多巴胺诱导PC12细胞凋亡的机制
作者：陈晓春 朱理安 黄春
单位：福建医科大学附属协和医院、福建省老年医学研究所，福州 350001
关键词：多巴胺；大鼠嗜铬细胞瘤细胞株；凋亡；帕金森病
福建医科大学学报000201
摘要:目的 探讨多巴胺(DA)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)细胞凋亡的机制。方法 采用PC12细胞为模型，以0.45 mmol/L的DA来诱导细胞凋亡的发生，用流式细胞仪检测PC12细胞的亚二倍体峰，按Griess法测定NO代谢产物NO2-的浓度，用Ac-DEVD-AMC为酶作用底物，在荧光分光光度计下检测CPP32 活力。结果 DA处理组的凋亡率为54.49%±1.60%，与阴性对照组(1.61%±0.18%)比较差异有显著性(P<0.01)；NO2-浓度的升高和CPP32活化程度与阴性对照组比较差异亦有显著性(P<0.01)。结论 CPP32的激活是DA诱导PC12细胞凋亡的重要通路，而合成增多的NO可能是DA激活CPP32的信号传递分子。
, 百拇医药
中图分类号:R745.02;R329.25;R972.1 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0093-03
Mechanism of Dopamine Induced Apoptosis of PC12 Cell
CHEN Xiao-chun,ZHU Li-an,HUANG Chun
(The Affiliated of Union Hospital,Fujian Medical University,Fujian Institute of Geriatrics,Fuzhou 350001,China)
ABSTRACT:Objective To investigate the possible mechanism of dopamine(DA) induced pheochromocytoma(PC12) cell apoptosis.Methods In this study,we used PC12 cell as cell model.Apoptosis is induced by DA(0.45 mmol/L).The subdiploid peak were detected with flow cytometry,and nitrite was quantified by the Griess reaction.Activity of caspase-3(CPP-32) was measured using a spectrofluorometer with enzyme substrate Ac-DEVD-AMC.Results The ratio of apoptosis induced by DA was 54.49%±1.60% significantly higher than that of the negative control group(P<0.01).The levels of NO formation and activity of CPP32 in DA group were significantly higher than those of the negative control group(P<0.01).Conclusion The activation of CPP32 was a important pathway that DA induced PC12 cell apoptosis,and the increasing levels of NO formation was a necessary signaling molecule of the activation of CPP32.
, 百拇医药
KEY WORDS:dopamine;pheochromocytoma cells;apoptosis;Parkinson's disease
帕金森病(Parkinson disease,PD)是一种以中脑黑质多巴胺能神经元脱失为主要病理特征的神经系统变性疾病。已有实验研究表明，细胞凋亡在其发病机制中起重要的作用[1～3]。神经递质多巴胺(dopamine,DA)代谢过程中所产生的活性氧、醌或自由基可能是造成黑质DA能神经元损害的主要原因[4,5]。但一氧化氮(NO)是否参与这个损害过程，目前不十分清楚。笔者于1999年4月～12月采用大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(pheochromocytoma cells,PC12)做为体外DA能神经元的细胞模型，观察DA对PC12细胞凋亡的诱导作用，并通过测定NO代谢产物亚硝酸盐(NO2-)和细胞凋亡过程中的主要介质—天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3,CPP32)活力，探讨NO在DA诱导PC12细胞凋亡过程中的作用，为帕金森病发病机制的研究提供新的实验依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养和药物处理 PC12细胞(由中国医学科学院上海细胞研究所提供)接种在预先铺过鼠尾胶的培养皿中，用含10%胎牛血清和10%马血清的DMEM培养液，置CO2培养箱(3131型,美国Forma科学公司)在37℃ 5%CO2条件下培养，取处于对数生长期的细胞 (细胞密度为1×105个细胞/ml)进行实验。DA处理组加入DA使其终浓度为0.45 mmol/L；阴性对照组加入DMEM培养液。两组均在处理后继续培养24 h，再测定各相关实验指标。
