整，边缘不能卷曲，以利于内皮细胞移出；首次加培养基时不能加得太多，恰好盖住组织块即可，否则组织块会浮起；第二次加培基时间为24～48 h，以保持组织块湿润为度。原代培养液中小牛血清含量为20%，而传代细胞可降低血清浓度至15%，以防止细胞过快老化。在细胞传代后，如有部分细胞暂时不用，可以冻存，以备以后实验时继续使用。冻存后有大部分细胞丢失，故冻存的细胞数要多，如有条件，加入10 ng/ml的bFGF更有利于细胞的复苏，贴壁，提高细胞的存活率。
【作者简介】 谭浅(1962～)，女，湖南长沙人，主治医师，博士，主要从事白内障诊断、治疗及青光眼早期诊断、治疗。
【参 考 文 献】
[1] Perlmen M，Baum JL.Synthesis of a collagenous basial membrane by rabbit orneal endothelial cells in vitio[J].Arch Ophthal,1974,92:238-239
, 百拇医药
[2] Engelmemn K,Bohnke M,Friedl P.Isolation and long-term cultivation of human corneal endothelial cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1988,29:1656-1662
[3] Baum JL,Niedra K,Dewis C，et al.Mass culture of human corneal endothelial cells[J].Arch Ophthalmol,1979,97:1136-1140
[4] Yue BYJT,Sugar J.Growth of human corneal endothelial cells in culture[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30:248-253
[5] Wilson SE,Zlogd SA,He YG,et al.Extended life of human corneal endothelial cells transfected with the SV40 Large T Antigen[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:2112-2123
, http://www.100md.com
[6] 谢立信，董晓光，张德茹，等.兔角膜组织细胞培养的技术改进[J].中华眼科杂志，1990，26(4)：237-239
[7] 张劲松.角膜内皮细胞培养的实验研究.一培养的家兔角膜内皮细胞的形态学初步观察[J].实用眼科杂志，1990，8(5)：271
[8] 王丽娅，李 辰，曾耀英，等.角膜内皮细胞培养方法的改进[J].眼科研究，1995，13(3)：215-216
[9] 龚向明，钟兴武，戴祖优.人角膜上皮与内皮细胞培养的改进[J].眼科，1997，6(2)：118-119
【收稿日期】 1999-12-03, 百拇医药
单位：谭浅(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)；杜岱雪(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)；许雪亮(湖南医科大学附属湘雅医院 长沙 410008)；蒋幼芹(湖南医科大学第二附属医学 长沙 410011)；祝和成(湖南医科大学肿瘤研究所 长沙 410078)
关键词：内皮，角膜；细胞学；细胞，培养的；方法；显微镜检查，电子；动物；兔
湖南医学000205【摘 要】目的研究培养家兔角膜内皮细胞，为实验研究提供基础。方法体外培养家兔角膜内皮细胞并做电镜鉴定。结果细胞3 d后开始从组织块边缘生出，1周后组织块周围长出细胞晕，3周后开始融合，传代。结论经相差倒置显微镜和电镜证实为角膜内皮细胞。
【中图分类号】 R772.2 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001-9421(2000)02-0090-02
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Experimental Study on the Prime-cultured Corneal Endothelial Cells in Rabbits
TAN Qian DU Daixue XU Xueliang
(Department of Ophthalmology,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410008,China)
JIANG Youqin
(Department of Ophthalmology,The Second Affiliated Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410011)
ZHU Hecheng
, 百拇医药
(Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha,4100078)
【Abstract】ObjectiveTo provide a sound basis for experimental research by cultivation of endothelial cells from rabbit cornea.MethodsEndothelial cells from rabbit cornea were cultivated in vitro and identified by electron microscopy.ResultsThe endothelial cells began to outgrow from borders of cell mass after 3 days of cultivation,and haloes were formed round the cell mass after 7 days.Subculture was carried out when cells became confluent after 3 weeks.ConclusionThe subcultured cells are confirmed as corneal endothelial cells under inverted phase-contrast microscope and electron microscope.
