红细胞与肝癌细胞免疫粘附实验观察
作者：邹东霆
单位：邹东霆(广州医学院肿瘤研究所，广州 510182)
关键词：红细胞；肝癌细胞；免疫粘附
广州医学院学报000227 中图分类号 R735.7 文献标识码：A
文章编号：1008-1836(2000)02-0075-01
红细胞(RBC)具有诸多免疫功能，已被视为机体免疫系统的重要组成部分[1]。其表面受体可与瘤细胞结合而攻击肿瘤[2]，在抗肿瘤免疫中起积极 作用。机制较为复杂，近年初步有用于临床检测。肝癌在我国较常见，由于肝内有丰富的血液供应，原发性肝癌的血行转移发生也较早和较多，给防治带来困难。免疫粘附肝癌细胞少见报道。现拟从几种不同条件观察RBC与肝癌细胞免疫粘附作用，探索RBC与肝癌细胞免疫作用的关系，为防治提供实验依据。
1 材料
1.1 人肝癌细胞系(GHC-3)，本实验室建立[3]。常规培养，取对数生长期培养细胞，消化、洗涤、离心，Hank`S液配成 1×106/ml悬液备用。
1.2 RBC 收集30例正常人新鲜抗凝血，生理盐水洗3次,生理盐水配成1×108/ml悬液备用。
1.3 人血清 20份正常人新鲜血清混合。
1.4 老化的人血清 在0℃下保存7天以上的正常人血清，生理盐水配成1:60备用。
2 方法
2.1 粘附作用试验
致敏的GHC-3细胞制备 取GHC-3细胞悬液0.05ml加入等量的新鲜人血清，混匀，37℃恒温水浴30min。生理盐水洗涤，离心，倾上清，恢复细胞浓度。
对照组 取致敏GHC-3细胞悬液0.05ml加入等量的RBC悬液，混匀，37℃恒温水浴30min。加0.25%戊二醛固定，涂片，瑞氏染色。随机观察100个肿瘤细胞，凡每个肿瘤细胞结合2个以上(含2个)RBC为一个花结[4]，计算花结百分率。
实验组A 取RBC悬液0.05ml加等量老化的人血清，37℃恒温水浴1h，洗涤后恢复细胞浓度。加等量已致敏的GHC-3细胞悬液，作 用30min，计算花结百分率。
实验组B 取GHC-3细胞悬液0.05ml加入等量老化的人血清，混匀作用30min，洗涤后恢复细胞浓度。加等量的RBC悬液，作用30min 计算花结百分率。
2.2 红细胞1型补体受体花环法(RBC-CR1R)[5]的DAB染色
取0.1mlRBC悬液，加等量老化的人血清，37℃恒温水浴1h。PBS-TWEEN 20洗3次，离心,倾上清。加1:1000 HRP-抗C3 0.1ml, 37℃恒温水浴1h。PBS-TWEEN 20洗3次，倾上清，加底物溶液DAB-H2O2显色30min，洗3次，涂片。镜下观察，RBC膜上显示棕黄色为阳性。
3 结果与讨论
本实验室已建立稳定的红细胞免疫粘附(RCIA)GHC-3细胞的红细胞肿瘤花环法(R-TR)[4]，与经典的RBC-CR1R试验相一致。本实验运 用R-TR法以新鲜或老化人血清致敏/封闭等不同条件，观察人肝癌细胞GHC-3与RBC结花情况。结果：对照组的花环率为35.3±4.5%， 实验组A的花环率为12±1.6%，实验组B的花环率为10.1±1.1%。经t检验统计处理，实验组与对照组差异显著(P<0.01)。RBC-CR1R的DAB染色结果呈阳性。
C3b是RBC表面受体的相应配体，致敏的GHC-3可经旁路激活并粘附有C3b的瘤细胞，与RBC相遇结成花环。RBCC3b受体(CR1)通过HRP-抗C3，可以用底物DAB显色显示出来。本实验结果表明，人肝癌细胞GHC-3表面经粘附C3b作为配体，与RBC之C3b-R连接。老化人血清中补体C3已失活，但仍可与C3b-R结合。酶免疫法的结果呈阳性证明老化人血清中的C3b可与RBC膜上C3b-R结合[4]，而由于RBC表面C3b-R受封闭，致敏瘤细胞在结花则明显下降，提示以上所形成的RBC-T花环为免疫粘附。
肿瘤细胞可经旁路激活补体，而RBC通过CR1免疫粘附多种已致敏的肿瘤细胞[2]。当前国内多采用艾氏腹水癌细胞做R-TR。由于肝癌有丰富的血液供应，而原发性肝癌的转移发生最早和最常见是血行转移，现以人肝癌细胞GHC-3做R-TR，有一定实际意义。
作者简介：邹东霆，女(1969.3-)，大专，助理实验师。研究方向：肿瘤发病机制。
参考文献
[1] SiegelI,Liu TL,Gieicher N.The red-cell immune system[J].Lancet，1981;2(8246)：556
[2] 郭峰，黄盛东，赫丽等.红细胞在肿瘤免疫反应中的作用[J].中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(3)：183～186
[3] 葛曰萍，陈尊器，王羲等.新建的一株人肝癌细胞系(GHC-3)及其特性[J].肿瘤，1991；11(3)：136～138
[4] 苏杭，葛曰萍.肿瘤红细胞免疫研究的进展[J].现代临床医学生物工程学杂志，1996； 2(2)：154～156
[5] 郭峰.红细胞免疫及其调节功能测定方法[J].免疫学杂志,1990；6(1)；60～65
(收稿：1999-10-12)
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