1.2 亚二倍体峰的检测 培养细胞以PBS洗2次，用0.25%胰酶消化1 min，弃胰酶液，加pH 7.4的PBS液，用吸管轻轻吹吸制成单细胞悬液(5×105个细胞/ml)，经1000 r/min离心5 min，弃上清液即获样本液。在样本液100 μl中加入含50 mg/L碘化丙啶(PI)和50 mg/L核糖核酸酶(RNAase)的染液500 μl，避光、37℃孵育30 min。用流式细胞仪(FCM，Bryte HS型美国Bio-RAD公司)采集数据进行亚二倍体峰(即凋亡峰)分析,计算凋亡率。
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1.3 NO代谢产物NO2-的测定 收集培养细胞上清液，按Griess法测定NO代谢产物NO2-，上清液中加入4 mol/L盐酸处理10 min，然后加入2 mg/ml的对氨基苯磺酸和1 mg/ml N-1-萘基乙二胺，孵育30 min后置分光光度计(7520型,上海分析仪器厂)中测吸光值(波长546 mm)。测定管吸光值以标准管吸光值作参照。
1.4 CPP32活力的测定 培养细胞以PBS快速漂洗2次，吸去PBS，加入细胞溶解液100 μl溶解细胞(细胞密度为1×106个细胞/ml)，并在各管中分别加入终浓度为1 μg/μl的CPP32酶作用底物Ac-DEVD-AMC 10 μl，用HEPES缓冲液加到1 ml，然后再加入的溶解后细胞液100 μl，在37℃下孵育60 min，置荧光分光光度计(RF-5301PC型,日本岛津公司)下检测AMC含量(激发波长为380 nm，吸收波长为440 nm)。
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2 结 果
2.1 DA对PC12细胞凋亡的影响 细胞凋亡DNA被降解，形成长度为180～200 bp整倍数的寡聚核苷酸片段。在PI荧光的直方图上表现为G0～G1期前特征性亚二倍体峰(sub-G1)，根据该峰所占比例，进行细胞凋亡定量分析(附图)。DA处理组的凋亡率为54.49%±1.60%，阴性对照组1.61%±0.18%，经t'检验比较，DA处理组与阴性对照组间差异有显著性(P<0.01)。
附图 PI荧光直方图
A.对照组G0～G1期前未见亚二倍体峰; B:DA处理组G0～G1期前出现亚二倍体峰.
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2.2 DA对NO2-的影响 培养PC12细胞上清液在分光光度计下测得DA处理组、阴性对照组NO2-相对浓度分别为18.00±0.07和1.82±0.05 μmol/L，两组间差异经t'检验亦有显著性(P<0.01)。
2.3 DA对PC12细胞CPP32活力的影响 用荧光分光光度计，以标准AMC荧光强度为参照，分别测得DA处理组、阴性对照组相对AMC荧光强度为685.40±4.91和467.90±5.22，经t'检验组间比较差异有显著性(P<0.01)。
3 讨 论
3.1 多巴胺(DA)具有细胞毒性作用，能诱导PC12细胞发生凋亡 DA是体内一种重要的神经递质，越来越多的研究表明，其代谢中间产物能造成黑质DA能神经元的损害。DA的神经毒性作用与其独特的分子结构有关，其分子结构中含有一个不稳定的儿茶酚基团，在体内可自动氧化或在体外经酶促反应生成活性氧、醌或自由基，后三者可损伤黑质DA能神经元。因此，人们推测DA可能作为内源性毒素参与帕金森病的发病过程。PC12细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，它能分泌多巴胺，产生谷胱甘肽和表达DA受体，与黑质DA能神经元有许多相同的特征，因此被广泛用作研究黑质DA能神经元的细胞模型。笔者也采用了该细胞作为模型。研究结果表明,0.45 mmol/L的DA可诱导PC12细胞发生凋亡，其细胞凋亡率高达54.49%，与一些学者研究结果基本一致[6，7]，也进一步证实DA对体外培养细胞确实存在毒性作用。
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3.2 NO是DA诱导PC12细胞凋亡的重要信号分子 NO在调节细胞生存状态方面发挥着复杂的生理功能，其生物学效应与自身浓度、细胞氧化还原状态和特殊细胞类型有关。因此NO在细胞凋亡的作用上具有双重性，即其可诱导、也可预防细胞凋亡的发生。目前研究发现，NO是重要的神经传递信使分子，但其神经毒性作用也倍受关注，它在中枢神经系统中介导从突触前膜释放的谷氨酸与N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体结合，开放Ca2+通道，促使Ca2+内流，造成神经细胞凋亡。笔者的结果证实，在DA诱导PC12细胞凋亡的过程中，NO的代谢产物NO2-浓度明显升高，比阴性对照组高出3倍，提示在DA诱导PC12细胞凋亡的过程中NO可能作为应激氧化反应的中间代谢产物发挥作用。在凋亡的过程中NO合成增多与可诱导型NO合成酶mRNA表达增加有关[8]。
