人生长激素对结肠癌细胞株细胞周期动力学的影响
作者：祁晓平 黎介寿 陈彻
单位：南京军区南京总医院解放军普外研究所，江苏南京 210002
关键词：生长激素；结肠癌；细胞周期动力学；凋亡
肠外与肠内营养000208摘 要：目的：了解人生长激素(hGH)对于结肠癌细胞有无促增殖和分化作用。 方法：取对数生长期的人结肠癌细胞株LOVO，以顺铂和(或)不同浓度的hGH体外培养，24 h后以流式细胞仪测定细胞增殖周期及细胞凋亡等指标。 结果：同时加顺铂和hGH培养细胞，癌细胞群在G2～M期发生阻滞，细胞凋亡率增加(P<0.05)，S期细胞数率非常显著地降低(P<0.01)；加hGH 100 ng/ml组G0～G1期细胞数率降低(P<0.05)，S期百分率增高(P<0.01)。 结论：LOVO细胞表面可能有hGH受体，hGH在体外作用LOVO细胞，能诱导细胞分化，促使静止细胞群进入增殖周期，并使处于DNA合成期的细胞增多，为提高肿瘤对细胞周期时相特异性药物的敏感性提供了基础。顺铂能够抑制hGH促DNA合成的作用，并能提高细胞凋亡率。
, 百拇医药
分类号：R735.35 文献标识码：A
文章编号：1007-810X(2000)02-0083-03
Effect of human growth hormone on cell cycle kinetics in LOVO cells in vitro
QI Xiao-ping LI Jie-shou CHENG Che
(Department of Surgery,Jinling Hospital,Jiangsu Nanjing 210002,China)
Abstract：Objectives:To study effect of human growth hormone (hGH) on cycle kinetics and apoptosis of human calonic cancer cell line,LOVO cells. Methods:LOVO cells were cultured for 24 hr in 1640 with or without DDP,but with hGH at a concentration of 50,100 or 200 ng/ml.Cells undergoing apoptosis and differentiation were determined by flow cytometry(FCM). Results:hGH had significant effect on LOVO cells cycle rate,percent G0～G1 phase dropped(P<0.05)，percent S phase increased(P<0.01).Addition of hGH and DDP to the culture medium raised cell rates of G2～M phase,while apoptosis of LOVO cells increased. Conclusions:LOVO cells might have expression for the GH receptor.In vitro hGH might induce differentiation of cells LOVO and promote cell cycle kinetics.DDP could suppress the stimulatory effect of hGH on percent S phase,and increase apoptosis of LOVO cells.
, 百拇医药
Key words：Human growth hormone; Colonic cancer; Cell cycle kinetics; Apoptosis▲
0 前言
1990年开始，人生长激素(hGH)被广泛应用于临床，以促进生长发育，促进蛋白质合成代谢，加速创伤愈合，减少手术并发症，取得了良好的疗效。但hGH的应用对实体瘤(除脑瘤以外)的细胞增殖和分化有无影响，是何种影响?一直是临床外科医师必须面对的问题。我们研究了hGH在体外对结肠癌细胞株LOVO细胞周期动力学等的影响。
1 材料和方法
1.1 人结肠癌细胞株LOVO 由中科院上海细胞生物所引进，在含10%小牛血清的1640全培养液、37℃、5%CO2中培养，取对数生长期的细胞经台盼蓝染色后确定活细胞计数在95%以上，收集细胞，调整细胞浓度为1×105/ml,加于12孔培养板，每孔1 ml。
, 百拇医药
