运动神经元细胞系的凋亡特征
作者：万超 王拥军 施杞
单位：万超(上海第二医科大学 上海市伤骨科研究所)；王拥军(上海中医药大学骨伤科研究所 上海 200032)；施杞(上海中医药大学骨伤科研究所 上海 200032)
关键词：神经元；凋亡
中国中医骨伤科杂志000228 中图分类法：Q421；Q786 文献标识码：B 文章编号：1005-0205(2000)02 -0059-03
近来几家实验室研究发现，与发育过程中程序性细胞死亡不同， 不适宜的细胞凋亡可能是各种中枢神经系统疾病(包括脊髓损伤)中实质细胞丢失的原因 。细胞凋亡涉及充当最终“执行者”的特异蛋白酶的激活。这些酶包括IL-1β转化酶(IC E)、ICE相关蛋白酶，均是Caenorbabditis e1egans细胞死亡CED -3家族的成员，因其具有半胱氨酸活性部位和受天门冬氨酸残基特异作用后裂解，故看作 为酪蛋白酶。
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细胞缺失的类型确定为凋亡而非坏死，依靠多个指标，包括核染色质凝聚，核间体部位DN A断片、膜和细胞器结构存在及无炎症反应。在组织培养模型中，凋亡可能起始于营养因 素 的丢失。凋亡的信号包括调控的级联反应被延迟，经历足够的时间，提供对抗这些调控途径 及保护因损伤或疾病而丢失的功能性神经元的可能性。凋亡机理的阐明将引发有效治疗脊髓 疾病的药物的研制与开发。
最近，研究者创立了一种有利于研究细胞凋亡机理的运动神经元细胞系模型NSC19细胞 系，这些细胞来源于鼠成神经细胞瘤(N18TG2)和早期鼠胚胎脊髓运动神经元的融合 。它们表现运动神经元的形态学特性，表达胆碱乙酰基转移酶(ChAT)。发现这些细胞 通过凋亡诱导细胞死亡，作者确定这些运动神经元在停用血清和使用核分裂抑制剂的作用下 发生凋亡。
1 材料和方法
1.1 试剂 DNA染剂(Hoechst33342和安妥碘)购自Sigma化学 公司(St.Louis，MO)；α-fodrin抗体(mAb1622)和乙酰胆碱转移 酶购自Chemicon Internationa1，Inc.(Temecula，CA )；免疫检测剂，辣根过氧化酶(HRP)结合羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G，抗生蛋白链 菌素一HRP，化学发光强化试剂盒购自Amersham(Arlingron Heights ，IL)。所有试剂根据手册说明使用，免疫检测底物氨基联苯胺购自Vector实验室 (Burlingame，CA) ，核苷酸购自Boehringer Mannheim(d CTP，dGTP，dTTP；Indianapolis，IN)和Bethesda研 究室(生物素-14-dATP；Grand Island，NY)。酶类，DNA聚合酶I 和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)来自Promega(Madison， WI)；琼 脂(Seakem LE)来自FMC(Rockland，ME)；蛋白确定剂由购自Pier ce(Richferd，IL)的BCA蛋白分析试剂制作；NSC19细胞系由Neil Cashman博士提供(Montreal Neurologi Hospita1，Montrea 1，Canada)。
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1.2 细胞培养 运动神经元细胞系模型NSC19生长于加入10%胎 牛血清的DMEM介质中，再转入含0.5g/L胰岛素、0.5g/L人铁转蛋白、0. 5mg/L砷化钠、1.6g/L丁二胺、0.73mg/L孕酮(神经细胞的NI介质；Sigm)的D MEM中。