3.3 CPP32的激活是DA诱导PC12细胞凋亡的通路 细胞凋亡的分子机制和信号传导途径近年来始终是细胞和分子生物学领域的研究热点。越来越多的实验证实半胱氨酸蛋白酶-3在细胞凋亡调节过程中起关键作用，特别是CPP32被认为是细胞凋亡蛋白酶联反应的必经之路。有研究报道显示，NO供体能激活CPP32活性诱导细胞凋亡[9]。另有研究报道,发现NO供体诱导细胞凋亡与下调bcl-2表达和上调bax表达有关[10]，而Bcl-2蛋白是重要的抑制细胞凋亡的蛋白，它通过抑制CPP32的活化在半胱氨酸蛋白酶-3的上游发挥抑制凋亡的调控作用。笔者的研究发现，在DA诱导PC12细胞凋亡的过程中，不但有NO合成增多，而且有CPP32活性增高，增高程度为阴性对照组的1.4倍，提示CPP32的激活是DA诱导PC12细胞凋亡的重要通路，而合成增多的NO可能是DA激活CPP32的信号传递分子。
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基金项目:福建省自然科学基金重点课题资助项目(C030313)
作者简介:陈晓春(1963～)，男，副主任医师，副教授,医学硕士.
参考文献:
[1]Mochizuki H,Goto K,Mori H,et al.Histochemical detection of apoptosis in Parkinson's disease[J].J Neurol Sci,1996,137:120.
[2]Anglade P,Vyas S,Javoy-Agid F,et al.Apoptosis and autopathy in nigral neurons of patients with Parkinson's disease[J].Histol Histopathol,1997,12:25.
, 百拇医药
[3]Tomkins MM,Basgill EJ,Zamrini E,et al.Apoptotic-like changes in Lewy-body-associated disorders and normal aging in substantia nigral neurons[J].Am J Pathol,1997,150:119.
[4]Offen D,Ziv I,Stermin H,et al.Prevention of dopamine-induced cell death by thionyl antioxidants: possible implications for treatment of Parkinson's disease[J].Exp Neurol,1996,141:32.
[5]Luo Y,Umegaki H,Wang X,et al.Dopamine induces apoptosis through an oxidation-involved SAPK/JNK activation pathway[J].J Biol Chem,1998,273:3756.
, 百拇医药
[6]Ziv I,Offen D,Barzilai A,et al.Modulation of control mechanisms of dopamine-induced apoptosis: a future approach to the treatment of Parkinson's disease[J].J Neural Transm,1997,49:195.
[7]Kang C,Jang J,Kim K,et al.Activation of c-jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinase and the decreased ratio of Bcl-2 to Bax are associated with the auto-oxidized dopamine-induced apoptosis in PC12 cells[J].Neurosci Lett,1998,256:37.
, 百拇医药
[8]Chung KC,Park JH,Kim CH,et al.Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells[J].J Neurochem,1999,72:1462.
[9]Maiese K,Vincent AM.Group I metabotropic receptors down-regulate nitric oxide induced caspase-3 activity in rat hippocampal neurons[J].Neurosci Lett,1999,264:17.
[10]Rodriguez-Lopez AM,Martinez-Salgado C,Eleno N,et al.Nitric oxide is involved in apoptosis induced by thapsigargin in rat mesangial cells[J].Cell Physiol Biochem,1999,9:285.