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【Key words】 endothelium,corneal/cytology; cells,culture/methods; microscopy,electron; animals; rabbits
角膜内皮细胞在维持角膜透明性方面起着至关重要的作用，其形态是否完整，功能是否健全是临床上评价角膜功能的指标。通过角膜内皮细胞的体外试验，可观察药物及一些因素对角膜内皮活性的影响，而体外实验也有赖于良好的角膜内皮的培养。本研究应用组织块培养法，对角膜内皮细胞进行培养，为其进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器 胰蛋白酶(上海化学试剂供应站提供)，用D-Hanks液配制。RPMI 1640培养基(SIGMA公司出品)，按产品说明配制，抽滤除菌后4 ℃保存。小牛血清由湖南医科大学肿瘤研究所细胞培养中心提供。D-Hanks液按常规处方配制，高压消毒备用。庆大霉素(天津华津制药厂产)。1∶5 000升汞水、生理盐水(湖南医科大学湘雅医院药剂科)。CO2培养箱(TOABAI ESPEC公司BNA-321D型)。倒置相差显微镜、照相机(日本Olympus公司)。YJ-1450医用净
, 百拇医药
化台(苏州净化设备厂)。低速离心机(北京医用离心机厂)。解剖显微镜(江南光学仪器厂XTB-01型)。透射电镜(日本日立公司H-600型)。超薄切片机(瑞典LKBⅢ型)。其它：培养皿、培养瓶、吸管、液氮。
1.1.2 取材 家兔由湖南医科大学动物室提供，体重1～1.5 kg，空气静脉栓塞处死后立即取出眼球。
1.2 方法
1.2.1 原代培养 将眼球用1∶5 000升汞溶液漂洗两次后移入无菌操作台，用含庆大霉素1万 u/100 ml生理盐水的溶液浸泡30 min，沿角膜缘外1 mm剪下角膜片，内皮细胞层朝上，用大头针固定在角膜片外侧的巩膜上。解剖显微镜10倍下，沿角膜缘内1 mm剥离出角膜后弹力层，内皮面朝下贴于培养皿底部，将组织块切割成1 mm×2 mm大小组织块后，后弹力层展平，待组织块与培养皿底部吸牢后，加入含20%牛血清的RPMI 1640培养基，使液面刚能盖住组织块而又不至使组织块浮起。放入37 ℃，5% CO2培养箱中孵育。48 h后加培养基，以后每隔3 d换培养液1次。
, 百拇医药
1.2.2 细胞传代 观察到细胞长满培养皿的底部后取出，去培养基，用D-Hanks液冲洗两遍，加入0.2%胰蛋白酶与细胞充分接触后弃去，将培养皿放入37 ℃ 5% CO2孵育箱中，放置8～10 min，取出，视细胞间联接消失，细胞变圆后，用含15%牛血清的RPMI 1640培养基吹打至细胞脱落，移入50 ml培养瓶中，置入37 ℃，5% CO2培养箱中3～4 d，待细胞汇合，长满瓶底，用同样方法传代。
1.2.3 普通光镜观察 3 d后在倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，同时用Olympus照相机摄像。
1.2.4 电镜观察 将原代培养细胞用刮匙刮下，离心(1"000 r/min,8 min)后，去上清液，用2.5%戊二醛(0.1 mmol/L PBS pH 7.2)固定12 h，钅 我酸后固定1 h，梯度丙酮脱水，Epon-812环氧树脂浸泡、包埋，(瑞典)LKB Ⅲ型超薄切片机切片，醋酸双氧铀—枸橼酸铅电子染色，H-600(日立)透射电镜观察。
, 百拇医药
1.2.5 低温保存内皮细胞 将5～6代的传代细胞用0.25%胰蛋白酶消化，用含15%牛血清的D-Hanks液吹打，并收集离心(1"000 r/min,8 min)，用含20%小牛血清的RPMI 1640和二甲亚枫(DMSO)以9∶1的比例混合，加入细胞中，吹打混匀，移入冻存管，先置-20 ℃保存，2 h后取出，放入液氮瓶口5 min，液氮瓶中央20 min，液氮面5 min，再投入液氮中。
1.2.6 细胞复苏 取出内皮细胞立即放入37 ℃水浴箱中复温，复温后缓慢滴入含20%牛血清的RPMI 1640液，边滴边混匀，接种细胞于50 ml培养瓶中，置37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育，24 h待细胞贴壁后更换15%小牛血清的1640培基。
2 结果
2.1 相差倒置显微镜观察 培养3 d后即可见内皮细胞从组织块边缘移出，形态为多角形，有伪足，后弹力层表面的内皮细胞排列较整齐，边缘结构清楚，细胞大小近于一致，形状为六角形(封四图1)。1周后组织块周围开始形成生长晕，细胞形状仍不规则，多角形、核有时呈圆形。3周后，细胞长满瓶底，呈生长密集状，并可见细胞间的汇合，镶嵌排列呈单层，细胞远离组织块者逐渐变大，但形态基本不变，呈六角形，也可见三角形，四角形，与天然的内皮细胞有许多相似之处(封四图2)。传代后的内皮细胞呈多角形，细胞间有连接，但细胞形态已不如原代细胞规则(封四图3)。
