尿液氨基多糖测定及临床应用
作者：许淑惠 李萍 胥劲 陈章孝 魏松全 安振梅
单位：许淑惠(华西医科大学附属第一医院检验科 成都 610041)；李萍(华西医科大学附属第一医院检验科 成都 610041)；胥劲(华西医科大学附属第一医院检验科 成都 610041)；陈章孝(湖北省十堰市二汽职工医院检验科)；魏松全(华西医科大学附属第一医院内分泌科 成都 610041)；安振梅(华西医科大学附属第一医院内分泌科 成都 610041)
关键词：
华西医学000281
[中图分类号]R446.12+2 [文献标识码]D
[文章编号]1002-0179(2000)02-0244-01
氨基多糖(Glycosaminoglycan,GAG),又称糖氨聚糖，是由二糖(糖醛酸和乙酰氨基己糖)重复聚合形成长链不分支的糖。其中糖醛酸和己糖胺的硫酸基可使GAG成为含高负电荷的多阴离子物质，能在一定条件下和阳离子染料阿利新兰—8GX形成较大的复合物分子沉淀下来，其沉淀量和样本中的GAG含量成正比，通过与标准物比色可得样品内GAG浓度。本文建立和改良了阿利新兰—8GX法定量检测GAG，并测定了22例健康人及12例Grave＇s眼病患者尿液GAG含量，现将方法与结果介绍如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 试剂 ①50mmol/L醋酸钠缓冲液(内含氯化镁50mmol/L pH5.8)醋酸钠、氯化镁均为AR，成都化学试剂厂生产。②0.05%(W/V)阿利新兰—8GX液：阿利新兰—8GX(AR，CHROMA进口分装)。用pH5.8的醋酸钠缓冲液溶解，4℃保存。③氯化钠：分别配制成3mol/L与4mol/L(AR，成都临江化工厂生产)。④氯化钠—甲醇溶液：按3∶2比例临用前配制。⑤0.5g/L硫酸软骨素(CS)标准液：硫酸软骨素(CS)由Sigma公司生产，批号：C3192。
1.2 仪器 501分光光度计、HITACH7170A型全自动生化分析仪。
1.3 测定方法 ①标本收集：收集受检者24小时尿液，临用前混匀取样。②测定方法：按表1进行。③标准曲线绘制：配制系列标准溶液，比色后得出系列吸光度，以吸光度为纵坐标，相应GAG浓度为横坐标作图。④结果表示：将样本比色后的吸光度查标准曲线后求得相应GAG含量：g/L。测定样本24小时尿肌酐。为消除尿液稀释或浓缩影响，GAG浓度用肌酐校正值表示：mg/mmol Cr。
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2 结果和讨论
2.1 方法学探讨 ①方法的重复性：批内重复：用本法将同一样本平行测定10次其CV测得批内变异(CV)为4.58%。批间重复：用此法测得批间变异(CV)为6.60%。②方法的准确性：采用加标回收法，加入中、高浓度标准液，测得中浓度回收率为95.4%，高浓度回收率为98.2%，平均回收率为96.8%。③方法的线性：当GAG浓度在0.005～0.5g/L时，线性良好，相关系数(γ)为0.9996。
表1.测定方法 管 号
B
S
U
标准液(μl)
—
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20
—
3mol/NaCl(μl)
20
—
—
样品(μl)
—
—
20
阿利新兰-8GX(ml)
2
2
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2
室温放置2小时，2000g/min离心15min，弃上清
无水乙醇(ml)
2
2
2
振摇，2000g/min离心15min，弃上清
氯化钠—甲醇溶液(ml)
1
1
1
剧烈振摇至沉淀完全溶解
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醋酸钠缓冲液(ml)
1
1
1
混匀，620nm处比色
注：B：空白管 S：标准管 U：样品管
2.2 结果 ①健康对照组：22名，男性17名，女性5名，年龄为19～56岁，(
±1S)为29.9±12岁。系本院教职工和学生，均经体检为健康合格者。测得24小时尿液GAG含量＝3.22mg/mmol Cr,S＝1.66，范围为1.56～4.88mg/mmol Cr。②Grave＇s眼病组(患者组)：12例，男7例，女5例，年龄23～64岁，(±1S)为43.3±13.45岁。均系我院住院病人，其中有8例为初入院者，其余4例均经过或长或短的治疗期。本组病例由内分泌科提供，经临床表现、甲功检查、眼科检查及CT检查等确诊。测得24小时尿液GAG含量X＝6.17mg/m mol Cr。S＝2.29，范围为3.88～8.46mg/mmolCr。③统计方法：用t＇检验。t＇＝3.058，P<0.01，健康组与患者组比较，有显著统计学意义。
