容量超负荷心功能不全大鼠心肌组织细胞凋亡的观察
作者：韩福生 周令望 于维汉 刘阳 曾宪惠 曾绍娟
单位：(哈尔滨医科大学克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：细胞凋亡；心功能不全
中国地方病学杂志000204 摘要 目的 探讨细胞凋亡在心功能不全发生、发展过程中的作用。方法 复制了容量超负荷心功能不全大鼠模型，用TUNEL法对心肌组织进行了细胞凋亡检测。结果 心功能不全大鼠心肌组织存在异常细胞凋亡。结论 异常细胞凋亡可能通过减少心肌有效收缩成分而参与了心功能不全的发生、发展过程。
中图分类号 R541.6+1
文献标识码 A 文章编号 1000-4955(2000)02-0090-02
, http://www.100md.com Apoptosis in cardiac myocyte of rat heart with
cardiac dysfunction caused by volume-overload
HAN Fu-sheng,ZHOU Ling-wang, YU Wei-han, et al.
(Institute of Keshan Disease, Harbin Medical University,Harbin 150086，China)
Abstract Objective Investigate the role of apoptosis in the progress of cardiac dysfunction.Methods The dysfunctional rat heart with volume-overload was prepared. TUNEL method was used to detect apoptosis in myocardium. Results Abnormal apoptosis occurred in dysfunctional hearts.Conclusions It suggested that abnormal apoptosis is involved in the development of cardiac dysfunction. The mechanism may be due to the reduction of contractile tissue.
, 百拇医药
Key words Apoptosis；Cardiac dysfunction▲
细胞凋亡不仅在心脏的发生过程中，诸如瓣膜、心腔间膈的形成等起重要作用，而且也参与诸多心脏疾病发生、发展过程。我们复制了容量超负荷心功能不全大鼠模型，用TUNEL法[1]对心肌组织进行了细胞凋亡检测，以探讨细胞凋亡在心功能不全发生、发展过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 复制容量超负荷大鼠模型 选取体重150～180g健康SD大鼠，雌雄各半，随机分为心功能不全(cardiac dysfunction,CD)组及假手术(sham-operation,SO)组，参照Garvcia等人的方法[2]加以改进，行腹主动脉—后腔静脉造瘘术，SO组只分离腹主动脉、后腔静脉，但不造瘘。术后常规饲养、观察。
, http://www.100md.com 1.2 心功能测定[3，4] 大鼠饲养10周后，以RM-6000型八道生理记录仪、MFV-1200型电磁血流量计分别检测心率(HR)、平均颈动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室等容相室内压变化最大速率(±dp/dt max)，经股静脉以40ml/(kg.min)速度输入37℃的无菌Tyrode溶液(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,CaCl2 0.2g,MgCl2 0.1g,NaH2PO4 0.05g,NaHCO3 1.0g,Glucose 1.0g加去离子水至1 000ml)，测得左心室最大每搏量和最大每分钟输出量(peak cardiac output,pCO)，再根据容量负荷下左心室每分钟贮备量(cardiac output reverse function,CORF)=(pCO-CO)/CO×100%,计算CORF。摘取心脏,用0.1mol/L 磷酸缓冲液冲洗干净，4%多聚甲醛4℃固定过夜，常规石蜡包埋备检。
, 百拇医药