1.3 染色质凝聚 细胞由磷酸缓冲液(PBS)漂洗，用5μg/ml的 Hoechst33342或2μg/ml的安妥碘标记5分钟，再漂洗。细胞置于载玻片上， 在Leitz Optivert(Leica，Deerfie1d)荧光显微镜下检测。
1.4 原位末端标记(ISEL) 为获得原位末端标记，使用多聚酶I识别 D NA断片。细胞置于含4%多聚甲醛的PBS缓冲液中15分钟，用PBS漂洗3次，0. 1%*****-X-100渗透2分钟，内源性过氧化物酶在室温下5分钟内被新鲜的3%H 2O2所破坏，细胞进一步由蒸馏水Milli-Q(Millipore；Bedf ord，MA)冲洗，随后放入缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5和5mMgCl2 )在切口转换反应混合物(含50mM Tris-HCl pH7.9和5mM Mgcl210mM 2 -mercaptoethanol,50μg/ml BSA，30μMdNTP，30μM每种dNTP生物素- 14-dATP,200U/mL DNA多聚酶I)中温室下孵育1小时，冰冷的PBS冲洗4次，含2mg/m LBSA的PBS中冲洗1次而终止反应。为显示标记部位，胶片在1：100的抗生蛋白 链菌素-HRPPBS-BSA稀释液中温室下孵育1小时，PBS冲洗4次。最后放入50m M Tris-HCl(pH7.5)和5μM MgC12，二氨基苯胺试剂盒显影。每个 实验包括去酶和去抗生蛋白链菌素-HRP的对照。
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1.5 末端脱氧核苷酸转移酶生物素-d-UTP缺口末端标记(TUNE L) 底物断片通过用生物素核苷酸标记来检测，通过用生物素d-尿核苷酸三磷酸(UTP) 代替生物素d-ATP来修改。固定细胞，冲洗，去除过氧化物酶，与原位末端标记程序相同。 细胞在温室下用TDT缓冲液(500mM二甲砷酸盐pH6.8，5mM CoCl2，0.5mMDT T，0.5mg/mLBSA)处理10分钟，反应混合物用另含40μM生物素-14-dA TP和30U/mL的缓冲液替换，并在37℃高湿度条件下孵育1小时。反应由枸橼酸盐(SSC )标准生理盐水作用15分钟后停止；细胞用PBS冲洗，室温下用含2%BSA的PBS封片 10分钟，再用PBS冲洗，显影条件同ISEL，并行相似的对照。
1.6 凋亡指数 细胞凋亡的百分数由ISEL-阳性细胞数除以每个封片四个低 能区的总细胞数而确定。
1.7 DNA梯带 检测分离DNA中的DNA断片。细胞离心，细胞团再 于4℃下悬浮于600μL 10mM Tris-HCl pH7.5，10mM EDTA和0. 2%*****-x-100中15分钟。细胞在低温微型离心机(Beckman，Fullert on,CA)以12000转/分离心10分钟。收集上清液，蛋白由酚和25∶24∶1的酚： 氯仿：异丙醇提取法转移。水相DNA用乙醇沉淀，再悬浮，用0.6mg/mL RNAse A消 化。DNA产量在TKO 100荧光计(Hoefer，San Francisco)中用H oechst染剂来确定，电泳在2% Seakem LE琼脂中完成，DNA在紫外线照明下溴化乙烷 显影。实验中依次按程序操作，其中涉及电泳槽中细胞的直接溶解。
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1.8 条件介质 检测非贴壁细胞内的DNA断片及释放入介质中的DNA。 细胞以200g离心15分钟，移去碎片，上清液中的DNA用乙醇沉淀。沉淀的DNA用 蛋白酶K处理，在酚∶氯仿∶异丙醇中抽提2次，经乙醇最后沉淀。对再悬浮的 DNA定量，并用电泳分离。
