微量反应板法测定血小板聚集微生物添加剂与抗生素预混料对肉鸡的饲养效果比较微生态学应继续进行观念更新
作者：陈军浩 叶树俊 胡锡池
单位：陈军浩 叶树俊(南京大学医学院附属南京鼓楼医院检验科,江苏省南京市,210008)；胡锡池(无锡市第二人民医院)
关键词：血小板聚集；微板法；血小板聚集仪法
中国微循环000231
【摘要】目的 建立微量反应板测定血小板聚集的方法(MP法).方法 血小板最佳浓度为200±50×109/L;ADP最佳浓度为4unmol/L(终浓度);酶标仪波长选择655mm;标本振荡用旋涡混合器.结果 批内精密度6.58%,与血小板聚集仪法同时对15例标本的血小板最大聚集率测定结果进行了比较,两法基本一致,无显著性差异,P>0.05.结论 MP法适合于临床及科研对批量血小板聚集率的测定。
Measuring Platelet Aggregation with Microplate Reader
, http://www.100md.com
Chen Junhao,Ye Shujun,Hu Xichi
(Department of Laboratory,The Affiliated Gulou Hospital of Nanjing University Medical College,Nanjing,210008)
【Abstract】Objective To develop the method of measuring platelet aggregation with microplate reader(MP).Methods The best concentration of platelet suspension is 200±50×109/L;The final concentration of ADP is 4unmol/L; wavelength 655nm;The sample volume 150ul,the sample is agitated by a vortex agitator between each reading cycle.Results The coefficiency of variation within (CV) is 6.58%.Compared with the results of 15 samples measured by microplate reader and aggregometer,there is no obvious difference.Conclusion The microplate reader is suitable for clinical determination and scientific research for a batch of platelet aggregation evaluations.
, 百拇医药
【Key words】Platelet aggregation Microplate reader Aggregometer
血小板聚集试验(PAgT)是临床广泛用于评价血小板功能的试验之一。在许多疾病状态下，血小板聚集性均可增高或减低，如心肌梗塞、糖尿病等血小板聚集性增高，而肝硬化、尿毒症及某些药物可使血小板聚集性减低。在研究药物对血小板功能影响等方面，血小板聚集试验也必不可少。我们参考有关文献[1,2]，探讨了微量反应板酶标仪比浊法测定血小板聚集的可行性及试验条件，该法与血小板聚集仪法结果相符。本法特别适合批量血小板聚集试验的测定。现报告如下。
试剂与设备
1 TYXN-96多功能智能血液凝集仪：上海通用机电研究所产品。
2 BIO-RAD Model-550酶标仪：美国伯乐公司生产。
, http://www.100md.com
3 FZQ-2型旋涡混合器：固定转速为2900r/min，振幅6mm。
4 Coulter JT-IR血细胞分析仪：美国COULTER公司生产。
5 二磷酸腺苷(ADP)致聚剂：用pH7.4， 0.2mol/L磷酸缓冲液配制，浓度为40umol/L。
方 法
1 血小板的分离：用一次性塑料注射器抽取静脉血4.5ml,小心注入到含有0.5ml 109mmol/L枸橼酸钠的塑料试管中，轻轻摇匀，加盖，1000r/min离心10min，分离富血小板血浆(PRP)。将残余血液继续3000r/min离心20min，分离贫血小板血浆(PPP)。以Coulter JT-IR血细胞分析仪计数PRP血小板数量，用PPP调整，使PRP血小板计数分别为300、200、100±50×109/L。