1.3 TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡 TUNEL试剂盒购自B.M公司。细胞凋亡的主要步骤：5μm厚心肌组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，逐级乙醇入水；加蛋白酶K(20μg/ml)，室温15min；3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，15min，室温；加TUNEL反应液(无菌去离子水340μl，5×TdT缓冲液100μl，25mmol/L CoCl2 100μl，25nmol/L荧光素标记dUTP 6μl，25U/μl TdT 3μl)覆盖组织切片，盖塑料膜，湿盒中37℃，1h；加POD，盖塑料膜，湿盒中37℃，30min；加DAB，10min，室温；甲基绿复染，系列乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，镜下观察，阳性结果为核呈棕黄色。对照染色：阳性对照为标记反应前用200ng/ml DNase I处理15min，阴性对照为标记反应液中省去TdT。
1.4 统计学处理 计量资料以平均值±标准差(
±s)表示，样本均数的比较用t检验；计数资料中两样本率的比较用χ2检验。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 实验大鼠心功能测定结果 腹主动脉—后腔静脉造瘘10周后，大鼠左室收缩压，左室等容相室内压变化最大速率均降低，左室舒张末压升高(表1)：心输出量增加，pCO及CORF降低(表2)，表明容量超负荷心功能不全模型已建立。
表1 SO组与CD组大鼠左心室收缩、舒张功能的变化(±s) 组别
n
(只)
HR
(次/分)
MAP
(kPa)
, http://www.100md.com
LVSP
(kPa)
+dp/dt max
(kPa/S)
LVEDP
(kPa)
-dp/dt max
(kPa)
SO
14
326±36
13.6±1.4
, 百拇医药 17.5±2.4
616±69
0.53±0.11
473±78
CD
32
376±30△
12.7±1.6△
14.8±1.5**
461±75**
0.77±0.25*
, 百拇医药
393±75*
注：与对照组比较，△P>0.05; *P<0.01；**P<0.001表2 SO组与CD组静息时心泵功能与心泵
贮备功能的比较(±s) 组别
n
(只)
CO
(ml/min)
pCO
(ml/min)
CORF
, 百拇医药
(%)
SO
14
54.5±6.4
160.6±24.8
195±40
CD
32
63.4±7.3**
124.5±19.0**
102±53**
注:为与对照比较，**P<0.001
, 百拇医药
2.2 TUNEL法检测心肌组织凋亡细胞的结果 细胞核呈棕黄色颗粒者即为凋亡细胞。在CD组大鼠心肌组织中，凋亡细胞主要见于心肌细胞，呈不规则散在分布；CD组32只大鼠心肌组织中，均可检测出凋亡心肌细胞100%，在SO组中仅有1例，可检测到凋亡心肌细胞(7.1%)，2组大鼠心肌细胞凋亡阳性率之间有显著性差异(P<0.005)。
3 讨论
心功能不全是种种心脏疾病发展的终末阶段。Narula等[5]曾报道，因心功能不全而接受心脏移植的4例扩张型心肌病和3例缺血性心脏病患者中，有5例可检测到心肌细胞凋亡(TUNEL法)。Oliventti[6]对末期衰竭心脏的研究也得出同样结论。实验表明，压力超负荷引起的心肌肥大伴有进行性细胞丧失和心肌纤维化。心肌肥大、细胞丧失和纤维化是导致心功能紊乱的主要因素。也有资料显示，慢性压力超负荷心肌肥大和心力衰竭时有细胞凋亡发生，肥大和衰竭心肌的细胞丧失方式与细胞凋亡相一致，为此，Bing[7]在1994年提出一个心衰发病机制的新假说，认为细胞凋亡可能是慢性压力超负荷导致心肌细胞死亡、心功能异常和心力衰竭的重要机制。晚近Sharov等[8]应用电子显微镜和原位末端标记法，观察因多支冠脉栓塞所致慢性心功能不全犬心肌时，发现心肌细胞皱缩、起泡，核碎裂及凋亡小体形成等细胞凋亡的形态学特征，从而证实了慢性心功能不全犬心肌存在异常细胞凋亡。
, 百拇医药
在细胞水平上，诱导细胞凋亡的因素可能为机械因素或者是升高的神经激素等，有人进行乳头肌牵张试验后，以TUNEL法检测，发现有0.64%的心肌细胞发生凋亡[9]。我们的实验结果显示，容量超负荷心功能不全大鼠心肌也同样有细胞凋亡发生，凋亡细胞呈不规则散在分布，这可能是在心脏容量超负荷时，或许其中又有某些因子在应力与凋亡之间起中介作用，而心肌细胞凋亡可能作为一种续动因素在心力衰竭的发生、发展进程中与始动因素(如容量超负荷)起着协同作用，也即容量超负荷等因素(直接或间接)诱发心肌细胞凋亡，后者使衰竭心肌细胞数量减少，进一步使心肌有形收缩成分减少，降低心脏功能，从而形成恶性循环。■
作者简介：韩福生，男，1965年生，讲师，博士
参考文献
[1] Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation[J]. J cell Biol, 1992,119(3):493～501.