1.9 标记F裂隙的蛋白印迹法分析 细胞团含大约1.5×106个 细胞，用100μL抽提缓冲液(10mM Tris-HC1 pH7.5,10mM EDTA和0.2% Trito n X-100)冰上处理10分钟，15000g离心30分钟。保存上清液，细胞团悬浮在 50μL SDS-PAGE承载缓冲液中，在100℃2-巯基乙醇中孵育10分钟，15000g离心 10分钟。蛋白聚集物用BCA蛋白试剂来确定，20-35μgr SDA-可溶性蛋白递减条件下加于 12%SDS-PAGE上，转移至PVDF膜，用含10%脱脂干奶粉和0.1%TWeen 20 的PBS阻断。该膜用1∶2000的α-fodrin单克隆抗体稀释液相同条件下用HR P相连的羊抗兔IgG处理，用加强的化学发光试剂盒显影。
, 百拇医药
2 结果
2.1 运动神经元细胞系模型 该系统中使用的NSC19细胞系在组织学上类似运 动神经元，最近的结果证实了以前的研究，这些细胞呈现运动神经元表型特征，呈ChAT抗体 染色标记阳性，表达ChAT抗原，与中枢胆碱能神经元相同。由停用血清而致的营养因素 缺失对培养的细胞具有很好的特征性效应，包括神经元在内的各种类型细胞的凋亡。NSC19 细胞在血清基质中生长，细胞退变和死亡的几种特性可在显微镜下观察，3天后，轴突变薄 、碎裂，胞体破坏增加，细胞数减少。
2.2 凋亡 为确定细胞缺失是否由凋亡所致，用多种技术检测了停用血 清后的细胞。通过用安妥碘和Hoechst 33342染色，观察DNA聚集。停用血清的细胞核呈 典型的凋亡细胞的染色质聚集。使用ISEL和TUNEL染色核DNA断片以观察是否出 现特征性DNA断片。两例中均出现阳性染色，高倍放大处理的核中可见凋亡小体。可通过 另一种方法观察DNA断片，将核DNA从处理的和非处理的细胞中分离，再用特殊的核酸内 切酶检测，可见典型的凋亡梯带和相关核间体DNA链的裂解，DNA断片的梯带大约20 0bp,与凋亡细胞中见到的相一致。在停用血清的一定条件下，DNA中可见凋亡的DNA断 片，死于凋亡的细胞可能释放DNA断片于基质中。
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2.3 运动神经元的凋亡伴随α-fodrin蛋白的降解 因为这些正在凋亡的 运动神经元呈现明显的膜内空泡，决定主要皮层细胞骨架成分α-fodrin(非红色光 谱)是否改变是很有意义的，且α-fodrin在细胞凋亡时以特征方式裂解。使用蛋白 印迹分析法，提取细胞蛋白。在细胞被停用血清后，存在于NSC19细胞的SDS-可溶性部分 的α-fodrin抗原进行退变。条带估计在160KD和130KD，代表标记裂片的 产物，在停用血清48小时即可出现。原有24KD的α-Fodrin也存在，这种α-次级 条带在72小时时开始剧烈降解，伴随裂解断片的增加。有趣的是，与裂解相关，停用血清 72小时，发现细胞形状的改变，包括细胞变圆和质膜空泡形成。
2.4 核分裂剂和蛋白激酶抑制剂诱导NSC19细胞的凋亡 已发现 停用血清可有效地将具有核分裂活性的NSC19细胞转变为凋亡细胞。试剂诱导的其他细 胞的凋亡已有研究，使用了各种代谢毒物：核分裂抑制剂、5μg/mg 5 Azacytidine、内质 网Ca2+-ATP酶抑制剂、1μM thapigargin，100μM蛋白激酶 抑制剂H-776。处理24小时后，细胞呈Hoechst 33258和ISE L阳性染色。凋亡指数评分显示，这些毒物在24小时内诱导特征性NSC19细胞的凋亡 ，如表1显示了各种制剂所致的凋亡指数，以评价运动神经元对凋亡诱导剂的敏感性。其中 ，蛋白激酶抑制剂H-7，在高浓度(100μM)时是一种有效的前凋亡剂。
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表1 各种处理后运动神经元凋亡指数(AL)评价 处理
剂量
作用时间(小时)
凋亡指数
血清撤除--
72
17.0±2.6