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2.3 讨论 据资料介绍〔1，3〕，测定GAG的方法很多，有甲苯胺兰法，十六烷基吡啶比浊法，醋纤膜电泳及己糖醛酸测定法等。但在上述诸多方法中，或因操作繁锁，或因准确性或特异性差而未能广泛用于临床。本文介绍的阿利新兰-GX法〔2〕，因操作简便，较快速，精密度和准确度都较好，适合临床应用。我们还用氯化钠-甲醇溶液代替原法中气溶胶IB液，仍得到较好效果。同时应用本法测定了22例健康者和12例Grave＇s眼病患者尿液24小时GAG含量，结果显示患者组GAG明显高于健康组，经统计学分析，两组有显著性差异。Grave＇s眼病，又名恶性突眼、浸润性突眼、内分泌浸润性突眼症。其发病率占甲亢患者的6%～10%，近年来有逐渐上升的趋势，而此病在临床治疗中尚比较困难。有资料介绍〔4，5〕，测定尿中GAG含量对GO的诊断与鉴别诊断有意义，进一步的研究还发现，GAG含量对GO的活动期或静止期，鉴别突眼与眶内其他眼病，如眼眶肿瘤引起的突眼都是有用指标。当眼病在活动期时，尿GAG含量升高，而非活动期时，尿GAG无明显变化。由此可见，尿GAG测定在临床上对GO的诊断与鉴别诊断，指导临床用药、停药、药物疗效评价等均具有重要价值。此外，尿GAG测定在粘多糖贮积症的诊断、治疗中也有很大意义，其次在一些结缔组织疾病及Morfan综合症的诊治中、尿GAG测定也有较大意义。
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参考文献
1，朱忠勇，主编：实用医学检验学。北京人民军医出版社 1992。
2，Thuy LP GL Nynan W.L.A new quaneitative Assay for Glycosaminoglycans.Clinica chemica Acea 1992；(212)∶17～26.
3，Whiteman，P.D.The Quantitative Measuremant of Alcian Blue-Glycosaminoglycan complexes.Biochem.J 1973；(131)∶343～350.
4，黄勤，等：Grave＇s眼病患者尿糖胺聚糖测定及临床应用。中华内分泌代谢杂志 1995；11(3)∶133。
5，Glinoer，D.The role of plasmapheresis in Grave＇s ophthalmopathy Exp Clin Endocrinal.1991；(97)∶328.
(收稿日期：1999-09-05), 百拇医药
单位：许淑惠(华西医科大学附属第一医院检验科 成都 610041)；李萍(华西医科大学附属第一医院检验科 成都 610041)；胥劲(华西医科大学附属第一医院检验科 成都 610041)；陈章孝(湖北省十堰市二汽职工医院检验科)；魏松全(华西医科大学附属第一医院内分泌科 成都 610041)；安振梅(华西医科大学附属第一医院内分泌科 成都 610041)
关键词：
华西医学000281
[中图分类号]R446.12+2 [文献标识码]D
[文章编号]1002-0179(2000)02-0244-01
氨基多糖(Glycosaminoglycan,GAG),又称糖氨聚糖，是由二糖(糖醛酸和乙酰氨基己糖)重复聚合形成长链不分支的糖。其中糖醛酸和己糖胺的硫酸基可使GAG成为含高负电荷的多阴离子物质，能在一定条件下和阳离子染料阿利新兰—8GX形成较大的复合物分子沉淀下来，其沉淀量和样本中的GAG含量成正比，通过与标准物比色可得样品内GAG浓度。本文建立和改良了阿利新兰—8GX法定量检测GAG，并测定了22例健康人及12例Grave＇s眼病患者尿液GAG含量，现将方法与结果介绍如下。
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1 材料和方法
1.1 试剂 ①50mmol/L醋酸钠缓冲液(内含氯化镁50mmol/L pH5.8)醋酸钠、氯化镁均为AR，成都化学试剂厂生产。②0.05%(W/V)阿利新兰—8GX液：阿利新兰—8GX(AR，CHROMA进口分装)。用pH5.8的醋酸钠缓冲液溶解，4℃保存。③氯化钠：分别配制成3mol/L与4mol/L(AR，成都临江化工厂生产)。④氯化钠—甲醇溶液：按3∶2比例临用前配制。⑤0.5g/L硫酸软骨素(CS)标准液：硫酸软骨素(CS)由Sigma公司生产，批号：C3192。
1.2 仪器 501分光光度计、HITACH7170A型全自动生化分析仪。
1.3 测定方法 ①标本收集：收集受检者24小时尿液，临用前混匀取样。②测定方法：按表1进行。③标准曲线绘制：配制系列标准溶液，比色后得出系列吸光度，以吸光度为纵坐标，相应GAG浓度为横坐标作图。④结果表示：将样本比色后的吸光度查标准曲线后求得相应GAG含量：g/L。测定样本24小时尿肌酐。为消除尿液稀释或浓缩影响，GAG浓度用肌酐校正值表示：mg/mmol Cr。
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2 结果和讨论