, 百拇医药
[2] Garvcia R, Diebold S. Simple, rapid and effective method of producing aortovaval shunts in the rat[J]. Cardiovas Res,1990,24:430～436.
[3] 杜晓军，卢 兴，杨继声，等.心肌梗塞时心泵储备功能指标的实验研究探讨[J].中华心血管病杂志,1987,15(1):44～46.
[4] 张 静，杨继声.慢性高输出量型心功能不全发展过程中心室舒、缩功能和顺应性的变化及其与心泵功能的关系[J].中国病理生理杂志, 1992,8(4):341～345.
[5] Narula J,Hider N,Virmani R,et al.Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure[J].N Engl Med,1996,335:1182-1189.
, http://www.100md.com
[6] Olivetti G,Abbi R,Quaini F,et al.Apoptosis in the failing human heart[J].N Engl Med,1997,336:1131-1141.
[7] Bing OHL. Hypothesis.Apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload[J].J Mol Cell Cardiol, 1994,26:943～948.
[8] Sharov VG, Sabbah HN, Shimoyama H, et al.Evidence of cardiocyte Apoptosis in myocardium of dogs with chronic heart failure[J].Am J Pathol,1996,148(1):141～149.
[9] Cheng W,Li B,Kajstura J,et al.Streth-induced programmed myocyte cell death[J].J Clin Invest,1995,96:2247-2259.
收稿日期：1999-05-04
修订日期：1999-11-05, 百拇医药
单位：(哈尔滨医科大学克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)
关键词：细胞凋亡；心功能不全
中国地方病学杂志000204 摘要 目的 探讨细胞凋亡在心功能不全发生、发展过程中的作用。方法 复制了容量超负荷心功能不全大鼠模型，用TUNEL法对心肌组织进行了细胞凋亡检测。结果 心功能不全大鼠心肌组织存在异常细胞凋亡。结论 异常细胞凋亡可能通过减少心肌有效收缩成分而参与了心功能不全的发生、发展过程。
中图分类号 R541.6+1
文献标识码 A 文章编号 1000-4955(2000)02-0090-02
, http://www.100md.com Apoptosis in cardiac myocyte of rat heart with
cardiac dysfunction caused by volume-overload
HAN Fu-sheng,ZHOU Ling-wang, YU Wei-han, et al.
(Institute of Keshan Disease, Harbin Medical University,Harbin 150086，China)
Abstract Objective Investigate the role of apoptosis in the progress of cardiac dysfunction.Methods The dysfunctional rat heart with volume-overload was prepared. TUNEL method was used to detect apoptosis in myocardium. Results Abnormal apoptosis occurred in dysfunctional hearts.Conclusions It suggested that abnormal apoptosis is involved in the development of cardiac dysfunction. The mechanism may be due to the reduction of contractile tissue.