1.2 试剂 顺铂(由山东齐鲁制药厂提供)使用的终浓度为1.5 μg/ml；重组人生长激素(SAIZEN，由瑞士Serono大药厂馈赠)使用的终浓度分别为50 ng/ml(加样16 μl)、100 ng/ml(加样31 μl)、200 ng/ml(加样62 μl)。所有试剂均于使用前新鲜配制，共分七组加样，每组设4个复孔。一至三组简称顺铂组，四至六组简称hGH组，第七组为对照组，详见表1。
表1 各组加样情况
Table 1 The addition of hGH and cisplatin in medium 分组编号
1
2
3
4
, 百拇医药
5
6
7
LOVO(ml)
1
1
1
1
1
1
1
顺铂(μl)
100
100
, 百拇医药
100
/
/
/
/
hGH液(μl)
16
31
62
16
31
62
/
1640液(μl)
, 百拇医药
46
31
/
146
131
100
162
1.3 细胞周期分析 培养24 h后立即收集细胞，以PBS洗涤2次后加荧光素染色，以流式细胞仪(FACJ型)进行细胞周期分析，激发光激发波长为488 nm。
1.4 细胞凋亡峰和DNA倍体 在G1峰左侧出现亚二倍体细胞峰为凋亡峰，淋巴细胞对照无此峰群。根据DNA含量直方图所测得各组G0～G1期荧光道数，以正常人淋巴细胞样品G0～G1期峰荧光道数为基准，数值之比即为DNA倍体。
, 百拇医药
1.5 统计处理 分别采用方差分析，q检验或t检验。
2 结果
2.1 细胞周期
2.1.1 G0～G1期 顺铂各组与对照组比较细胞数率无明显增减，加hGH 100 ng/ml组与对照组比较，本期细胞数率显著降低(P<0.05)(见图1)。
图1 各组G0～G1期细胞百分率
Figure 1 The percentage of G0～G1 phase
, http://www.100md.com 2.1.2 G2～M期 顺铂1、2组在本期所占的细胞数率较其他各组非常显著地增加(P<0.01)，加hGH 200 ng/ml组与对照组比较亦显示进入有丝分裂期的细胞百分数增高(P<0.05)(见图2)。
图2 各组G2～M期细胞百分率
Figure 2 The percentage of G2～M phase
2.1.3 S期 顺铂各组细胞数率非常显著地降低(P<0.01)，加hGH 100 ng/ml组与对照组比较，显示有明显促进癌细胞DNA合成的作用(P<0.01)(见图3)。
, 百拇医药
图3 各组S期细胞百分率
Figure 3 The percentage of S phase
2.2 细胞凋亡和DNA倍体 流式细胞仪测定见在G0～G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型，显示加顺铂组有诱导细胞凋亡的作用(见表2)，各组细胞倍体数在1.64～1.98之间(见表3)。
表2 顺铂组与hGH组细胞凋亡数率
Table 2 The percentage of apopotosis 分 组
(%)
s(%)
t
, http://www.100md.com
顺铂组(1～3)
43.33*
5.77
3.130 5
hGH组(4～6)
31.67
2.89
P<0.05表3 细胞倍体数和细胞周期测定的变异系数(%)
Table 3 DNA Index and coefficient of variation of the cell cycle 分组
1
, 百拇医药
2
3
4
5
6
7
LOVO倍体数
1.73
1.70
1.75
1.98
1.64
1.70
, http://www.100md.com
1.65
CV(%)
6.11
7.56
6.50
8.29
7.93
8.68
8.85
3 讨论
顺铂为临床治疗结肠癌常用药物，其作用原理为铂原子能嵌合于DNA内部两个相邻的鸟嘌呤或鸟嘌呤与腺嘌呤之间，使DNA断裂，从而阻断DNA复制和转录，因而是周期非特异性药物。体外培养中顺铂用量的1倍浓度一般为1.5 μg/ml[1]，此浓度是按常规抗肿瘤药物剂量在体内所达到的血浆浓度所配制。hGH体外培养所取终浓度跨度很大，但多数文献报道的用量为50 ng/ml或100 ng/ml[2，3]，所以在本研究中我们设置了此两个浓度，并根据临床应用的状况设置了200 ng/ml的大剂量组。
, 百拇医药
模拟体内环境的药物敏感性测定药物暴露时间一般均采用24 h[1]。有报道顺铂作用于小鼠，其癌细胞凋亡高峰在10～18 h出现[4]，顺铂在体外诱导胃癌细胞系BGC823凋亡，加药后24 h观察到典型的细胞凋亡改变。柞蚕血淋巴肽体外用于人结肠癌细胞，有作者发现30 min细胞就出现轻微改变；保尔佳用于抑制人肝癌细胞生长，24 h见癌细胞DNA合成显著减少，对照组癌细胞增殖旺盛；bcl-2阳性胃癌细胞采用bcl-2反义寡核苷酸对照寡核苷酸和顺铂等几种化疗药，也发现药物处理后24 h细胞出现一系列改变。故本研究将细胞收集时间定为24 h，在另一实验中，我们延长了hGH作用的时间，实验结果将另文报告。