收稿日期:2000-04-10, http://www.100md.com
单位：福建医科大学附属协和医院、福建省老年医学研究所，福州 350001
关键词：多巴胺；大鼠嗜铬细胞瘤细胞株；凋亡；帕金森病
福建医科大学学报000201
摘要:目的 探讨多巴胺(DA)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)细胞凋亡的机制。方法 采用PC12细胞为模型，以0.45 mmol/L的DA来诱导细胞凋亡的发生，用流式细胞仪检测PC12细胞的亚二倍体峰，按Griess法测定NO代谢产物NO2-的浓度，用Ac-DEVD-AMC为酶作用底物，在荧光分光光度计下检测CPP32 活力。结果 DA处理组的凋亡率为54.49%±1.60%，与阴性对照组(1.61%±0.18%)比较差异有显著性(P<0.01)；NO2-浓度的升高和CPP32活化程度与阴性对照组比较差异亦有显著性(P<0.01)。结论 CPP32的激活是DA诱导PC12细胞凋亡的重要通路，而合成增多的NO可能是DA激活CPP32的信号传递分子。
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中图分类号:R745.02;R329.25;R972.1 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0093-03
Mechanism of Dopamine Induced Apoptosis of PC12 Cell
CHEN Xiao-chun,ZHU Li-an,HUANG Chun
(The Affiliated of Union Hospital,Fujian Medical University,Fujian Institute of Geriatrics,Fuzhou 350001,China)
ABSTRACT:Objective To investigate the possible mechanism of dopamine(DA) induced pheochromocytoma(PC12) cell apoptosis.Methods In this study,we used PC12 cell as cell model.Apoptosis is induced by DA(0.45 mmol/L).The subdiploid peak were detected with flow cytometry,and nitrite was quantified by the Griess reaction.Activity of caspase-3(CPP-32) was measured using a spectrofluorometer with enzyme substrate Ac-DEVD-AMC.Results The ratio of apoptosis induced by DA was 54.49%±1.60% significantly higher than that of the negative control group(P<0.01).The levels of NO formation and activity of CPP32 in DA group were significantly higher than those of the negative control group(P<0.01).Conclusion The activation of CPP32 was a important pathway that DA induced PC12 cell apoptosis,and the increasing levels of NO formation was a necessary signaling molecule of the activation of CPP32.
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KEY WORDS:dopamine;pheochromocytoma cells;apoptosis;Parkinson's disease
帕金森病(Parkinson disease,PD)是一种以中脑黑质多巴胺能神经元脱失为主要病理特征的神经系统变性疾病。已有实验研究表明，细胞凋亡在其发病机制中起重要的作用[1～3]。神经递质多巴胺(dopamine,DA)代谢过程中所产生的活性氧、醌或自由基可能是造成黑质DA能神经元损害的主要原因[4,5]。但一氧化氮(NO)是否参与这个损害过程，目前不十分清楚。笔者于1999年4月～12月采用大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(pheochromocytoma cells,PC12)做为体外DA能神经元的细胞模型，观察DA对PC12细胞凋亡的诱导作用，并通过测定NO代谢产物亚硝酸盐(NO2-)和细胞凋亡过程中的主要介质—天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3,CPP32)活力，探讨NO在DA诱导PC12细胞凋亡过程中的作用，为帕金森病发病机制的研究提供新的实验依据。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养和药物处理 PC12细胞(由中国医学科学院上海细胞研究所提供)接种在预先铺过鼠尾胶的培养皿中，用含10%胎牛血清和10%马血清的DMEM培养液，置CO2培养箱(3131型,美国Forma科学公司)在37℃ 5%CO2条件下培养，取处于对数生长期的细胞 (细胞密度为1×105个细胞/ml)进行实验。DA处理组加入DA使其终浓度为0.45 mmol/L；阴性对照组加入DMEM培养液。两组均在处理后继续培养24 h，再测定各相关实验指标。