5-Azacytidine
5g/ml
24
8±2.0
Thapsigargin
, 百拇医药
1μM
24
12±1.7
H-7
100μM
24
21±3.1
3 讨论
凋亡是中枢神经系统退变性疾病的重要过程，与坏死细胞的丢失不同，其可通过有效的干扰 剂抑制诱导凋亡的途径，保护实质细胞。程序性细胞死亡包括在各种运动神经元疾病中。近 来研究表明，脊髓损伤后的继发性细胞死亡也是凋亡。
除检测凋亡的经典方法外，己发现NSC19细胞的程序性死亡产生皮质细胞骨架蛋白α-f odrin的特征裂隙。使蛋白底物数量增加，细胞的结构和调节部位被与凋亡起始有关的蛋白 酶家族成员引起的局限性蛋白分解而破坏。这些成员包括多核糖基(ADP)—多聚酶、多糖 (核层粘连蛋白)GDP分裂抑制剂、D4-GDI、DNA-依赖蛋白激酶及fodrin。它 们通过凋亡——活性蛋白酶引起的退变与核间体DNA断片、质膜空泡形成、凋亡小体形成 和表示凋亡特性的信号途径的改变有关。
, 百拇医药
Fodrin作为皮质细胞骨架的主要成分，参与介导细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架的相互作用 。完整的fodrin链和交链肌动蛋白丝形成稳定的异二聚体。引人注目是，fodrin标记裂隙伴随各种不同刺激所致的凋亡而出现。α-fodrin次级单位的局限性分解导致机动蛋 白交链和交链特性的不可逆缺失。最近的研究结果表明，伴随各种检测试剂所致的运动神 经元程序性死亡出现特征裂隙，提示其是一种或多种酪蛋白酶活性的死亡信号。Cryns 等报道在Fas-和FTN-诱导的Jurkat和He1a细胞的凋亡中，fodrin被分裂， 与CPP32不同，然而在体实验中，纯化的fodrin被CPP32降解为与凋亡细胞培养中观 察的相同大小的断片。一种CPP32的特异位点抑制剂DEVD-CHO，保护细胞免遭Fa s-诱导的凋亡，但不能保护fodrin蛋白分解，这提示此种蛋白裂解与凋亡细胞的死亡并不 同时出现。尽管Calpain先与fodrin裂解有关，但裂解fodrin的蛋白酶对Calp ain抑制剂敏感。目前正开展何种蛋白酶参与NSC19运动神经元细胞系fodrin 裂解的研究。
, 百拇医药
凋亡中α-fodrin和肌动蛋白裂解对细胞骨架的组织学重建起重要作用，结果是质膜空泡和细胞断片形成凋亡小体。这对神经元尤为重要，因为轴突的缩卷可参与其他组织学重 建。
通过各种检测和处理，结果提示运动神经元通过凋亡而死亡。停用血清，对杂交的运动神经 元细胞处理24～48小时，细胞凋亡获得最大程度的表达，方可反映其连续的核分裂潜 能 。使用代谢毒物，凋亡仅需24小时，提示运动神经元模型对选择的化学剂，在产生程序性 死亡中具有较强的敏感性。一项结果表明了H-7的影响，其在最短时间内(21%在24小时)具有最高的凋亡指数，H7是有效的蛋白激酶(PKA)抑制剂(PKK和PM的)。 在极低温度下，1-10μM即显示保护初级大鼠海马神经元免遭张力诱导的细胞死亡。PK 抑制剂对神经元存活的浓度依赖性的影响机制尚不清楚。这种模型运动神经元系统将证明有 益于分析各种脊髓疾病中运动神经元细胞死亡的机理。此种稳定的、分离的细胞系将用于各 种调节现象(包括转录、翻译和翻译后机制)的定性和定量，可通过初级运动神经元和离 体实验而证明。最近，研究者使用该系统研究了脊髓损伤培养模型中凋亡调节途径的相互作 用和对过多的凝血酶信号的反应。
(译自Spine,1998,23(2):151～158)
作者简介：万超(1972-)，男(汉族)，山东枣庄市人，博士研究生。
收稿日期：1999-02-09, http://www.100md.com
单位：万超(上海第二医科大学 上海市伤骨科研究所)；王拥军(上海中医药大学骨伤科研究所 上海 200032)；施杞(上海中医药大学骨伤科研究所 上海 200032)