hGH作为肿瘤患者的营养辅助物至今仍存在争论，因为有不少学者认为hGH存在潜在影响肿瘤生长的促有丝分裂效应。本研究结果提示用hGH 100 ng/ml处理LOVO细胞，G0～G1期细胞参数下降，S期细胞百分率增高;而使用hGH 200 ng/ml的高剂量组，细胞则在G2～M期发生阻滞，提示LOVO细胞可能存在hGH受体，hGH在体外作用于LOVO细胞，有促有丝分裂效应，并使DNA合成增加，此结果与Harrison等人用注射了hGH的小鼠血清体外培养人胰腺癌细胞，发现显著促进癌细胞生长的结果相符。然而在同一实验研究中，Harrison等人又发现给皮下接种了胰腺癌细胞的Athymic小鼠体内注射hGH，15天后检测发现，hGH体内应用仅提高了血浆IGF-1水平和肝内蛋白合成速率，没有促进肿瘤生长，也未改变细胞周期动力学和肿瘤组织的蛋白合成速率[5]。
, 百拇医药
大量文献报道，hGH能调节免疫功能，改善患者细胞和体液性的全身宿主防御，尤其是双向调控NK细胞，对于创伤患者维持新的营养平衡、加速创口愈合、减少并发症有重要意义。有学者经动物实验证实，hGH和IGF-1能增强TPN应用过程中的免疫反应，促进TPN的蛋白合成作用，改善瘦体组织群，提高宿主的免疫功能，减少感染风险，但并不促进肿瘤生长。就体外实验的结果分析：LOVO细胞是结肠癌高转移率细胞株，DNA倍体分析说明本研究所用细胞群倾向或大多倾向非整倍体细胞，恶性程度很高。hGH调节肿瘤生长周期，总的趋势是促使静止的细胞进入增殖周期，表现为G0～G1期细胞数率显著降低，G2～M期细胞数量显著增高，换句话说，是促使有增殖能力，但暂不进入增殖周期的静止细胞群进入细胞周期；同时S期细胞百分率增高，说明肿瘤细胞进入DNA合成期增多，细胞生长比率大且分裂间期短，此时对化疗药最为敏感，对于提高大部分都是作用于S期或S～M期的时相特异性化疗药的敏感性提供了良好前景。另外，应该注意的是顺铂与hGH同时应用，细胞在G2～M期发生明显阻滞，细胞凋亡易在此期发生。本研究细胞凋亡峰的增高印证了此点；而S期细胞百分数显著降低，提示在体外实验中hGH与顺铂同用，无明显促进细胞DNA合成和细胞增殖的作用。在体内两药同用，能否抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、改善患者全身营养和免疫状态，尚需进一步研究证实。■
, 百拇医药
作者简介：祁晓平(1954-),女,江苏南京人,副主任技师,医学硕士,从事肿瘤免疫的基础和临床研究
参考文献：
[1]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性[M].成都：四川科学技术出版社，1995.78～79.
[2]Ezaduar F,Van-Tol HT,Colenbrander B.Stimulatory effect of growth hormone on in vitro mataration of bovine oocytes is exerted through cumulus cells and not medioted by IGF-I[J].Mol Reprod Dev,1997,47(2):175～180.
[3]Yoshimura Y,I washita M,Karube M et al.Growth hormone stimulates follicular development by stimulating ovarian production of insulin-like growth factor-I[J].Endocrinology,1994,135(3):887～894.
, 百拇医药
[4]AI Sheneber IF,Shbata HR,Sampalis J et al.Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer[J].Cancer,1993,71:1954～1959.
[5]Harrison LE,Dlumberg D,Berman R et al.Effect of human growth hormone on human pancreatic carcinoma growth,protein,and cell cycle kinetics[J].J Surg Res,1996,61(2):317～322.
