ABC-ELISA法定量检测红细胞相关抗体及临床应用
作者：杨国元 王昌富 张万胜 虞咏知 李良风 黄知平 鲁志英 邓明凤
单位：杨国元(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；王昌富(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；张万胜(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；虞咏知(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；李良风(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；黄知平(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；鲁志英(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)
关键词：贫血，溶血性/自身免疫；亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸附测定
临床血液学杂志000207 摘 要：目的：寻求一种温抗体型自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)的诊断方法，提高AIHA的诊断率。方法：用竞争抑制法原理，建立亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸咐测定(ASC-ELISA)，定量检测红细胞相关抗体(EAIgG)。共检测正常人60例，WAIHA患者41例，非免疫性溶血性贫血59例。结果：①正常组EAIgG值0.26±0.12 fg/RBC，EAIgG正常上限0.5 fg/RBC(
±2s)；WAIHA组为2.85±1.68 fg/RBC，与正常组比较，差异极为显著(P<0.001)；非免疫性贫血组为0.59±0.93 fg/RBC，与正常比较，差异不显著性(P>0.05)。②41例WAIHA患者中，37例Coombs试验阳性，4例Commbs试验阴性，患者临床表现典型，皮质激素治疗反应良好，EAIgG值均显著增高，可证实为WAIHA。③动态观察EAIgG值，随访10例患者，随着病情好转，Hb、RBC上升，Ret下降，EAIgG量减少。结论：定量检测EAIgG，可作为WAIHA的诊断指标之一，对Coombs试验阴性的WAIHA更具有诊断价值；EAIgG的动态观察可作为观察疗效和估计预后的指标。
, 百拇医药
Quantitative Determination of EAIgG with ABC-ELISA and its Clinical Application
YANG Guo-yuan WANG Chang-fu ZHANG Wan-sheng YU Yong-zhi LI Liang-feng
HUANG ZHi-ping LU ZHi-ying DENG Ming-feng
(Jingzhou City Central Hospital,Jingzhou,Hubei,434100)
Abstract：Objective:Try to find a method in diagnosis of autoimmune hemolytic anemia with warm antibody (WAIHA).Methods:EAIgG (erythocyte associated IgG) was detected quantitatively by using ABC-ELISA.60 healthy people (controls),41 patients with WAIHA and 59 patients with non-immune anemia were estimated.Results:The normal superior limit of EAIgG was 0.5 fg/RBC(±2s),EAIgG in patients with WAIHA were 2.85±1.68 fg/RBC,which was significantjly higher than those in control group (P<0.001),EAIgG in patients with non-immune anemia were 0.59±0.93 fg/RBC,there were no difference in non-immune anemia group and control group (P>0.05);37 of 41 patients with WAIHA were positiven in Coombs′ test and the next 4 patients were negative ,the EAIgG in those patients with negative Coombs′ test were significantly increased;The change of EAIgG in 10 patients were observed during their treatment,when patient′s condition got better,Hb,RBC rose and EAIgG decreased.Conclusion:Quantitative detection of EAigG was an index in the diagnosis of WAIHA,especially in the AIHA with negative Coombs′ test;keeping a close watch on EAIgG would be of great value in therapeutic effect obserration and prognostic evaluation in WAIHA.