, 百拇医药
2 血小板聚集仪器法：按产品说明书要求操作。致聚剂ADP终浓度为2.0umol/L。
3 MP法：在微量反应板小孔中加入ADP致聚剂17ul，再准确加入PRP血浆150ul，开始计时。先振摇20s，放置在酶标仪中，30s时开始测量各反应孔吸光度，以后在不同时间内连续测量。测量间隙，取出反应板，继续在振荡器上振摇。以150ul PPP加17ul生理盐水调零，记录不同时间的吸光度，直到吸光度不再下降为止。
结 果
1 ADP浓度选择：在MP法中加入不同量ADP致聚剂，使终浓分别为0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0 umol/L，对一份标本进行测定，结果如表1。
表1 不同浓度ADP对血小板最大聚集率测定的影响 ADP浓度(unmo/L)
, http://www.100md.com 血小板最大聚集率(%)
0.5
35.8
1.0
55.3
2.0
69.5
4.0
72.4
8.0
71.9
2 振荡强度的选择：我们曾经用MM-1型微量振荡器，将振荡器旋扭分别设置在低、中、高档，以及FZQ-2型旋涡混合器对微量反应板标本进行振荡，ADP致聚剂终浓度为4umol/L，测定一正常标本血小板最大聚集率，结果如表2。表2 振荡强度对血小板聚集率测定的影响 振荡强度
, http://www.100md.com
血小板最大聚集率(%)
达到最大聚集率需时间(min)
低
56.9
60
中
68.2
45
高
67.7
15
FZQ-2
69.1
, http://www.100md.com
6
3 血小板浓度的选择：取一标本，用PPP调整PRP血小板浓度分别为300、200、100±50×109/L，血小板计数用Coulter JT血细胞分析仪测定。各浓度血小板分别进行MP法血小板聚集测定。结果见表3。表3 MP法血小板浓度的选择 血小板计数(×109L)
最大聚集率(%)
287
60.6
177
66.7
98
65.3
4 批内精密度：对同一份标本重复测定(n=5),
=67.6%,s=4.448,CV=6.58%。
, http://www.100md.com
5 MP法与血小板聚集仪法的比较：我们随机选择了15例就诊患者标本，(其中11例PAgT正常，4例PAgT异常)，对两法最大血小板聚集率结果进行了比较。MP法-=67.5%,血小板聚集仪法-=68.2%；经配对t检验，t=1.976，P>0.05，两法无显著性差异。
讨 论
PAgT在临床上应用十分广泛，许多疾病都可能导致血小板聚集性增高或减低，而血小板聚集性的改变将引起多种并发症。因此，对血小板聚集能力进行监测具有十分重要的意义。PAgT一般采用比浊法，需要特殊仪器，且只能单个处理标本，不适合批量标本的测定。我们参考有关文献[1,2]，探讨了微量反应板测定PAgT的方法，该法能够满足一般临床上的需要，特别适合对血小板功能的研究。
表1结果显示，ADP终浓度在0.5～2umol/L内，随着浓度的增加，最大聚集率也有所上升，达到2umol/L后，血小板最大聚集率则不随ADP浓度的增加而出现明显改变。因此，我们选择ADP浓度为4umol/L做为本法的应用浓度。检测波长选择655nm。这是由于PRP本身为淡黄色，选择该波长能最大限度克服血浆自身吸光度对血小板悬浊液吸光度的掩蔽作用。
, 百拇医药
血小板浓度以200±50×109/L为好。如果血小板浓度过大，则聚集的血小板在反应杯底部形成絮状沉淀，干扰酶标仪对标本吸光度的测定。如标本浓度过小，则血小板之间碰撞机会减少，形成聚集的时间延长，并且使吸光度下降的绝对值减少，影响测定方法的灵敏度。振荡强度越高，能使血小板相互的碰撞机会增多，且碰撞力度也高，有利于血小板聚集的形成。我们以曾用MM-1型微量振荡器，以不同振荡强度对本法进行了研究。发现振荡越高，达到最大聚集所需时间越短，对最大聚集率则无明显影响(除非振荡强度太低)，应用FZQ-2型旋涡混合器能极大地缩短聚集反应时间，而使用MM-1型振荡器的最大振荡强度仍不能达到文献报告的血小板最大聚集所需时间[1]，可能是振荡强度仍不足所致。用旋涡混合器虽然能产生足够的振荡强度，但操作方法较难掌握，振荡强度受主观影响较大，无法固定在某一点上。我们目前尚未找到理想的振荡器。表2结果表明，振荡强度对血小板聚集完成时间有重要的影响。这是因为，振荡强度决定了血小板之间相互碰撞机会的多少，相互之间的碰撞是血小板聚集的必要条件。
, 百拇医药