2.1 方法学探讨 ①方法的重复性：批内重复：用本法将同一样本平行测定10次其CV测得批内变异(CV)为4.58%。批间重复：用此法测得批间变异(CV)为6.60%。②方法的准确性：采用加标回收法，加入中、高浓度标准液，测得中浓度回收率为95.4%，高浓度回收率为98.2%，平均回收率为96.8%。③方法的线性：当GAG浓度在0.005～0.5g/L时，线性良好，相关系数(γ)为0.9996。
表1.测定方法 管 号
B
S
U
标准液(μl)
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3mol/NaCl(μl)
20
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样品(μl)
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阿利新兰-8GX(ml)
2
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2
室温放置2小时，2000g/min离心15min，弃上清
无水乙醇(ml)
2
2
2
振摇，2000g/min离心15min，弃上清
氯化钠—甲醇溶液(ml)
1
1
1
剧烈振摇至沉淀完全溶解
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醋酸钠缓冲液(ml)
1
1
1
混匀，620nm处比色
注：B：空白管 S：标准管 U：样品管
2.2 结果 ①健康对照组：22名，男性17名，女性5名，年龄为19～56岁，(
±1S)为29.9±12岁。系本院教职工和学生，均经体检为健康合格者。测得24小时尿液GAG含量＝3.22mg/mmol Cr,S＝1.66，范围为1.56～4.88mg/mmol Cr。②Grave＇s眼病组(患者组)：12例，男7例，女5例，年龄23～64岁，(±1S)为43.3±13.45岁。均系我院住院病人，其中有8例为初入院者，其余4例均经过或长或短的治疗期。本组病例由内分泌科提供，经临床表现、甲功检查、眼科检查及CT检查等确诊。测得24小时尿液GAG含量X＝6.17mg/m mol Cr。S＝2.29，范围为3.88～8.46mg/mmolCr。③统计方法：用t＇检验。t＇＝3.058，P<0.01，健康组与患者组比较，有显著统计学意义。, http://www.100md.com
2.3 讨论 据资料介绍〔1，3〕，测定GAG的方法很多，有甲苯胺兰法，十六烷基吡啶比浊法，醋纤膜电泳及己糖醛酸测定法等。但在上述诸多方法中，或因操作繁锁，或因准确性或特异性差而未能广泛用于临床。本文介绍的阿利新兰-GX法〔2〕，因操作简便，较快速，精密度和准确度都较好，适合临床应用。我们还用氯化钠-甲醇溶液代替原法中气溶胶IB液，仍得到较好效果。同时应用本法测定了22例健康者和12例Grave＇s眼病患者尿液24小时GAG含量，结果显示患者组GAG明显高于健康组，经统计学分析，两组有显著性差异。Grave＇s眼病，又名恶性突眼、浸润性突眼、内分泌浸润性突眼症。其发病率占甲亢患者的6%～10%，近年来有逐渐上升的趋势，而此病在临床治疗中尚比较困难。有资料介绍〔4，5〕，测定尿中GAG含量对GO的诊断与鉴别诊断有意义，进一步的研究还发现，GAG含量对GO的活动期或静止期，鉴别突眼与眶内其他眼病，如眼眶肿瘤引起的突眼都是有用指标。当眼病在活动期时，尿GAG含量升高，而非活动期时，尿GAG无明显变化。由此可见，尿GAG测定在临床上对GO的诊断与鉴别诊断，指导临床用药、停药、药物疗效评价等均具有重要价值。此外，尿GAG测定在粘多糖贮积症的诊断、治疗中也有很大意义，其次在一些结缔组织疾病及Morfan综合症的诊治中、尿GAG测定也有较大意义。
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参考文献
1，朱忠勇，主编：实用医学检验学。北京人民军医出版社 1992。
2，Thuy LP GL Nynan W.L.A new quaneitative Assay for Glycosaminoglycans.Clinica chemica Acea 1992；(212)∶17～26.
3，Whiteman，P.D.The Quantitative Measuremant of Alcian Blue-Glycosaminoglycan complexes.Biochem.J 1973；(131)∶343～350.
4，黄勤，等：Grave＇s眼病患者尿糖胺聚糖测定及临床应用。中华内分泌代谢杂志 1995；11(3)∶133。
5，Glinoer，D.The role of plasmapheresis in Grave＇s ophthalmopathy Exp Clin Endocrinal.1991；(97)∶328.
(收稿日期：1999-09-05), 百拇医药