, 百拇医药
Key words：Anemia,hemolytic/autoimmune ABC-ELISA▲
自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是一类由自身抗体和(或)补体吸咐于红细胞表面，导致红细胞破坏增多而引起的溶血性贫血。本室建立亲和素生物素化酶复化物酶联免疫吸咐测定(ABC-ELISA)，定量检测红细胞相关抗体(EAIgG)，用于AIHA的诊断和疗效观察，报道如下。
1 材料和方法
1.1 检测对象
1.1.1 正常对照组：60例(献血员、学生各30例)中男39例，女21例；年龄18～49岁；Hb 男>120 g/L，女>105 g/L。
1.1.2 温抗体型AIHA组(WAIHA组)：41例。男6例，女35例；系本院1988年1月～1999年6月收治的患者，依据1987年全国溶血性贫血学术会议标准确诊，原发性30例，继发性11例(系统性红斑狼疮8例，肾病综合征2例，类风湿性关节炎1例)。同时合并血小板减少(Evans综合征)5例。Hb(31～78)g/L，RBC(1.25～2.89)×1012/L，Ret 0.05～0.25[绝对值(107～375)×109/L]。
, 百拇医药
1.1.3 非免疫性贫血组：59例，慢性再生障碍性贫血12例，缺铁性贫血35例，肾性贫血8例，肝硬化脾功能亢进4例。Hb(31～84)g/L，RBC(1.25～2.82)×1012/L，Ret 0.005～0.12[绝对值(107～188)×109/L]。
1.2 检测方法
ABC-ELISA法，按文献〔1〕方法。原理：采用竞争抑制法原理，将等量的人IgG包被于酶标反应板的微孔内，分别加入系列标准人IgG和待测的红细胞悬液，再加入定量生物素化鼠抗人IgG(b-MAHG)。因标准人IgG与红细胞相关IgG(EAIgG)的竞争，抑制部分b-MAHG与固相人IgG结合，结合于固相的b-MAHG连接ABC，后者作用于底物显色，其色泽深度与系列标准人IgG成反比，以标本吸光度查标准曲线，即知EAIgG的含量。
2 结果
, http://www.100md.com
①EAIgG测定结果：60例正常人为0.26±0.12 fg/RBC，41例WAIHA患者为2.85±1.68 fg/RBC，与正常组比较，差异极显著(P<0.001)；59例非免疫性贫血患者0.59±0.93 fg/RBC，与正常组比较，差异无显著性(P>0.05)。②41例WAIHA患者中，37例Coombs试验阳性，其EAIgG值为2.69±1.60 fg/RBC；4例Coombs试验阴性，其EAIgG值各为1.5，5.6，5.3，5.0(4.35±1.92)fg/RBC，两组相比差异无显著性(P>0.05)。③EAIgG值与病情的关系，见表1。从表1可见，随着病情好转，Ret下降，Hb、RBC上升。EAIgG值减少。
表1 EAIgG值与病情的关系 例号
EAIgG(fg/RBC)
Hb(g/L)
RBC(×1012/L)
, 百拇医药
Ret(×109/L)
治前
治后
治前
治后
治前
治后
治前
治后
1
1.0
0.30
40
, 百拇医药
140
1.25
4.30
150
64
2
1.5
0.60
62
130
2.35
4.00
188
, 百拇医药
74
3
2.1
0.20
49
101
2.33
3.33
233
120
4
2.3
0.55
, 百拇医药
35
117
1.25
4.53
197
172
5
3.6
0.75
53
96
2.00
3.42
, 百拇医药
107
17
6
5.3
0.38
31
81
1.00
2.85
250
114
7
2.3
, 百拇医药 1.40
47
120
1.88
4.00
259
110
8
2.9
1.00
45
143
1.52
, http://www.100md.com 4.50
228
125
9
3.0
0.80
74
124
2.60
3.80
312
152
10
, http://www.100md.com 3.2
1.00
45
105
1.38
3.42
232
114
2.4
0.69
45
115
, 百拇医药
1.75
3.81
215
106
P
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
3 讨论
我们采用ABC-ELISA法定量检测EAIgG，正常上限为0.5 fg/RBC(±2s)，41例AIHA患者EAIgG值为2.85±1.68 fg/RBC，范围(0.9～7.4)fg/RBC，均超过正常值。59例非免疫性贫血EAIgG值为0.59±0.93fg/RBC。与正常组比较，差异不显著(P>0.05)，故EAIgG值可作为WAIHA诊断指标之一。本组41例WAIHA中，37例Coombs试验阳性，4例阴性。多年来学者们对Coombs试验阴性的AIHA引起重视，其确切的发病率尚无足够的统计资料，文献报道为2%～43%，此类患者具有AIHA的典型特征，对皮质激素反应良好，有的病情严重，Hb<30 g/L，甚至呈溶血危象，但常规Coombs试验却呈阴性，其原因除试剂或操作技术因素外，一般认为由于红细胞上抗体浓度过低，未能达到Coombs试验所能检测的阈值范围。