文献报道[1,2]，温度对MP法实验无显著性影响。故我们所做的各项实验均在室温下进行，没有对温度条件进行探讨。从本法实际操作结果来看，温度的确不是一个重要的影响因素。MP法批内精密度良好，CV=6.58%。应用本法与血小板聚集仪法对15例正常及异常标本进行了比较，两者血小板最大聚集率结果一致，无显著性差别，(P>0.05)，能够满足一般临床测定需要。对批量血小板最大聚集率的测定，本法的实用性明显优于血小板聚集仪法。
参考文献
1，Fratantoni J C,Poindexter B J.Measuring platelet aggregation with microplate reader.Am J Clin Pathol 1990;94:613
2，Bohumil B.,Cindra C,Robert J G,et al.Platelet aggregation monitored in 96 well microplate reader is useful for evaluation of platelet agonists and antagonists.Thromb.Res.1995;77(5):453～463.
, 百拇医药
(收稿：1999-04-08)
中国微生态学杂志 2000年第5期第12卷 论 著
微生物添加剂与抗生素预混料对肉鸡的饲养效果比较
作者：温朗聪 马晓琼 董永军 姜建民 李清司 杨景哲
单位：温朗聪 马晓琼 董永军(大连化工研究设计院生化工程室，辽宁大连 116023)；姜建民 李清司 杨景哲(大连市牧畜医研究所，辽宁大连 11602)
关键词：
中国微生态学杂志 1999年第4期第11卷 述评
微生态学应继续进行观念更新
作者：康 白
单位：大连医科大学 116027
关键词：, 百拇医药
单位：陈军浩 叶树俊(南京大学医学院附属南京鼓楼医院检验科,江苏省南京市,210008)；胡锡池(无锡市第二人民医院)
关键词：血小板聚集；微板法；血小板聚集仪法
中国微循环000231
【摘要】目的 建立微量反应板测定血小板聚集的方法(MP法).方法 血小板最佳浓度为200±50×109/L;ADP最佳浓度为4unmol/L(终浓度);酶标仪波长选择655mm;标本振荡用旋涡混合器.结果 批内精密度6.58%,与血小板聚集仪法同时对15例标本的血小板最大聚集率测定结果进行了比较,两法基本一致,无显著性差异,P>0.05.结论 MP法适合于临床及科研对批量血小板聚集率的测定。
Measuring Platelet Aggregation with Microplate Reader
, http://www.100md.com
Chen Junhao,Ye Shujun,Hu Xichi
(Department of Laboratory,The Affiliated Gulou Hospital of Nanjing University Medical College,Nanjing,210008)
【Abstract】Objective To develop the method of measuring platelet aggregation with microplate reader(MP).Methods The best concentration of platelet suspension is 200±50×109/L;The final concentration of ADP is 4unmol/L; wavelength 655nm;The sample volume 150ul,the sample is agitated by a vortex agitator between each reading cycle.Results The coefficiency of variation within (CV) is 6.58%.Compared with the results of 15 samples measured by microplate reader and aggregometer,there is no obvious difference.Conclusion The microplate reader is suitable for clinical determination and scientific research for a batch of platelet aggregation evaluations.