关键词：神经元；凋亡
中国中医骨伤科杂志000228 中图分类法：Q421；Q786 文献标识码：B 文章编号：1005-0205(2000)02 -0059-03
近来几家实验室研究发现，与发育过程中程序性细胞死亡不同， 不适宜的细胞凋亡可能是各种中枢神经系统疾病(包括脊髓损伤)中实质细胞丢失的原因 。细胞凋亡涉及充当最终“执行者”的特异蛋白酶的激活。这些酶包括IL-1β转化酶(IC E)、ICE相关蛋白酶，均是Caenorbabditis e1egans细胞死亡CED -3家族的成员，因其具有半胱氨酸活性部位和受天门冬氨酸残基特异作用后裂解，故看作 为酪蛋白酶。
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细胞缺失的类型确定为凋亡而非坏死，依靠多个指标，包括核染色质凝聚，核间体部位DN A断片、膜和细胞器结构存在及无炎症反应。在组织培养模型中，凋亡可能起始于营养因 素 的丢失。凋亡的信号包括调控的级联反应被延迟，经历足够的时间，提供对抗这些调控途径 及保护因损伤或疾病而丢失的功能性神经元的可能性。凋亡机理的阐明将引发有效治疗脊髓 疾病的药物的研制与开发。
最近，研究者创立了一种有利于研究细胞凋亡机理的运动神经元细胞系模型NSC19细胞 系，这些细胞来源于鼠成神经细胞瘤(N18TG2)和早期鼠胚胎脊髓运动神经元的融合 。它们表现运动神经元的形态学特性，表达胆碱乙酰基转移酶(ChAT)。发现这些细胞 通过凋亡诱导细胞死亡，作者确定这些运动神经元在停用血清和使用核分裂抑制剂的作用下 发生凋亡。
1 材料和方法
1.1 试剂 DNA染剂(Hoechst33342和安妥碘)购自Sigma化学 公司(St.Louis，MO)；α-fodrin抗体(mAb1622)和乙酰胆碱转移 酶购自Chemicon Internationa1，Inc.(Temecula，CA )；免疫检测剂，辣根过氧化酶(HRP)结合羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G，抗生蛋白链 菌素一HRP，化学发光强化试剂盒购自Amersham(Arlingron Heights ，IL)。所有试剂根据手册说明使用，免疫检测底物氨基联苯胺购自Vector实验室 (Burlingame，CA) ，核苷酸购自Boehringer Mannheim(d CTP，dGTP，dTTP；Indianapolis，IN)和Bethesda研 究室(生物素-14-dATP；Grand Island，NY)。酶类，DNA聚合酶I 和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)来自Promega(Madison， WI)；琼 脂(Seakem LE)来自FMC(Rockland，ME)；蛋白确定剂由购自Pier ce(Richferd，IL)的BCA蛋白分析试剂制作；NSC19细胞系由Neil Cashman博士提供(Montreal Neurologi Hospita1，Montrea 1，Canada)。
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1.2 细胞培养 运动神经元细胞系模型NSC19生长于加入10%胎 牛血清的DMEM介质中，再转入含0.5g/L胰岛素、0.5g/L人铁转蛋白、0. 5mg/L砷化钠、1.6g/L丁二胺、0.73mg/L孕酮(神经细胞的NI介质；Sigm)的D MEM中。
1.3 染色质凝聚 细胞由磷酸缓冲液(PBS)漂洗，用5μg/ml的 Hoechst33342或2μg/ml的安妥碘标记5分钟，再漂洗。细胞置于载玻片上， 在Leitz Optivert(Leica，Deerfie1d)荧光显微镜下检测。