Gilliland通过实验认为，一般需要500个IgG分子/RBC，Coombs试验才出现阳性，如在35～500个IgG/RBC，就处于Coombs试验阈值以下〔2〕。也有推测可能是急性溶血后大量致敏红细胞被破坏，使Coombs试验敏感性下降所致〔3〕。对于Coombs试验阴性的AIHA的检测方法的探讨，也是研究的重点，但迄今未有简便易行的方法可供推广应用。本组4例Coombs试验阴性，但EAIgG明显升高，各为1.5，5.6，5.3，5.0 fg/RBC。结合其临床表现，给予肾上腺皮质素激素治疗，疗效均显著，从而证实了AIHA的诊断，故采用本法检查EAIgG，对于Coombs试验阴性的WAIHA，更有诊断价值。对EAIgG值进行动态观察，可作为观察疗效和估计预后的指标。如表1所示，观察10例患者治疗前后EAIgG的变化，显示EAIgG值和Hb浓度、RBC数及网织红细胞数有明显的相关性。治疗显效，Hb、RBC上升，Ret下降，EAIgG值减低，与文献〔4〕报道一致。■
, 百拇医药
作者单位：邓明凤(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)
参考文献：
[1]杨国元，王昌富，张国明，等.BAS-Coombs试验和ABC-ELISA法检测红细胞相关抗体及临床应用.中华血液学杂志，1993，14(8)：417～419
[2]施文霞，丁训杰.自身免疫性溶血性贫血研究进展.中华血液学杂志，1988，9(11)：691～692
[3]周有宁，林宝爵.328例AIHA免疫分型及实验指标分析.中华血液学杂志，1997，18(10)：549～550
[4]王昌富.红细胞相关Ig检测的进展.上海医学检验杂志，1991，6(1)：52～54
(收稿日期：1999-09-02), 百拇医药
单位：杨国元(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；王昌富(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；张万胜(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；虞咏知(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；李良风(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；黄知平(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)；鲁志英(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)
关键词：贫血，溶血性/自身免疫；亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸附测定
临床血液学杂志000207 摘 要：目的：寻求一种温抗体型自身免疫性溶血性贫血(WAIHA)的诊断方法，提高AIHA的诊断率。方法：用竞争抑制法原理，建立亲和素生物素化酶复合物酶联免疫吸咐测定(ASC-ELISA)，定量检测红细胞相关抗体(EAIgG)。共检测正常人60例，WAIHA患者41例，非免疫性溶血性贫血59例。结果：①正常组EAIgG值0.26±0.12 fg/RBC，EAIgG正常上限0.5 fg/RBC(
±2s)；WAIHA组为2.85±1.68 fg/RBC，与正常组比较，差异极为显著(P<0.001)；非免疫性贫血组为0.59±0.93 fg/RBC，与正常比较，差异不显著性(P>0.05)。②41例WAIHA患者中，37例Coombs试验阳性，4例Commbs试验阴性，患者临床表现典型，皮质激素治疗反应良好，EAIgG值均显著增高，可证实为WAIHA。③动态观察EAIgG值，随访10例患者，随着病情好转，Hb、RBC上升，Ret下降，EAIgG量减少。结论：定量检测EAIgG，可作为WAIHA的诊断指标之一，对Coombs试验阴性的WAIHA更具有诊断价值；EAIgG的动态观察可作为观察疗效和估计预后的指标。, 百拇医药
Quantitative Determination of EAIgG with ABC-ELISA and its Clinical Application
YANG Guo-yuan WANG Chang-fu ZHANG Wan-sheng YU Yong-zhi LI Liang-feng
HUANG ZHi-ping LU ZHi-ying DENG Ming-feng
(Jingzhou City Central Hospital,Jingzhou,Hubei,434100)