, 百拇医药
Key words Apoptosis；Cardiac dysfunction▲
细胞凋亡不仅在心脏的发生过程中，诸如瓣膜、心腔间膈的形成等起重要作用，而且也参与诸多心脏疾病发生、发展过程。我们复制了容量超负荷心功能不全大鼠模型，用TUNEL法[1]对心肌组织进行了细胞凋亡检测，以探讨细胞凋亡在心功能不全发生、发展过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 复制容量超负荷大鼠模型 选取体重150～180g健康SD大鼠，雌雄各半，随机分为心功能不全(cardiac dysfunction,CD)组及假手术(sham-operation,SO)组，参照Garvcia等人的方法[2]加以改进，行腹主动脉—后腔静脉造瘘术，SO组只分离腹主动脉、后腔静脉，但不造瘘。术后常规饲养、观察。
, http://www.100md.com 1.2 心功能测定[3，4] 大鼠饲养10周后，以RM-6000型八道生理记录仪、MFV-1200型电磁血流量计分别检测心率(HR)、平均颈动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室等容相室内压变化最大速率(±dp/dt max)，经股静脉以40ml/(kg.min)速度输入37℃的无菌Tyrode溶液(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,CaCl2 0.2g,MgCl2 0.1g,NaH2PO4 0.05g,NaHCO3 1.0g,Glucose 1.0g加去离子水至1 000ml)，测得左心室最大每搏量和最大每分钟输出量(peak cardiac output,pCO)，再根据容量负荷下左心室每分钟贮备量(cardiac output reverse function,CORF)=(pCO-CO)/CO×100%,计算CORF。摘取心脏,用0.1mol/L 磷酸缓冲液冲洗干净，4%多聚甲醛4℃固定过夜，常规石蜡包埋备检。
, 百拇医药
1.3 TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡 TUNEL试剂盒购自B.M公司。细胞凋亡的主要步骤：5μm厚心肌组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，逐级乙醇入水；加蛋白酶K(20μg/ml)，室温15min；3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，15min，室温；加TUNEL反应液(无菌去离子水340μl，5×TdT缓冲液100μl，25mmol/L CoCl2 100μl，25nmol/L荧光素标记dUTP 6μl，25U/μl TdT 3μl)覆盖组织切片，盖塑料膜，湿盒中37℃，1h；加POD，盖塑料膜，湿盒中37℃，30min；加DAB，10min，室温；甲基绿复染，系列乙醇脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，镜下观察，阳性结果为核呈棕黄色。对照染色：阳性对照为标记反应前用200ng/ml DNase I处理15min，阴性对照为标记反应液中省去TdT。
1.4 统计学处理 计量资料以平均值±标准差(
±s)表示，样本均数的比较用t检验；计数资料中两样本率的比较用χ2检验。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 实验大鼠心功能测定结果 腹主动脉—后腔静脉造瘘10周后，大鼠左室收缩压，左室等容相室内压变化最大速率均降低，左室舒张末压升高(表1)：心输出量增加，pCO及CORF降低(表2)，表明容量超负荷心功能不全模型已建立。
表1 SO组与CD组大鼠左心室收缩、舒张功能的变化(
±s) 组别n
(只)
HR
(次/分)
MAP
(kPa)
, http://www.100md.com
LVSP
(kPa)
+dp/dt max
(kPa/S)
LVEDP
(kPa)
-dp/dt max
(kPa)
SO
14
326±36
13.6±1.4
, 百拇医药 17.5±2.4
616±69
0.53±0.11
473±78
CD
32
376±30△
12.7±1.6△
14.8±1.5**
461±75**
0.77±0.25*
, 百拇医药
393±75*
注：与对照组比较，△P>0.05; *P<0.01；**P<0.001表2 SO组与CD组静息时心泵功能与心泵
贮备功能的比较(
±s) 组别n
(只)
CO
(ml/min)
pCO
(ml/min)
CORF
, 百拇医药
(%)
SO
14
54.5±6.4
160.6±24.8
195±40
