改良的软骨组织块培养法
作者：张晨 王玉彬 柏树令 高景恒
单位：张晨(辽宁省人民医院整形外科 110015)；高景恒(辽宁省人民医院整形外科 110015)；王玉彬(锦州医学院普外科)；柏树令(中国医科大学基础医学院解剖学教研室)
关键词：组织块培养法；软骨；组织工程
实用美容整形外科杂志000203 摘要 为软骨的组织工程的临床应用寻求一种与之相适应的体外扩增种子细胞的方法。 将传统的组织块培养法进行改良，在置入培养皿前先以0.25%胰蛋白酶、0.08% EDTA及0.1%睾丸透明质酸酶消化软骨组织块(实验组)，以传统的组织块培养法为对照组进行培养。结果：在培养的第3天，实验组贴壁率为88.89%(32/36)，对照组为68.89%(23/36)(P<0.05)；培养后的第30天，实验组的细胞簇形成阳性率为100%(12/12)，而对照组为0(0/12)(P<0.01)。结论：改良的软骨组织块培养法优于传统的组织块培养法，更适合于软骨的组织工程临床应用。
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Modified method of explant culture of cartilage
Zhang Chen Wang Yubin Bai Shuling, et al.
(Department of Anatomy, Basic Medical College, China Medical University. Shenyang. P.R China 110015)
Abstract To search a method suitable to amplify cells that will be used as seeds in clinical application of cartilage tissue engineering in the future, the traditional explant cutures were modified by digesting the pieces of cartilage with 0.25% trypsin, 0.08% EDTA and 0.1% hyaluronidase before they were placed in dishes (experimental group), the traditional as control. Results: After 3 days of culture, 88.89 percent (32/36) of the pieces in experimental group adhered to the dishes while 68.89 percent (23/36) of the pieces in control group adhered (P<0.05); After 30 days of culture, cell clones appeared in 100 percent (12/12) of the experimental group, but none appeared in the control group (0/12) (P<0.01) Conclusion: The modified explant cultures are more suitable to the clinical application of cartilage tissue engineering than the traditional one.
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Key Words Explant cultures, Cartilage, Tissue engineering
软骨组织工程的研究是组织工程领域研究最广泛、最深入的一个领域。在不远的将来它将应用于临床。但如何把活检取出的自体微量组织在体外大量扩增为种子细胞，仍是该领域尚待解决的问题。这主要有两点原因：①微量的软骨组织经过多次酶解和反复冲洗后，细胞的损失量较大，细胞数量少则不利细胞贴壁进而繁殖；②采用传统的组织块培养法，软骨的组织块需很长时间贴壁，从而影响组织细胞的迁出。为此我们对传统的组织块培养法进行改进并与之在某一时间点的组织块贴壁率及细胞簇形成率方面进行比较，从而获得了一种优于传统方法的组织块培养法，即改良的软骨组织块培养法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 成年新西兰大白兔一只，雌雄及体重不限。
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1.1.2 TE消化液 为胰蛋白酶和EDTA的复合消化液，0.25%胰蛋白酶(1∶250，Sigma公司)，0.08% EDTA。
1.1.3 0.1%睾丸透明质酸酶(Sigma公司)。
1.1.4 PBS复合液 0.01mol PBS，pH7.4，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml。
1.1.5 培养液 DMEM(低糖，Hyclone公司)，含10%胎牛血清(中国医科院天津血研所)，维生素C 50mg/ml，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml。
1.1.6 24孔培养板(Corning公司)。
1.2 方法 846注射液1ml肌肉注射施全麻，在兔耳背侧中部切开皮肤，仔细剥去软骨膜，切取2cm×4cm软骨，置入PBS复合液，去除软骨腹面残留骨膜，PBS复合液洗涤2次，将软骨剪成1cm×1cm大小的碎块，PBS复合液洗涤三次，800rpm离心10分钟，去上清备用。