Abstract：Objective:Try to find a method in diagnosis of autoimmune hemolytic anemia with warm antibody (WAIHA).Methods:EAIgG (erythocyte associated IgG) was detected quantitatively by using ABC-ELISA.60 healthy people (controls),41 patients with WAIHA and 59 patients with non-immune anemia were estimated.Results:The normal superior limit of EAIgG was 0.5 fg/RBC(
±2s),EAIgG in patients with WAIHA were 2.85±1.68 fg/RBC,which was significantjly higher than those in control group (P<0.001),EAIgG in patients with non-immune anemia were 0.59±0.93 fg/RBC,there were no difference in non-immune anemia group and control group (P>0.05);37 of 41 patients with WAIHA were positiven in Coombs′ test and the next 4 patients were negative ,the EAIgG in those patients with negative Coombs′ test were significantly increased;The change of EAIgG in 10 patients were observed during their treatment,when patient′s condition got better,Hb,RBC rose and EAIgG decreased.Conclusion:Quantitative detection of EAigG was an index in the diagnosis of WAIHA,especially in the AIHA with negative Coombs′ test;keeping a close watch on EAIgG would be of great value in therapeutic effect obserration and prognostic evaluation in WAIHA., 百拇医药
Key words：Anemia,hemolytic/autoimmune ABC-ELISA▲
自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是一类由自身抗体和(或)补体吸咐于红细胞表面，导致红细胞破坏增多而引起的溶血性贫血。本室建立亲和素生物素化酶复化物酶联免疫吸咐测定(ABC-ELISA)，定量检测红细胞相关抗体(EAIgG)，用于AIHA的诊断和疗效观察，报道如下。
1 材料和方法
1.1 检测对象
1.1.1 正常对照组：60例(献血员、学生各30例)中男39例，女21例；年龄18～49岁；Hb 男>120 g/L，女>105 g/L。
1.1.2 温抗体型AIHA组(WAIHA组)：41例。男6例，女35例；系本院1988年1月～1999年6月收治的患者，依据1987年全国溶血性贫血学术会议标准确诊，原发性30例，继发性11例(系统性红斑狼疮8例，肾病综合征2例，类风湿性关节炎1例)。同时合并血小板减少(Evans综合征)5例。Hb(31～78)g/L，RBC(1.25～2.89)×1012/L，Ret 0.05～0.25[绝对值(107～375)×109/L]。
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1.1.3 非免疫性贫血组：59例，慢性再生障碍性贫血12例，缺铁性贫血35例，肾性贫血8例，肝硬化脾功能亢进4例。Hb(31～84)g/L，RBC(1.25～2.82)×1012/L，Ret 0.005～0.12[绝对值(107～188)×109/L]。
1.2 检测方法
ABC-ELISA法，按文献〔1〕方法。原理：采用竞争抑制法原理，将等量的人IgG包被于酶标反应板的微孔内，分别加入系列标准人IgG和待测的红细胞悬液，再加入定量生物素化鼠抗人IgG(b-MAHG)。因标准人IgG与红细胞相关IgG(EAIgG)的竞争，抑制部分b-MAHG与固相人IgG结合，结合于固相的b-MAHG连接ABC，后者作用于底物显色，其色泽深度与系列标准人IgG成反比，以标本吸光度查标准曲线，即知EAIgG的含量。
2 结果
, http://www.100md.com
①EAIgG测定结果：60例正常人为0.26±0.12 fg/RBC，41例WAIHA患者为2.85±1.68 fg/RBC，与正常组比较，差异极显著(P<0.001)；59例非免疫性贫血患者0.59±0.93 fg/RBC，与正常组比较，差异无显著性(P>0.05)。②41例WAIHA患者中，37例Coombs试验阳性，其EAIgG值为2.69±1.60 fg/RBC；4例Coombs试验阴性，其EAIgG值各为1.5，5.6，5.3，5.0(4.35±1.92)fg/RBC，两组相比差异无显著性(P>0.05)。③EAIgG值与病情的关系，见表1。从表1可见，随着病情好转，Ret下降，Hb、RBC上升。EAIgG值减少。