收稿日期：2000-01-15
, 百拇医药
单位：南京军区南京总医院解放军普外研究所，江苏南京 210002
关键词：生长激素；结肠癌；细胞周期动力学；凋亡
肠外与肠内营养000208摘 要：目的：了解人生长激素(hGH)对于结肠癌细胞有无促增殖和分化作用。 方法：取对数生长期的人结肠癌细胞株LOVO，以顺铂和(或)不同浓度的hGH体外培养，24 h后以流式细胞仪测定细胞增殖周期及细胞凋亡等指标。 结果：同时加顺铂和hGH培养细胞，癌细胞群在G2～M期发生阻滞，细胞凋亡率增加(P<0.05)，S期细胞数率非常显著地降低(P<0.01)；加hGH 100 ng/ml组G0～G1期细胞数率降低(P<0.05)，S期百分率增高(P<0.01)。 结论：LOVO细胞表面可能有hGH受体，hGH在体外作用LOVO细胞，能诱导细胞分化，促使静止细胞群进入增殖周期，并使处于DNA合成期的细胞增多，为提高肿瘤对细胞周期时相特异性药物的敏感性提供了基础。顺铂能够抑制hGH促DNA合成的作用，并能提高细胞凋亡率。
, 百拇医药
分类号：R735.35 文献标识码：A
文章编号：1007-810X(2000)02-0083-03
Effect of human growth hormone on cell cycle kinetics in LOVO cells in vitro
QI Xiao-ping LI Jie-shou CHENG Che
(Department of Surgery,Jinling Hospital,Jiangsu Nanjing 210002,China)
Abstract：Objectives:To study effect of human growth hormone (hGH) on cycle kinetics and apoptosis of human calonic cancer cell line,LOVO cells. Methods:LOVO cells were cultured for 24 hr in 1640 with or without DDP,but with hGH at a concentration of 50,100 or 200 ng/ml.Cells undergoing apoptosis and differentiation were determined by flow cytometry(FCM). Results:hGH had significant effect on LOVO cells cycle rate,percent G0～G1 phase dropped(P<0.05)，percent S phase increased(P<0.01).Addition of hGH and DDP to the culture medium raised cell rates of G2～M phase,while apoptosis of LOVO cells increased. Conclusions:LOVO cells might have expression for the GH receptor.In vitro hGH might induce differentiation of cells LOVO and promote cell cycle kinetics.DDP could suppress the stimulatory effect of hGH on percent S phase,and increase apoptosis of LOVO cells.
, 百拇医药
Key words：Human growth hormone; Colonic cancer; Cell cycle kinetics; Apoptosis▲
0 前言
1990年开始，人生长激素(hGH)被广泛应用于临床，以促进生长发育，促进蛋白质合成代谢，加速创伤愈合，减少手术并发症，取得了良好的疗效。但hGH的应用对实体瘤(除脑瘤以外)的细胞增殖和分化有无影响，是何种影响?一直是临床外科医师必须面对的问题。我们研究了hGH在体外对结肠癌细胞株LOVO细胞周期动力学等的影响。
1 材料和方法
1.1 人结肠癌细胞株LOVO 由中科院上海细胞生物所引进，在含10%小牛血清的1640全培养液、37℃、5%CO2中培养，取对数生长期的细胞经台盼蓝染色后确定活细胞计数在95%以上，收集细胞，调整细胞浓度为1×105/ml,加于12孔培养板，每孔1 ml。
, 百拇医药