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1.2.1 传统组织块培养法(对照组) 取部分软骨块，以每孔三块，距离0.5～1.0cm的密度置入24孔培养板的A、B两排孔内，向每孔缓慢注入培养液，培养液的注入量以恰好漫过软骨块上面为准。
1.2.2 改良组织块培养法(实验组) 剩余的软骨块先以TE消化液在37℃水浴箱中消化30分钟，PBS复合液洗涤二次，800rpm离心10分钟，再加入0.1%睾丸透明质酸酶37℃水浴消化30分钟，PBS复合液冼涤二次，800rpm离心10分钟，将消化过的软骨碎块同样以每孔三块，距离0.5～1.0cm的密度置入24孔培养板C、D两排孔内，以对照组的方式加入培养液。
将载有两组软骨碎块的培养板置CO2孵箱内培养，其中CO2浓度5%，湿度95%，温度37℃。孵育3天后再向各孔内注入1ml培养液，此后每3天换液一次。每日用倒置显微镜观察组织块周边的细胞迁出及细胞簇形成情况。
, 百拇医药
2 结果
2.1 72小时组织块贴壁率 培养至72小时，轻轻晃动培养板，观察每孔内的软骨块是否随之飘动，不动者视为贴壁，飘动者视未贴壁，观察结果见表1。
表1 培养72小时实验组与对照组的贴壁情况(单位：块)
贴 壁 情 况
合计
贴壁率(%)
贴 壁
未贴壁
实验组
32
4
, 百拇医药
36
88.89*
对照组
23
13
36
63.89
* χ2=6.24 P<0.05
2.2 显微镜观察
2.2.1 实验组 培养至第13天，在组织块的周边区域可见迁出的细胞及其形成的细胞簇，早期细胞簇3～5个细胞不等，无极性，散在排列，细胞呈梭形向两端伸延。2～3天后，细胞连结成片，细胞簇中央部的细胞呈圆形，外周部细胞为梭形，两者中间的细胞为多边形。进一步培养1～2天后在细胞簇的中央部出现基质堆积，细胞重叠现象，此时应适时传代(图1～3)。
, 百拇医药
在实验组的12个培养孔内，形成细胞簇的最短时间为13天，最长者23天，平均18.75天。
2.2.2 对照组 培养至第31天，仍未见到一孔软骨块周边有细胞簇形成，此后因有2个培养孔被霉菌污染，被迫放弃观察。
2.3 培养1个月后各组的细胞簇形成情况 培养至1个月后，在实验组的各培养孔内均有细胞簇形成，而对照组仍未见到细胞簇形成。以每孔出现细胞簇为阳性，未出现细胞簇为阴性，观察到的各组细胞簇形成情况见表2。
表2 培养1个月实验组、对照组细胞簇形成情况(单位：孔)
细胞簇形成情况
合 计
细胞簇形成阳性率
, http://www.100md.com (%)
阳 性
阴 性
实验组
12
0
12
100**
对照组
0
12
12
0
, 百拇医药
** χ2=24 P<0.01
3 讨论
在软骨组织工程的研究中，多采用Klagsbrun 等建立的软骨细胞分离方法来制备细胞悬液[1～3]。这种方法可在短时间内通过酶解相对多量的软骨组织获得大量高纯度的软骨细胞，从而满足向支架上种植高浓度种子细胞的要求。有报道每只3日龄新西兰大白兔，可获得约4×106～5×106关节软骨细胞[4]。我们用Klagsbrun 的方法，从1.5cm×4cm的成年兔耳软骨中分离出1×106个细胞。但在未来的临床应用过程中，细胞的来源只能通过穿刺活检的办法获得。可以推测，酶解如此微量的软骨组织，再加上多次的洗涤，最终得到的细胞数量将非常有限。以往的研究表明，软骨细胞是靠自分泌信号而存活。在无蛋白琼脂糖培养基中，鼠软骨细胞密度≥106/ml时，绝大部分细胞存活数周；细胞密度≤105/ml时，绝大部分细胞在几天内凋亡。抗氧化剂能增强软骨细胞存活力，但密度≤104/ml时，细胞活检获得的微量组织的原代细胞培养难以实现体外扩增软骨细胞的目的。
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图1 培养至13天软骨块中迁出的软骨细胞(倒置显微镜×40)
图2 迁出3天后，细胞培殖连结成为细胞簇(倒置显微镜×100)
图3 细胞簇中央部的基质堆积现象(倒置显微镜 ×100)仍会在几天内发生凋亡[5]。因而酶解
组织块培养法简单、易行，它特别适合于组织量少的原代培养[6]。但未经任何处理的软骨组织不易贴壁，从而影响细胞的迁出及增殖。对于这种情况，常用的解决方法有两种：一是涂以薄层血浆膜，或用胎汁加固。二是向瓶壁上涂以鼠尾胶原[7]。然而这两种方法却过于烦琐。软骨的细胞外基质中含有丰富的基质和胶原，能否通过消化使这些基质和胶原外露进而提高软骨碎块的贴壁率呢?我们对传统的组织块培养法进行了改良，即在将组织碎块置入培养皿之前，先以TE消化液和透明质酸酶进行消化。实验中我们注意到消化后组织块具有一定的粘度，这可能与透明质酸类基质的分解产物有关。这一结果不但有利于置入块早期的固定和贴壁 ，也可使Ⅱ型胶原和蛋白多糖外露，改善置入块局部的微环境，从而也有利于软骨细胞的迁出和生长。从上述实验的72小时贴壁率和1个月细胞簇形成率的比较上看，改良的软骨细胞块培养法在这两项指标上均优于传统的方法，这也证实了我们的设想。
, 百拇医药
这一方法将有利于软骨组织工程的临床应用，它使软骨的组织块培养变得简单高效。活检取出的微量软骨细胞块经TE消化液和透明质酸酶消化一定时间后进行培养，待细胞簇连结成片后传代，即可达到体外扩增软骨细胞的作用。当然这一方法并非完善，比如细胞簇形成的平均时间需18.75天，这在未来的临床应用过程中仍嫌太长，因而如何缩短细胞的迁出及形成细胞簇的时间，以及需要多长时间才能扩增到所需的细胞数量尚需进一步研究。
国家自然科学基金课题，批准号:G1999054300
参考文献
1.Vacanti CA, Langer R, Scholl B, et al. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg, 1994, 88: 753.