表1 EAIgG值与病情的关系 例号
EAIgG(fg/RBC)
Hb(g/L)
RBC(×1012/L)
, 百拇医药
Ret(×109/L)
治前
治后
治前
治后
治前
治后
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1
1.0
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49
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233
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4
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0.55
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35
117
1.25
4.53
197
172
5
3.6
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3.42
, 百拇医药
107
17
6
5.3
0.38
31
81
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2.85
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228
125
9
3.0
0.80
74
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2.60
3.80
312
152
10
, http://www.100md.com 3.2
1.00
45
105
1.38
3.42
232
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2.4
0.69
45
115
, 百拇医药
1.75
3.81
215
106
P
<0.01
<0.01
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3 讨论
我们采用ABC-ELISA法定量检测EAIgG，正常上限为0.5 fg/RBC(
±2s)，41例AIHA患者EAIgG值为2.85±1.68 fg/RBC，范围(0.9～7.4)fg/RBC，均超过正常值。59例非免疫性贫血EAIgG值为0.59±0.93fg/RBC。与正常组比较，差异不显著(P>0.05)，故EAIgG值可作为WAIHA诊断指标之一。本组41例WAIHA中，37例Coombs试验阳性，4例阴性。多年来学者们对Coombs试验阴性的AIHA引起重视，其确切的发病率尚无足够的统计资料，文献报道为2%～43%，此类患者具有AIHA的典型特征，对皮质激素反应良好，有的病情严重，Hb<30 g/L，甚至呈溶血危象，但常规Coombs试验却呈阴性，其原因除试剂或操作技术因素外，一般认为由于红细胞上抗体浓度过低，未能达到Coombs试验所能检测的阈值范围。Gilliland通过实验认为，一般需要500个IgG分子/RBC，Coombs试验才出现阳性，如在35～500个IgG/RBC，就处于Coombs试验阈值以下〔2〕。也有推测可能是急性溶血后大量致敏红细胞被破坏，使Coombs试验敏感性下降所致〔3〕。对于Coombs试验阴性的AIHA的检测方法的探讨，也是研究的重点，但迄今未有简便易行的方法可供推广应用。本组4例Coombs试验阴性，但EAIgG明显升高，各为1.5，5.6，5.3，5.0 fg/RBC。结合其临床表现，给予肾上腺皮质素激素治疗，疗效均显著，从而证实了AIHA的诊断，故采用本法检查EAIgG，对于Coombs试验阴性的WAIHA，更有诊断价值。对EAIgG值进行动态观察，可作为观察疗效和估计预后的指标。如表1所示，观察10例患者治疗前后EAIgG的变化，显示EAIgG值和Hb浓度、RBC数及网织红细胞数有明显的相关性。治疗显效，Hb、RBC上升，Ret下降，EAIgG值减低，与文献〔4〕报道一致。■, 百拇医药
作者单位：邓明凤(湖北省荆州市中心医院血液病研究室 荆州，434100)
参考文献：
[1]杨国元，王昌富，张国明，等.BAS-Coombs试验和ABC-ELISA法检测红细胞相关抗体及临床应用.中华血液学杂志，1993，14(8)：417～419
[2]施文霞，丁训杰.自身免疫性溶血性贫血研究进展.中华血液学杂志，1988，9(11)：691～692
[3]周有宁，林宝爵.328例AIHA免疫分型及实验指标分析.中华血液学杂志，1997，18(10)：549～550
[4]王昌富.红细胞相关Ig检测的进展.上海医学检验杂志，1991，6(1)：52～54
(收稿日期：1999-09-02), 百拇医药