, 百拇医药
【Key words】Platelet aggregation Microplate reader Aggregometer
血小板聚集试验(PAgT)是临床广泛用于评价血小板功能的试验之一。在许多疾病状态下，血小板聚集性均可增高或减低，如心肌梗塞、糖尿病等血小板聚集性增高，而肝硬化、尿毒症及某些药物可使血小板聚集性减低。在研究药物对血小板功能影响等方面，血小板聚集试验也必不可少。我们参考有关文献[1,2]，探讨了微量反应板酶标仪比浊法测定血小板聚集的可行性及试验条件，该法与血小板聚集仪法结果相符。本法特别适合批量血小板聚集试验的测定。现报告如下。
试剂与设备
1 TYXN-96多功能智能血液凝集仪：上海通用机电研究所产品。
2 BIO-RAD Model-550酶标仪：美国伯乐公司生产。
, http://www.100md.com
3 FZQ-2型旋涡混合器：固定转速为2900r/min，振幅6mm。
4 Coulter JT-IR血细胞分析仪：美国COULTER公司生产。
5 二磷酸腺苷(ADP)致聚剂：用pH7.4， 0.2mol/L磷酸缓冲液配制，浓度为40umol/L。
方 法
1 血小板的分离：用一次性塑料注射器抽取静脉血4.5ml,小心注入到含有0.5ml 109mmol/L枸橼酸钠的塑料试管中，轻轻摇匀，加盖，1000r/min离心10min，分离富血小板血浆(PRP)。将残余血液继续3000r/min离心20min，分离贫血小板血浆(PPP)。以Coulter JT-IR血细胞分析仪计数PRP血小板数量，用PPP调整，使PRP血小板计数分别为300、200、100±50×109/L。
, 百拇医药
2 血小板聚集仪器法：按产品说明书要求操作。致聚剂ADP终浓度为2.0umol/L。
3 MP法：在微量反应板小孔中加入ADP致聚剂17ul，再准确加入PRP血浆150ul，开始计时。先振摇20s，放置在酶标仪中，30s时开始测量各反应孔吸光度，以后在不同时间内连续测量。测量间隙，取出反应板，继续在振荡器上振摇。以150ul PPP加17ul生理盐水调零，记录不同时间的吸光度，直到吸光度不再下降为止。
结 果
1 ADP浓度选择：在MP法中加入不同量ADP致聚剂，使终浓分别为0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0 umol/L，对一份标本进行测定，结果如表1。
表1 不同浓度ADP对血小板最大聚集率测定的影响 ADP浓度(unmo/L)
, http://www.100md.com 血小板最大聚集率(%)
0.5
35.8
1.0
55.3
2.0
69.5
4.0
72.4
8.0
71.9
2 振荡强度的选择：我们曾经用MM-1型微量振荡器，将振荡器旋扭分别设置在低、中、高档，以及FZQ-2型旋涡混合器对微量反应板标本进行振荡，ADP致聚剂终浓度为4umol/L，测定一正常标本血小板最大聚集率，结果如表2。表2 振荡强度对血小板聚集率测定的影响 振荡强度
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血小板最大聚集率(%)
达到最大聚集率需时间(min)
低
56.9
60
中
68.2
45
高
67.7
15
FZQ-2
69.1
, http://www.100md.com
6
3 血小板浓度的选择：取一标本，用PPP调整PRP血小板浓度分别为300、200、100±50×109/L，血小板计数用Coulter JT血细胞分析仪测定。各浓度血小板分别进行MP法血小板聚集测定。结果见表3。表3 MP法血小板浓度的选择 血小板计数(×109L)
最大聚集率(%)
287
60.6
177
66.7
98
65.3
4 批内精密度：对同一份标本重复测定(n=5),
=67.6%,s=4.448,CV=6.58%。, http://www.100md.com