1.2 亚二倍体峰的检测 培养细胞以PBS洗2次，用0.25%胰酶消化1 min，弃胰酶液，加pH 7.4的PBS液，用吸管轻轻吹吸制成单细胞悬液(5×105个细胞/ml)，经1000 r/min离心5 min，弃上清液即获样本液。在样本液100 μl中加入含50 mg/L碘化丙啶(PI)和50 mg/L核糖核酸酶(RNAase)的染液500 μl，避光、37℃孵育30 min。用流式细胞仪(FCM，Bryte HS型美国Bio-RAD公司)采集数据进行亚二倍体峰(即凋亡峰)分析,计算凋亡率。
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1.3 NO代谢产物NO2-的测定 收集培养细胞上清液，按Griess法测定NO代谢产物NO2-，上清液中加入4 mol/L盐酸处理10 min，然后加入2 mg/ml的对氨基苯磺酸和1 mg/ml N-1-萘基乙二胺，孵育30 min后置分光光度计(7520型,上海分析仪器厂)中测吸光值(波长546 mm)。测定管吸光值以标准管吸光值作参照。
1.4 CPP32活力的测定 培养细胞以PBS快速漂洗2次，吸去PBS，加入细胞溶解液100 μl溶解细胞(细胞密度为1×106个细胞/ml)，并在各管中分别加入终浓度为1 μg/μl的CPP32酶作用底物Ac-DEVD-AMC 10 μl，用HEPES缓冲液加到1 ml，然后再加入的溶解后细胞液100 μl，在37℃下孵育60 min，置荧光分光光度计(RF-5301PC型,日本岛津公司)下检测AMC含量(激发波长为380 nm，吸收波长为440 nm)。
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2 结 果
2.1 DA对PC12细胞凋亡的影响 细胞凋亡DNA被降解，形成长度为180～200 bp整倍数的寡聚核苷酸片段。在PI荧光的直方图上表现为G0～G1期前特征性亚二倍体峰(sub-G1)，根据该峰所占比例，进行细胞凋亡定量分析(附图)。DA处理组的凋亡率为54.49%±1.60%，阴性对照组1.61%±0.18%，经t'检验比较，DA处理组与阴性对照组间差异有显著性(P<0.01)。
附图 PI荧光直方图
A.对照组G0～G1期前未见亚二倍体峰; B:DA处理组G0～G1期前出现亚二倍体峰.
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2.2 DA对NO2-的影响 培养PC12细胞上清液在分光光度计下测得DA处理组、阴性对照组NO2-相对浓度分别为18.00±0.07和1.82±0.05 μmol/L，两组间差异经t'检验亦有显著性(P<0.01)。
2.3 DA对PC12细胞CPP32活力的影响 用荧光分光光度计，以标准AMC荧光强度为参照，分别测得DA处理组、阴性对照组相对AMC荧光强度为685.40±4.91和467.90±5.22，经t'检验组间比较差异有显著性(P<0.01)。
3 讨 论
3.1 多巴胺(DA)具有细胞毒性作用，能诱导PC12细胞发生凋亡 DA是体内一种重要的神经递质，越来越多的研究表明，其代谢中间产物能造成黑质DA能神经元的损害。DA的神经毒性作用与其独特的分子结构有关，其分子结构中含有一个不稳定的儿茶酚基团，在体内可自动氧化或在体外经酶促反应生成活性氧、醌或自由基，后三者可损伤黑质DA能神经元。因此，人们推测DA可能作为内源性毒素参与帕金森病的发病过程。PC12细胞来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，它能分泌多巴胺，产生谷胱甘肽和表达DA受体，与黑质DA能神经元有许多相同的特征，因此被广泛用作研究黑质DA能神经元的细胞模型。笔者也采用了该细胞作为模型。研究结果表明,0.45 mmol/L的DA可诱导PC12细胞发生凋亡，其细胞凋亡率高达54.49%，与一些学者研究结果基本一致[6，7]，也进一步证实DA对体外培养细胞确实存在毒性作用。
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3.2 NO是DA诱导PC12细胞凋亡的重要信号分子 NO在调节细胞生存状态方面发挥着复杂的生理功能，其生物学效应与自身浓度、细胞氧化还原状态和特殊细胞类型有关。因此NO在细胞凋亡的作用上具有双重性，即其可诱导、也可预防细胞凋亡的发生。目前研究发现，NO是重要的神经传递信使分子，但其神经毒性作用也倍受关注，它在中枢神经系统中介导从突触前膜释放的谷氨酸与N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体结合，开放Ca2+通道，促使Ca2+内流，造成神经细胞凋亡。笔者的结果证实，在DA诱导PC12细胞凋亡的过程中，NO的代谢产物NO2-浓度明显升高，比阴性对照组高出3倍，提示在DA诱导PC12细胞凋亡的过程中NO可能作为应激氧化反应的中间代谢产物发挥作用。在凋亡的过程中NO合成增多与可诱导型NO合成酶mRNA表达增加有关[8]。