, 百拇医药
2.Ting V, Sims CD, Brecht LE, et al. In vitro prefabrication of human cartilage shapes using fibrin glue and human chondrocytes. Ann Plast Surg, 1998, 40(4): 413.
3.宋业光, 马海欢, 蔡 哲, 等. 牛透明软骨细胞与组织引导再生胶原膜体外培养后植入体内的研究. 中华整形烧伤外科杂志, 1999, 15: 175.
4.魏西秦, 曹峻岭, 熊咏民. 兔软骨细胞培养方法研究. 中国地方病学杂志, 1987, 6: 89.
5.许建中. 软骨细胞移植修复关节软骨的进展. 国外医学. 创伤与外科基本问题分册, 1997, 18: 89.
6.司徒镇强, 吴军正主编. 细胞培养. 西安: 世界图书出版公司, 1996, 69～72.
7.鄂 征主编. 组织培养技术. 北京: 人民卫生出版社, 1985, 113～114.
(收稿：2000-03-10), http://www.100md.com
单位：张晨(辽宁省人民医院整形外科 110015)；高景恒(辽宁省人民医院整形外科 110015)；王玉彬(锦州医学院普外科)；柏树令(中国医科大学基础医学院解剖学教研室)
关键词：组织块培养法；软骨；组织工程
实用美容整形外科杂志000203 摘要 为软骨的组织工程的临床应用寻求一种与之相适应的体外扩增种子细胞的方法。 将传统的组织块培养法进行改良，在置入培养皿前先以0.25%胰蛋白酶、0.08% EDTA及0.1%睾丸透明质酸酶消化软骨组织块(实验组)，以传统的组织块培养法为对照组进行培养。结果：在培养的第3天，实验组贴壁率为88.89%(32/36)，对照组为68.89%(23/36)(P<0.05)；培养后的第30天，实验组的细胞簇形成阳性率为100%(12/12)，而对照组为0(0/12)(P<0.01)。结论：改良的软骨组织块培养法优于传统的组织块培养法，更适合于软骨的组织工程临床应用。
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Modified method of explant culture of cartilage
Zhang Chen Wang Yubin Bai Shuling, et al.
(Department of Anatomy, Basic Medical College, China Medical University. Shenyang. P.R China 110015)
Abstract To search a method suitable to amplify cells that will be used as seeds in clinical application of cartilage tissue engineering in the future, the traditional explant cutures were modified by digesting the pieces of cartilage with 0.25% trypsin, 0.08% EDTA and 0.1% hyaluronidase before they were placed in dishes (experimental group), the traditional as control. Results: After 3 days of culture, 88.89 percent (32/36) of the pieces in experimental group adhered to the dishes while 68.89 percent (23/36) of the pieces in control group adhered (P<0.05); After 30 days of culture, cell clones appeared in 100 percent (12/12) of the experimental group, but none appeared in the control group (0/12) (P<0.01) Conclusion: The modified explant cultures are more suitable to the clinical application of cartilage tissue engineering than the traditional one.