5 MP法与血小板聚集仪法的比较：我们随机选择了15例就诊患者标本，(其中11例PAgT正常，4例PAgT异常)，对两法最大血小板聚集率结果进行了比较。MP法-=67.5%,血小板聚集仪法-=68.2%；经配对t检验，t=1.976，P>0.05，两法无显著性差异。
讨 论
PAgT在临床上应用十分广泛，许多疾病都可能导致血小板聚集性增高或减低，而血小板聚集性的改变将引起多种并发症。因此，对血小板聚集能力进行监测具有十分重要的意义。PAgT一般采用比浊法，需要特殊仪器，且只能单个处理标本，不适合批量标本的测定。我们参考有关文献[1,2]，探讨了微量反应板测定PAgT的方法，该法能够满足一般临床上的需要，特别适合对血小板功能的研究。
表1结果显示，ADP终浓度在0.5～2umol/L内，随着浓度的增加，最大聚集率也有所上升，达到2umol/L后，血小板最大聚集率则不随ADP浓度的增加而出现明显改变。因此，我们选择ADP浓度为4umol/L做为本法的应用浓度。检测波长选择655nm。这是由于PRP本身为淡黄色，选择该波长能最大限度克服血浆自身吸光度对血小板悬浊液吸光度的掩蔽作用。
, 百拇医药
血小板浓度以200±50×109/L为好。如果血小板浓度过大，则聚集的血小板在反应杯底部形成絮状沉淀，干扰酶标仪对标本吸光度的测定。如标本浓度过小，则血小板之间碰撞机会减少，形成聚集的时间延长，并且使吸光度下降的绝对值减少，影响测定方法的灵敏度。振荡强度越高，能使血小板相互的碰撞机会增多，且碰撞力度也高，有利于血小板聚集的形成。我们以曾用MM-1型微量振荡器，以不同振荡强度对本法进行了研究。发现振荡越高，达到最大聚集所需时间越短，对最大聚集率则无明显影响(除非振荡强度太低)，应用FZQ-2型旋涡混合器能极大地缩短聚集反应时间，而使用MM-1型振荡器的最大振荡强度仍不能达到文献报告的血小板最大聚集所需时间[1]，可能是振荡强度仍不足所致。用旋涡混合器虽然能产生足够的振荡强度，但操作方法较难掌握，振荡强度受主观影响较大，无法固定在某一点上。我们目前尚未找到理想的振荡器。表2结果表明，振荡强度对血小板聚集完成时间有重要的影响。这是因为，振荡强度决定了血小板之间相互碰撞机会的多少，相互之间的碰撞是血小板聚集的必要条件。
, 百拇医药
文献报道[1,2]，温度对MP法实验无显著性影响。故我们所做的各项实验均在室温下进行，没有对温度条件进行探讨。从本法实际操作结果来看，温度的确不是一个重要的影响因素。MP法批内精密度良好，CV=6.58%。应用本法与血小板聚集仪法对15例正常及异常标本进行了比较，两者血小板最大聚集率结果一致，无显著性差别，(P>0.05)，能够满足一般临床测定需要。对批量血小板最大聚集率的测定，本法的实用性明显优于血小板聚集仪法。
参考文献
1，Fratantoni J C,Poindexter B J.Measuring platelet aggregation with microplate reader.Am J Clin Pathol 1990;94:613
2，Bohumil B.,Cindra C,Robert J G,et al.Platelet aggregation monitored in 96 well microplate reader is useful for evaluation of platelet agonists and antagonists.Thromb.Res.1995;77(5):453～463.
, 百拇医药
(收稿：1999-04-08)
中国微生态学杂志 2000年第5期第12卷 论 著
微生物添加剂与抗生素预混料对肉鸡的饲养效果比较
作者：温朗聪 马晓琼 董永军 姜建民 李清司 杨景哲
单位：温朗聪 马晓琼 董永军(大连化工研究设计院生化工程室，辽宁大连 116023)；姜建民 李清司 杨景哲(大连市牧畜医研究所，辽宁大连 11602)
关键词：
中国微生态学杂志 1999年第4期第11卷 述评
微生态学应继续进行观念更新
作者：康 白
单位：大连医科大学 116027
关键词：, 百拇医药