, http://www.100md.com
2.2 电镜观察 细胞间联接可见闭合小体，细胞间镶嵌，细胞浆内有丰实的细胞器，如线粒体，golgi式体和细胞内空泡(封四图4)。
低温保存后的复苏细胞，存活率约50%，细胞形态与传代细胞无异，待长满瓶底后开始实验。作者观察到保存液中加入bFGF的细胞贴壁较多，细胞复苏后的生长状态较好。
3 讨论
角膜内皮细胞的体外培养技术经过不断改进，已成功培养了单层的角膜内皮细胞[1～4]，甚至通过SV40抗体的转染而成功地建立了细胞株[5]。国内也有培养兔和人的角膜内皮细胞应用于实验研究的报道[6～9]，如能寻求一种更简便易行的培养和保存内皮细胞的方法，对实验研究和临床应用有着重大意义。作者通过组织块培养法原代培养角膜内皮细胞，获得了成功。在培养前，于角膜缘内1 mm取角膜内皮细胞，使其从Descemt膜分离，贴于瓶底，让其贴壁生长，形态学观察为单层的内皮细胞，形状近似六角形与天然的角膜内皮细胞极相似。电镜下细胞内的高尔基体，粗、滑面内质网较多，细胞间有伪足伸出，镶嵌排列，并可见闭合小体连接。证实无纤维细胞的污染。
, http://www.100md.com
原代培养时一定要注意无菌操作，防止其它微生物的污染；组织块贴壁时要注意平整，边缘不能卷曲，以利于内皮细胞移出；首次加培养基时不能加得太多，恰好盖住组织块即可，否则组织块会浮起；第二次加培基时间为24～48 h，以保持组织块湿润为度。原代培养液中小牛血清含量为20%，而传代细胞可降低血清浓度至15%，以防止细胞过快老化。在细胞传代后，如有部分细胞暂时不用，可以冻存，以备以后实验时继续使用。冻存后有大部分细胞丢失，故冻存的细胞数要多，如有条件，加入10 ng/ml的bFGF更有利于细胞的复苏，贴壁，提高细胞的存活率。
【作者简介】 谭浅(1962～)，女，湖南长沙人，主治医师，博士，主要从事白内障诊断、治疗及青光眼早期诊断、治疗。
【参 考 文 献】
[1] Perlmen M，Baum JL.Synthesis of a collagenous basial membrane by rabbit orneal endothelial cells in vitio[J].Arch Ophthal,1974,92:238-239
, 百拇医药
[2] Engelmemn K,Bohnke M,Friedl P.Isolation and long-term cultivation of human corneal endothelial cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1988,29:1656-1662
[3] Baum JL,Niedra K,Dewis C，et al.Mass culture of human corneal endothelial cells[J].Arch Ophthalmol,1979,97:1136-1140
[4] Yue BYJT,Sugar J.Growth of human corneal endothelial cells in culture[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30:248-253
[5] Wilson SE,Zlogd SA,He YG,et al.Extended life of human corneal endothelial cells transfected with the SV40 Large T Antigen[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:2112-2123
, http://www.100md.com
[6] 谢立信，董晓光，张德茹，等.兔角膜组织细胞培养的技术改进[J].中华眼科杂志，1990，26(4)：237-239
[7] 张劲松.角膜内皮细胞培养的实验研究.一培养的家兔角膜内皮细胞的形态学初步观察[J].实用眼科杂志，1990，8(5)：271
[8] 王丽娅，李 辰，曾耀英，等.角膜内皮细胞培养方法的改进[J].眼科研究，1995，13(3)：215-216
[9] 龚向明，钟兴武，戴祖优.人角膜上皮与内皮细胞培养的改进[J].眼科，1997，6(2)：118-119
【收稿日期】 1999-12-03, 百拇医药