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Key Words Explant cultures, Cartilage, Tissue engineering
软骨组织工程的研究是组织工程领域研究最广泛、最深入的一个领域。在不远的将来它将应用于临床。但如何把活检取出的自体微量组织在体外大量扩增为种子细胞，仍是该领域尚待解决的问题。这主要有两点原因：①微量的软骨组织经过多次酶解和反复冲洗后，细胞的损失量较大，细胞数量少则不利细胞贴壁进而繁殖；②采用传统的组织块培养法，软骨的组织块需很长时间贴壁，从而影响组织细胞的迁出。为此我们对传统的组织块培养法进行改进并与之在某一时间点的组织块贴壁率及细胞簇形成率方面进行比较，从而获得了一种优于传统方法的组织块培养法，即改良的软骨组织块培养法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 成年新西兰大白兔一只，雌雄及体重不限。
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1.1.2 TE消化液 为胰蛋白酶和EDTA的复合消化液，0.25%胰蛋白酶(1∶250，Sigma公司)，0.08% EDTA。
1.1.3 0.1%睾丸透明质酸酶(Sigma公司)。
1.1.4 PBS复合液 0.01mol PBS，pH7.4，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml。
1.1.5 培养液 DMEM(低糖，Hyclone公司)，含10%胎牛血清(中国医科院天津血研所)，维生素C 50mg/ml，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml。
1.1.6 24孔培养板(Corning公司)。
1.2 方法 846注射液1ml肌肉注射施全麻，在兔耳背侧中部切开皮肤，仔细剥去软骨膜，切取2cm×4cm软骨，置入PBS复合液，去除软骨腹面残留骨膜，PBS复合液洗涤2次，将软骨剪成1cm×1cm大小的碎块，PBS复合液洗涤三次，800rpm离心10分钟，去上清备用。
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1.2.1 传统组织块培养法(对照组) 取部分软骨块，以每孔三块，距离0.5～1.0cm的密度置入24孔培养板的A、B两排孔内，向每孔缓慢注入培养液，培养液的注入量以恰好漫过软骨块上面为准。
1.2.2 改良组织块培养法(实验组) 剩余的软骨块先以TE消化液在37℃水浴箱中消化30分钟，PBS复合液洗涤二次，800rpm离心10分钟，再加入0.1%睾丸透明质酸酶37℃水浴消化30分钟，PBS复合液冼涤二次，800rpm离心10分钟，将消化过的软骨碎块同样以每孔三块，距离0.5～1.0cm的密度置入24孔培养板C、D两排孔内，以对照组的方式加入培养液。
将载有两组软骨碎块的培养板置CO2孵箱内培养，其中CO2浓度5%，湿度95%，温度37℃。孵育3天后再向各孔内注入1ml培养液，此后每3天换液一次。每日用倒置显微镜观察组织块周边的细胞迁出及细胞簇形成情况。
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2 结果
2.1 72小时组织块贴壁率 培养至72小时，轻轻晃动培养板，观察每孔内的软骨块是否随之飘动，不动者视为贴壁，飘动者视未贴壁，观察结果见表1。
表1 培养72小时实验组与对照组的贴壁情况(单位：块)
贴 壁 情 况
合计
贴壁率(%)
贴 壁
未贴壁
实验组
32
4
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36
88.89*
对照组
23
13
36
63.89
* χ2=6.24 P<0.05
2.2 显微镜观察
2.2.1 实验组 培养至第13天，在组织块的周边区域可见迁出的细胞及其形成的细胞簇，早期细胞簇3～5个细胞不等，无极性，散在排列，细胞呈梭形向两端伸延。2～3天后，细胞连结成片，细胞簇中央部的细胞呈圆形，外周部细胞为梭形，两者中间的细胞为多边形。进一步培养1～2天后在细胞簇的中央部出现基质堆积，细胞重叠现象，此时应适时传代(图1～3)。
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在实验组的12个培养孔内，形成细胞簇的最短时间为13天，最长者23天，平均18.75天。
2.2.2 对照组 培养至第31天，仍未见到一孔软骨块周边有细胞簇形成，此后因有2个培养孔被霉菌污染，被迫放弃观察。
2.3 培养1个月后各组的细胞簇形成情况 培养至1个月后，在实验组的各培养孔内均有细胞簇形成，而对照组仍未见到细胞簇形成。以每孔出现细胞簇为阳性，未出现细胞簇为阴性，观察到的各组细胞簇形成情况见表2。