1.2 试剂 顺铂(由山东齐鲁制药厂提供)使用的终浓度为1.5 μg/ml；重组人生长激素(SAIZEN，由瑞士Serono大药厂馈赠)使用的终浓度分别为50 ng/ml(加样16 μl)、100 ng/ml(加样31 μl)、200 ng/ml(加样62 μl)。所有试剂均于使用前新鲜配制，共分七组加样，每组设4个复孔。一至三组简称顺铂组，四至六组简称hGH组，第七组为对照组，详见表1。
表1 各组加样情况
Table 1 The addition of hGH and cisplatin in medium 分组编号
1
2
3
4
, 百拇医药
5
6
7
LOVO(ml)
1
1
1
1
1
1
1
顺铂(μl)
100
100
, 百拇医药
100
/
/
/
/
hGH液(μl)
16
31
62
16
31
62
/
1640液(μl)
, 百拇医药
46
31
/
146
131
100
162
1.3 细胞周期分析 培养24 h后立即收集细胞，以PBS洗涤2次后加荧光素染色，以流式细胞仪(FACJ型)进行细胞周期分析，激发光激发波长为488 nm。
1.4 细胞凋亡峰和DNA倍体 在G1峰左侧出现亚二倍体细胞峰为凋亡峰，淋巴细胞对照无此峰群。根据DNA含量直方图所测得各组G0～G1期荧光道数，以正常人淋巴细胞样品G0～G1期峰荧光道数为基准，数值之比即为DNA倍体。
, 百拇医药
1.5 统计处理 分别采用方差分析，q检验或t检验。
2 结果
2.1 细胞周期
2.1.1 G0～G1期 顺铂各组与对照组比较细胞数率无明显增减，加hGH 100 ng/ml组与对照组比较，本期细胞数率显著降低(P<0.05)(见图1)。
图1 各组G0～G1期细胞百分率
Figure 1 The percentage of G0～G1 phase
, http://www.100md.com 2.1.2 G2～M期 顺铂1、2组在本期所占的细胞数率较其他各组非常显著地增加(P<0.01)，加hGH 200 ng/ml组与对照组比较亦显示进入有丝分裂期的细胞百分数增高(P<0.05)(见图2)。
图2 各组G2～M期细胞百分率
Figure 2 The percentage of G2～M phase
2.1.3 S期 顺铂各组细胞数率非常显著地降低(P<0.01)，加hGH 100 ng/ml组与对照组比较，显示有明显促进癌细胞DNA合成的作用(P<0.01)(见图3)。
, 百拇医药
图3 各组S期细胞百分率
Figure 3 The percentage of S phase
2.2 细胞凋亡和DNA倍体 流式细胞仪测定见在G0～G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型，显示加顺铂组有诱导细胞凋亡的作用(见表2)，各组细胞倍体数在1.64～1.98之间(见表3)。
表2 顺铂组与hGH组细胞凋亡数率
Table 2 The percentage of apopotosis 分 组
(%)s(%)
t
, http://www.100md.com
顺铂组(1～3)
43.33*
5.77
3.130 5
hGH组(4～6)
31.67
2.89
P<0.05表3 细胞倍体数和细胞周期测定的变异系数(%)
Table 3 DNA Index and coefficient of variation of the cell cycle 分组
1
, 百拇医药
2
3
4
5
6
7
LOVO倍体数
1.73
1.70
1.75
1.98
1.64
1.70
, http://www.100md.com
1.65
CV(%)
6.11
7.56
6.50
8.29
7.93
8.68
8.85
3 讨论
顺铂为临床治疗结肠癌常用药物，其作用原理为铂原子能嵌合于DNA内部两个相邻的鸟嘌呤或鸟嘌呤与腺嘌呤之间，使DNA断裂，从而阻断DNA复制和转录，因而是周期非特异性药物。体外培养中顺铂用量的1倍浓度一般为1.5 μg/ml[1]，此浓度是按常规抗肿瘤药物剂量在体内所达到的血浆浓度所配制。hGH体外培养所取终浓度跨度很大，但多数文献报道的用量为50 ng/ml或100 ng/ml[2，3]，所以在本研究中我们设置了此两个浓度，并根据临床应用的状况设置了200 ng/ml的大剂量组。
, 百拇医药
模拟体内环境的药物敏感性测定药物暴露时间一般均采用24 h[1]。有报道顺铂作用于小鼠，其癌细胞凋亡高峰在10～18 h出现[4]，顺铂在体外诱导胃癌细胞系BGC823凋亡，加药后24 h观察到典型的细胞凋亡改变。柞蚕血淋巴肽体外用于人结肠癌细胞，有作者发现30 min细胞就出现轻微改变；保尔佳用于抑制人肝癌细胞生长，24 h见癌细胞DNA合成显著减少，对照组癌细胞增殖旺盛；bcl-2阳性胃癌细胞采用bcl-2反义寡核苷酸对照寡核苷酸和顺铂等几种化疗药，也发现药物处理后24 h细胞出现一系列改变。故本研究将细胞收集时间定为24 h，在另一实验中，我们延长了hGH作用的时间，实验结果将另文报告。