1.4 原位末端标记(ISEL) 为获得原位末端标记，使用多聚酶I识别 D NA断片。细胞置于含4%多聚甲醛的PBS缓冲液中15分钟，用PBS漂洗3次，0. 1%*****-X-100渗透2分钟，内源性过氧化物酶在室温下5分钟内被新鲜的3%H 2O2所破坏，细胞进一步由蒸馏水Milli-Q(Millipore；Bedf ord，MA)冲洗，随后放入缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5和5mMgCl2 )在切口转换反应混合物(含50mM Tris-HCl pH7.9和5mM Mgcl210mM 2 -mercaptoethanol,50μg/ml BSA，30μMdNTP，30μM每种dNTP生物素- 14-dATP,200U/mL DNA多聚酶I)中温室下孵育1小时，冰冷的PBS冲洗4次，含2mg/m LBSA的PBS中冲洗1次而终止反应。为显示标记部位，胶片在1：100的抗生蛋白 链菌素-HRPPBS-BSA稀释液中温室下孵育1小时，PBS冲洗4次。最后放入50m M Tris-HCl(pH7.5)和5μM MgC12，二氨基苯胺试剂盒显影。每个 实验包括去酶和去抗生蛋白链菌素-HRP的对照。
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1.5 末端脱氧核苷酸转移酶生物素-d-UTP缺口末端标记(TUNE L) 底物断片通过用生物素核苷酸标记来检测，通过用生物素d-尿核苷酸三磷酸(UTP) 代替生物素d-ATP来修改。固定细胞，冲洗，去除过氧化物酶，与原位末端标记程序相同。 细胞在温室下用TDT缓冲液(500mM二甲砷酸盐pH6.8，5mM CoCl2，0.5mMDT T，0.5mg/mLBSA)处理10分钟，反应混合物用另含40μM生物素-14-dA TP和30U/mL的缓冲液替换，并在37℃高湿度条件下孵育1小时。反应由枸橼酸盐(SSC )标准生理盐水作用15分钟后停止；细胞用PBS冲洗，室温下用含2%BSA的PBS封片 10分钟，再用PBS冲洗，显影条件同ISEL，并行相似的对照。
1.6 凋亡指数 细胞凋亡的百分数由ISEL-阳性细胞数除以每个封片四个低 能区的总细胞数而确定。
1.7 DNA梯带 检测分离DNA中的DNA断片。细胞离心，细胞团再 于4℃下悬浮于600μL 10mM Tris-HCl pH7.5，10mM EDTA和0. 2%*****-x-100中15分钟。细胞在低温微型离心机(Beckman，Fullert on,CA)以12000转/分离心10分钟。收集上清液，蛋白由酚和25∶24∶1的酚： 氯仿：异丙醇提取法转移。水相DNA用乙醇沉淀，再悬浮，用0.6mg/mL RNAse A消 化。DNA产量在TKO 100荧光计(Hoefer，San Francisco)中用H oechst染剂来确定，电泳在2% Seakem LE琼脂中完成，DNA在紫外线照明下溴化乙烷 显影。实验中依次按程序操作，其中涉及电泳槽中细胞的直接溶解。
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1.8 条件介质 检测非贴壁细胞内的DNA断片及释放入介质中的DNA。 细胞以200g离心15分钟，移去碎片，上清液中的DNA用乙醇沉淀。沉淀的DNA用 蛋白酶K处理，在酚∶氯仿∶异丙醇中抽提2次，经乙醇最后沉淀。对再悬浮的 DNA定量，并用电泳分离。