表2 培养1个月实验组、对照组细胞簇形成情况(单位：孔)
细胞簇形成情况
合 计
细胞簇形成阳性率
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阳 性
阴 性
实验组
12
0
12
100**
对照组
0
12
12
0
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** χ2=24 P<0.01
3 讨论
在软骨组织工程的研究中，多采用Klagsbrun 等建立的软骨细胞分离方法来制备细胞悬液[1～3]。这种方法可在短时间内通过酶解相对多量的软骨组织获得大量高纯度的软骨细胞，从而满足向支架上种植高浓度种子细胞的要求。有报道每只3日龄新西兰大白兔，可获得约4×106～5×106关节软骨细胞[4]。我们用Klagsbrun 的方法，从1.5cm×4cm的成年兔耳软骨中分离出1×106个细胞。但在未来的临床应用过程中，细胞的来源只能通过穿刺活检的办法获得。可以推测，酶解如此微量的软骨组织，再加上多次的洗涤，最终得到的细胞数量将非常有限。以往的研究表明，软骨细胞是靠自分泌信号而存活。在无蛋白琼脂糖培养基中，鼠软骨细胞密度≥106/ml时，绝大部分细胞存活数周；细胞密度≤105/ml时，绝大部分细胞在几天内凋亡。抗氧化剂能增强软骨细胞存活力，但密度≤104/ml时，细胞活检获得的微量组织的原代细胞培养难以实现体外扩增软骨细胞的目的。
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图1 培养至13天软骨块中迁出的软骨细胞(倒置显微镜×40)
图2 迁出3天后，细胞培殖连结成为细胞簇(倒置显微镜×100)
图3 细胞簇中央部的基质堆积现象(倒置显微镜 ×100)仍会在几天内发生凋亡[5]。因而酶解
组织块培养法简单、易行，它特别适合于组织量少的原代培养[6]。但未经任何处理的软骨组织不易贴壁，从而影响细胞的迁出及增殖。对于这种情况，常用的解决方法有两种：一是涂以薄层血浆膜，或用胎汁加固。二是向瓶壁上涂以鼠尾胶原[7]。然而这两种方法却过于烦琐。软骨的细胞外基质中含有丰富的基质和胶原，能否通过消化使这些基质和胶原外露进而提高软骨碎块的贴壁率呢?我们对传统的组织块培养法进行了改良，即在将组织碎块置入培养皿之前，先以TE消化液和透明质酸酶进行消化。实验中我们注意到消化后组织块具有一定的粘度，这可能与透明质酸类基质的分解产物有关。这一结果不但有利于置入块早期的固定和贴壁 ，也可使Ⅱ型胶原和蛋白多糖外露，改善置入块局部的微环境，从而也有利于软骨细胞的迁出和生长。从上述实验的72小时贴壁率和1个月细胞簇形成率的比较上看，改良的软骨细胞块培养法在这两项指标上均优于传统的方法，这也证实了我们的设想。
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这一方法将有利于软骨组织工程的临床应用，它使软骨的组织块培养变得简单高效。活检取出的微量软骨细胞块经TE消化液和透明质酸酶消化一定时间后进行培养，待细胞簇连结成片后传代，即可达到体外扩增软骨细胞的作用。当然这一方法并非完善，比如细胞簇形成的平均时间需18.75天，这在未来的临床应用过程中仍嫌太长，因而如何缩短细胞的迁出及形成细胞簇的时间，以及需要多长时间才能扩增到所需的细胞数量尚需进一步研究。
国家自然科学基金课题，批准号:G1999054300
参考文献
1.Vacanti CA, Langer R, Scholl B, et al. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg, 1994, 88: 753.
, 百拇医药
2.Ting V, Sims CD, Brecht LE, et al. In vitro prefabrication of human cartilage shapes using fibrin glue and human chondrocytes. Ann Plast Surg, 1998, 40(4): 413.
3.宋业光, 马海欢, 蔡 哲, 等. 牛透明软骨细胞与组织引导再生胶原膜体外培养后植入体内的研究. 中华整形烧伤外科杂志, 1999, 15: 175.
4.魏西秦, 曹峻岭, 熊咏民. 兔软骨细胞培养方法研究. 中国地方病学杂志, 1987, 6: 89.
5.许建中. 软骨细胞移植修复关节软骨的进展. 国外医学. 创伤与外科基本问题分册, 1997, 18: 89.
6.司徒镇强, 吴军正主编. 细胞培养. 西安: 世界图书出版公司, 1996, 69～72.
7.鄂 征主编. 组织培养技术. 北京: 人民卫生出版社, 1985, 113～114.
(收稿：2000-03-10), http://www.100md.com