CD
32
63.4±7.3**
124.5±19.0**
102±53**
注:为与对照比较，**P<0.001
, 百拇医药
2.2 TUNEL法检测心肌组织凋亡细胞的结果 细胞核呈棕黄色颗粒者即为凋亡细胞。在CD组大鼠心肌组织中，凋亡细胞主要见于心肌细胞，呈不规则散在分布；CD组32只大鼠心肌组织中，均可检测出凋亡心肌细胞100%，在SO组中仅有1例，可检测到凋亡心肌细胞(7.1%)，2组大鼠心肌细胞凋亡阳性率之间有显著性差异(P<0.005)。
3 讨论
心功能不全是种种心脏疾病发展的终末阶段。Narula等[5]曾报道，因心功能不全而接受心脏移植的4例扩张型心肌病和3例缺血性心脏病患者中，有5例可检测到心肌细胞凋亡(TUNEL法)。Oliventti[6]对末期衰竭心脏的研究也得出同样结论。实验表明，压力超负荷引起的心肌肥大伴有进行性细胞丧失和心肌纤维化。心肌肥大、细胞丧失和纤维化是导致心功能紊乱的主要因素。也有资料显示，慢性压力超负荷心肌肥大和心力衰竭时有细胞凋亡发生，肥大和衰竭心肌的细胞丧失方式与细胞凋亡相一致，为此，Bing[7]在1994年提出一个心衰发病机制的新假说，认为细胞凋亡可能是慢性压力超负荷导致心肌细胞死亡、心功能异常和心力衰竭的重要机制。晚近Sharov等[8]应用电子显微镜和原位末端标记法，观察因多支冠脉栓塞所致慢性心功能不全犬心肌时，发现心肌细胞皱缩、起泡，核碎裂及凋亡小体形成等细胞凋亡的形态学特征，从而证实了慢性心功能不全犬心肌存在异常细胞凋亡。
, 百拇医药
在细胞水平上，诱导细胞凋亡的因素可能为机械因素或者是升高的神经激素等，有人进行乳头肌牵张试验后，以TUNEL法检测，发现有0.64%的心肌细胞发生凋亡[9]。我们的实验结果显示，容量超负荷心功能不全大鼠心肌也同样有细胞凋亡发生，凋亡细胞呈不规则散在分布，这可能是在心脏容量超负荷时，或许其中又有某些因子在应力与凋亡之间起中介作用，而心肌细胞凋亡可能作为一种续动因素在心力衰竭的发生、发展进程中与始动因素(如容量超负荷)起着协同作用，也即容量超负荷等因素(直接或间接)诱发心肌细胞凋亡，后者使衰竭心肌细胞数量减少，进一步使心肌有形收缩成分减少，降低心脏功能，从而形成恶性循环。■
作者简介：韩福生，男，1965年生，讲师，博士
参考文献
[1] Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation[J]. J cell Biol, 1992,119(3):493～501.
, 百拇医药
[2] Garvcia R, Diebold S. Simple, rapid and effective method of producing aortovaval shunts in the rat[J]. Cardiovas Res,1990,24:430～436.
[3] 杜晓军，卢 兴，杨继声，等.心肌梗塞时心泵储备功能指标的实验研究探讨[J].中华心血管病杂志,1987,15(1):44～46.
[4] 张 静，杨继声.慢性高输出量型心功能不全发展过程中心室舒、缩功能和顺应性的变化及其与心泵功能的关系[J].中国病理生理杂志, 1992,8(4):341～345.
[5] Narula J,Hider N,Virmani R,et al.Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure[J].N Engl Med,1996,335:1182-1189.
, http://www.100md.com
[6] Olivetti G,Abbi R,Quaini F,et al.Apoptosis in the failing human heart[J].N Engl Med,1997,336:1131-1141.
[7] Bing OHL. Hypothesis.Apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload[J].J Mol Cell Cardiol, 1994,26:943～948.
[8] Sharov VG, Sabbah HN, Shimoyama H, et al.Evidence of cardiocyte Apoptosis in myocardium of dogs with chronic heart failure[J].Am J Pathol,1996,148(1):141～149.
[9] Cheng W,Li B,Kajstura J,et al.Streth-induced programmed myocyte cell death[J].J Clin Invest,1995,96:2247-2259.
收稿日期：1999-05-04
修订日期：1999-11-05, 百拇医药