1.9 标记F裂隙的蛋白印迹法分析 细胞团含大约1.5×106个 细胞，用100μL抽提缓冲液(10mM Tris-HC1 pH7.5,10mM EDTA和0.2% Trito n X-100)冰上处理10分钟，15000g离心30分钟。保存上清液，细胞团悬浮在 50μL SDS-PAGE承载缓冲液中，在100℃2-巯基乙醇中孵育10分钟，15000g离心 10分钟。蛋白聚集物用BCA蛋白试剂来确定，20-35μgr SDA-可溶性蛋白递减条件下加于 12%SDS-PAGE上，转移至PVDF膜，用含10%脱脂干奶粉和0.1%TWeen 20 的PBS阻断。该膜用1∶2000的α-fodrin单克隆抗体稀释液相同条件下用HR P相连的羊抗兔IgG处理，用加强的化学发光试剂盒显影。
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2 结果
2.1 运动神经元细胞系模型 该系统中使用的NSC19细胞系在组织学上类似运 动神经元，最近的结果证实了以前的研究，这些细胞呈现运动神经元表型特征，呈ChAT抗体 染色标记阳性，表达ChAT抗原，与中枢胆碱能神经元相同。由停用血清而致的营养因素 缺失对培养的细胞具有很好的特征性效应，包括神经元在内的各种类型细胞的凋亡。NSC19 细胞在血清基质中生长，细胞退变和死亡的几种特性可在显微镜下观察，3天后，轴突变薄 、碎裂，胞体破坏增加，细胞数减少。
2.2 凋亡 为确定细胞缺失是否由凋亡所致，用多种技术检测了停用血 清后的细胞。通过用安妥碘和Hoechst 33342染色，观察DNA聚集。停用血清的细胞核呈 典型的凋亡细胞的染色质聚集。使用ISEL和TUNEL染色核DNA断片以观察是否出 现特征性DNA断片。两例中均出现阳性染色，高倍放大处理的核中可见凋亡小体。可通过 另一种方法观察DNA断片，将核DNA从处理的和非处理的细胞中分离，再用特殊的核酸内 切酶检测，可见典型的凋亡梯带和相关核间体DNA链的裂解，DNA断片的梯带大约20 0bp,与凋亡细胞中见到的相一致。在停用血清的一定条件下，DNA中可见凋亡的DNA断 片，死于凋亡的细胞可能释放DNA断片于基质中。
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2.3 运动神经元的凋亡伴随α-fodrin蛋白的降解 因为这些正在凋亡的 运动神经元呈现明显的膜内空泡，决定主要皮层细胞骨架成分α-fodrin(非红色光 谱)是否改变是很有意义的，且α-fodrin在细胞凋亡时以特征方式裂解。使用蛋白 印迹分析法，提取细胞蛋白。在细胞被停用血清后，存在于NSC19细胞的SDS-可溶性部分 的α-fodrin抗原进行退变。条带估计在160KD和130KD，代表标记裂片的 产物，在停用血清48小时即可出现。原有24KD的α-Fodrin也存在，这种α-次级 条带在72小时时开始剧烈降解，伴随裂解断片的增加。有趣的是，与裂解相关，停用血清 72小时，发现细胞形状的改变，包括细胞变圆和质膜空泡形成。
2.4 核分裂剂和蛋白激酶抑制剂诱导NSC19细胞的凋亡 已发现 停用血清可有效地将具有核分裂活性的NSC19细胞转变为凋亡细胞。试剂诱导的其他细 胞的凋亡已有研究，使用了各种代谢毒物：核分裂抑制剂、5μg/mg 5 Azacytidine、内质 网Ca2+-ATP酶抑制剂、1μM thapigargin，100μM蛋白激酶 抑制剂H-776。处理24小时后，细胞呈Hoechst 33258和ISE L阳性染色。凋亡指数评分显示，这些毒物在24小时内诱导特征性NSC19细胞的凋亡 ，如表1显示了各种制剂所致的凋亡指数，以评价运动神经元对凋亡诱导剂的敏感性。其中 ，蛋白激酶抑制剂H-7，在高浓度(100μM)时是一种有效的前凋亡剂。
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表1 各种处理后运动神经元凋亡指数(AL)评价 处理
剂量
作用时间(小时)
凋亡指数
血清撤除--
72
17.0±2.6
5-Azacytidine
5g/ml
24
8±2.0