hGH作为肿瘤患者的营养辅助物至今仍存在争论，因为有不少学者认为hGH存在潜在影响肿瘤生长的促有丝分裂效应。本研究结果提示用hGH 100 ng/ml处理LOVO细胞，G0～G1期细胞参数下降，S期细胞百分率增高;而使用hGH 200 ng/ml的高剂量组，细胞则在G2～M期发生阻滞，提示LOVO细胞可能存在hGH受体，hGH在体外作用于LOVO细胞，有促有丝分裂效应，并使DNA合成增加，此结果与Harrison等人用注射了hGH的小鼠血清体外培养人胰腺癌细胞，发现显著促进癌细胞生长的结果相符。然而在同一实验研究中，Harrison等人又发现给皮下接种了胰腺癌细胞的Athymic小鼠体内注射hGH，15天后检测发现，hGH体内应用仅提高了血浆IGF-1水平和肝内蛋白合成速率，没有促进肿瘤生长，也未改变细胞周期动力学和肿瘤组织的蛋白合成速率[5]。
, 百拇医药
大量文献报道，hGH能调节免疫功能，改善患者细胞和体液性的全身宿主防御，尤其是双向调控NK细胞，对于创伤患者维持新的营养平衡、加速创口愈合、减少并发症有重要意义。有学者经动物实验证实，hGH和IGF-1能增强TPN应用过程中的免疫反应，促进TPN的蛋白合成作用，改善瘦体组织群，提高宿主的免疫功能，减少感染风险，但并不促进肿瘤生长。就体外实验的结果分析：LOVO细胞是结肠癌高转移率细胞株，DNA倍体分析说明本研究所用细胞群倾向或大多倾向非整倍体细胞，恶性程度很高。hGH调节肿瘤生长周期，总的趋势是促使静止的细胞进入增殖周期，表现为G0～G1期细胞数率显著降低，G2～M期细胞数量显著增高，换句话说，是促使有增殖能力，但暂不进入增殖周期的静止细胞群进入细胞周期；同时S期细胞百分率增高，说明肿瘤细胞进入DNA合成期增多，细胞生长比率大且分裂间期短，此时对化疗药最为敏感，对于提高大部分都是作用于S期或S～M期的时相特异性化疗药的敏感性提供了良好前景。另外，应该注意的是顺铂与hGH同时应用，细胞在G2～M期发生明显阻滞，细胞凋亡易在此期发生。本研究细胞凋亡峰的增高印证了此点；而S期细胞百分数显著降低，提示在体外实验中hGH与顺铂同用，无明显促进细胞DNA合成和细胞增殖的作用。在体内两药同用，能否抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、改善患者全身营养和免疫状态，尚需进一步研究证实。■
, 百拇医药
作者简介：祁晓平(1954-),女,江苏南京人,副主任技师,医学硕士,从事肿瘤免疫的基础和临床研究
参考文献：
[1]张胜本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性[M].成都：四川科学技术出版社，1995.78～79.
[2]Ezaduar F,Van-Tol HT,Colenbrander B.Stimulatory effect of growth hormone on in vitro mataration of bovine oocytes is exerted through cumulus cells and not medioted by IGF-I[J].Mol Reprod Dev,1997,47(2):175～180.
[3]Yoshimura Y,I washita M,Karube M et al.Growth hormone stimulates follicular development by stimulating ovarian production of insulin-like growth factor-I[J].Endocrinology,1994,135(3):887～894.
, 百拇医药
[4]AI Sheneber IF,Shbata HR,Sampalis J et al.Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer[J].Cancer,1993,71:1954～1959.
[5]Harrison LE,Dlumberg D,Berman R et al.Effect of human growth hormone on human pancreatic carcinoma growth,protein,and cell cycle kinetics[J].J Surg Res,1996,61(2):317～322.
收稿日期：2000-01-15
, 百拇医药