3.3 CPP32的激活是DA诱导PC12细胞凋亡的通路 细胞凋亡的分子机制和信号传导途径近年来始终是细胞和分子生物学领域的研究热点。越来越多的实验证实半胱氨酸蛋白酶-3在细胞凋亡调节过程中起关键作用，特别是CPP32被认为是细胞凋亡蛋白酶联反应的必经之路。有研究报道显示，NO供体能激活CPP32活性诱导细胞凋亡[9]。另有研究报道,发现NO供体诱导细胞凋亡与下调bcl-2表达和上调bax表达有关[10]，而Bcl-2蛋白是重要的抑制细胞凋亡的蛋白，它通过抑制CPP32的活化在半胱氨酸蛋白酶-3的上游发挥抑制凋亡的调控作用。笔者的研究发现，在DA诱导PC12细胞凋亡的过程中，不但有NO合成增多，而且有CPP32活性增高，增高程度为阴性对照组的1.4倍，提示CPP32的激活是DA诱导PC12细胞凋亡的重要通路，而合成增多的NO可能是DA激活CPP32的信号传递分子。
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基金项目:福建省自然科学基金重点课题资助项目(C030313)
作者简介:陈晓春(1963～)，男，副主任医师，副教授,医学硕士.
参考文献:
[1]Mochizuki H,Goto K,Mori H,et al.Histochemical detection of apoptosis in Parkinson's disease[J].J Neurol Sci,1996,137:120.
[2]Anglade P,Vyas S,Javoy-Agid F,et al.Apoptosis and autopathy in nigral neurons of patients with Parkinson's disease[J].Histol Histopathol,1997,12:25.
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[3]Tomkins MM,Basgill EJ,Zamrini E,et al.Apoptotic-like changes in Lewy-body-associated disorders and normal aging in substantia nigral neurons[J].Am J Pathol,1997,150:119.
[4]Offen D,Ziv I,Stermin H,et al.Prevention of dopamine-induced cell death by thionyl antioxidants: possible implications for treatment of Parkinson's disease[J].Exp Neurol,1996,141:32.
[5]Luo Y,Umegaki H,Wang X,et al.Dopamine induces apoptosis through an oxidation-involved SAPK/JNK activation pathway[J].J Biol Chem,1998,273:3756.
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[6]Ziv I,Offen D,Barzilai A,et al.Modulation of control mechanisms of dopamine-induced apoptosis: a future approach to the treatment of Parkinson's disease[J].J Neural Transm,1997,49:195.
[7]Kang C,Jang J,Kim K,et al.Activation of c-jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinase and the decreased ratio of Bcl-2 to Bax are associated with the auto-oxidized dopamine-induced apoptosis in PC12 cells[J].Neurosci Lett,1998,256:37.
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[8]Chung KC,Park JH,Kim CH,et al.Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells[J].J Neurochem,1999,72:1462.
[9]Maiese K,Vincent AM.Group I metabotropic receptors down-regulate nitric oxide induced caspase-3 activity in rat hippocampal neurons[J].Neurosci Lett,1999,264:17.
[10]Rodriguez-Lopez AM,Martinez-Salgado C,Eleno N,et al.Nitric oxide is involved in apoptosis induced by thapsigargin in rat mesangial cells[J].Cell Physiol Biochem,1999,9:285.
收稿日期:2000-04-10, http://www.100md.com