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1μM
24
12±1.7
H-7
100μM
24
21±3.1
3 讨论
凋亡是中枢神经系统退变性疾病的重要过程，与坏死细胞的丢失不同，其可通过有效的干扰 剂抑制诱导凋亡的途径，保护实质细胞。程序性细胞死亡包括在各种运动神经元疾病中。近 来研究表明，脊髓损伤后的继发性细胞死亡也是凋亡。
除检测凋亡的经典方法外，己发现NSC19细胞的程序性死亡产生皮质细胞骨架蛋白α-f odrin的特征裂隙。使蛋白底物数量增加，细胞的结构和调节部位被与凋亡起始有关的蛋白 酶家族成员引起的局限性蛋白分解而破坏。这些成员包括多核糖基(ADP)—多聚酶、多糖 (核层粘连蛋白)GDP分裂抑制剂、D4-GDI、DNA-依赖蛋白激酶及fodrin。它 们通过凋亡——活性蛋白酶引起的退变与核间体DNA断片、质膜空泡形成、凋亡小体形成 和表示凋亡特性的信号途径的改变有关。
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Fodrin作为皮质细胞骨架的主要成分，参与介导细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架的相互作用 。完整的fodrin链和交链肌动蛋白丝形成稳定的异二聚体。引人注目是，fodrin标记裂隙伴随各种不同刺激所致的凋亡而出现。α-fodrin次级单位的局限性分解导致机动蛋 白交链和交链特性的不可逆缺失。最近的研究结果表明，伴随各种检测试剂所致的运动神 经元程序性死亡出现特征裂隙，提示其是一种或多种酪蛋白酶活性的死亡信号。Cryns 等报道在Fas-和FTN-诱导的Jurkat和He1a细胞的凋亡中，fodrin被分裂， 与CPP32不同，然而在体实验中，纯化的fodrin被CPP32降解为与凋亡细胞培养中观 察的相同大小的断片。一种CPP32的特异位点抑制剂DEVD-CHO，保护细胞免遭Fa s-诱导的凋亡，但不能保护fodrin蛋白分解，这提示此种蛋白裂解与凋亡细胞的死亡并不 同时出现。尽管Calpain先与fodrin裂解有关，但裂解fodrin的蛋白酶对Calp ain抑制剂敏感。目前正开展何种蛋白酶参与NSC19运动神经元细胞系fodrin 裂解的研究。
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凋亡中α-fodrin和肌动蛋白裂解对细胞骨架的组织学重建起重要作用，结果是质膜空泡和细胞断片形成凋亡小体。这对神经元尤为重要，因为轴突的缩卷可参与其他组织学重 建。
通过各种检测和处理，结果提示运动神经元通过凋亡而死亡。停用血清，对杂交的运动神经 元细胞处理24～48小时，细胞凋亡获得最大程度的表达，方可反映其连续的核分裂潜 能 。使用代谢毒物，凋亡仅需24小时，提示运动神经元模型对选择的化学剂，在产生程序性 死亡中具有较强的敏感性。一项结果表明了H-7的影响，其在最短时间内(21%在24小时)具有最高的凋亡指数，H7是有效的蛋白激酶(PKA)抑制剂(PKK和PM的)。 在极低温度下，1-10μM即显示保护初级大鼠海马神经元免遭张力诱导的细胞死亡。PK 抑制剂对神经元存活的浓度依赖性的影响机制尚不清楚。这种模型运动神经元系统将证明有 益于分析各种脊髓疾病中运动神经元细胞死亡的机理。此种稳定的、分离的细胞系将用于各 种调节现象(包括转录、翻译和翻译后机制)的定性和定量，可通过初级运动神经元和离 体实验而证明。最近，研究者使用该系统研究了脊髓损伤培养模型中凋亡调节途径的相互作 用和对过多的凝血酶信号的反应。
(译自Spine,1998,23(2):151～158)
作者简介：万超(1972-)，男(汉族)，山东枣庄市人，博士研究生。
收稿日期：1999-02-09, http://www.100md.com