动脉内膜损伤及三种反义c-myc RNA的作用
作者：曾嵘 刘小蓉 宋立功 郑梦利 周生 李进
单位：曾嵘 刘小蓉 李进(510515 广州，第一军医大学组织胚胎教研室)；宋立功(中国人民解放军总医院心内科)；郑梦利(中国人民解放军总医院胸外科)；周生(军事医学科学院三所二室)
关键词：血管内膜；损伤；基因疗法
中华医学杂志000225
【摘要】 目的 了解反义c-myc基因导入对血管壁的影响。方法 将分别载有c-myc第1、2和3外显子反义片段的三种重组逆转录病毒表达载体aM1、aM2和aM3导入球囊损伤的兔股动脉壁，并于术后21天进行表达检测。结果 (1)兔股动脉区域不仅利于控制损伤、给药和取材，而且血管内膜和中膜的面积比达到了1.37∶1，其中膜c-myc表达强度和面积增至正常的1.8倍和1.5倍；(2)三个反义实验组中膜和内膜c-myc表达则显著减少，其中aM2、aM3和aM1中膜强度分别减少了37.5%、20.8%和17.8%，面积分别减少了 71.5%、57.2%和61.6%，内膜强度分别减少了31.3%、20.8%和17.8%；(3)aM2组内膜/中膜比下降了72.6%，aM3组下降了35.2%；(4)三种反义转染组内膜和中膜增殖细胞核抗原(PCNA)表达出现强度增加而面积显著减少的现象；(5)与内膜/中膜比下降相平行，三个反义转染组中膜和内膜α-SM actin的表达明显增加，增加程度为aM2>aM3>aM1。结论 兔股动脉损伤模型可以取得满意的模型效果，而反义c-myc导入能减少和抵消损伤血管myc的表达增加，对抗损伤所造成的血管壁内膜增生和平滑肌细胞去分化，并以aM2作用最强。
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Artery denuded model and effects of
three kinds of antisense c-myc RNA
ZENG Rong*, LIU Xiaorong, SONG Ligong, et al.
(*Deparement of Histology and Embrgology , First Military Medical Vniversity , Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of antisense c-myc on injuried vascular wall. Methods Three recombinant retroviral expression vectors,aM1, aM2 and aM3, which loading the reverse fragment of exon1,2 and 3 respectively, were transferred into denuded rabbit femoral artery wall and were assayed 21 days after operation. Results (1) The regions of rabbit femoral artery were not only convenient for injury control, drug giving and material drawing,but also gave a neointimal area to media area vatio of 1.37∶1. Their intensity and area of c-myc expression in media increased to 1.8 and 1.5 fold of normal value. (2) c-myc expression in aM2,aM3 and aM1 was reduced by 37.5%, 20.8%, and 17.8% with media intensity, 71.5%, 57.2%, and 61.6% with media area and 31.3%, 20.8%, and 17.8% with neointimal intensity respectively. (3) Neointimal area/media area of aM2 group reduced by 72.6%, aM3 group reduced by 35.2%, aM1 group had no significant difference comparing with control group. (4) Proliferating cellular nuclear antigen (PCNA) in the intimal and media of the three antisense transferred groups was enhanced with their expressive intensities, but reduced with expressive areas significantly. (5) With the declining of neointimal area/media area, α-SM actin expression in the intimal and media of the three antisense transferred groups was significantly increased (aM2>aM3>aM1). Conclusion (1) Rabbit femoral artery denuded model is a satisfactory animal model. (2) Antisense c-myc transferring can reduce or resist the c-myc increase in injured artery wall, resist neointimal hyperplasia and smooth muscle cells dedifferentiation,especially c-myc exon 2 antisense RNA vector aM2.
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【Key words】 Vascular intima; Damage; Therapy, gene
作为治疗冠状动脉粥样硬化后狭窄的治疗手段，经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)的手术成功率已达到95%以上，但其术后6个月内会有30%～50%的再狭窄发生率，意味着一半的病人将在术后半年需再手术。目前，尚未找到有效防止再狭窄的办法，而再狭窄的最主要病理过程是血管损伤后血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和迁移。在此，我们将构建成功的三种反义c-myc逆转录病毒表达载体aM1、aM2和aM3(分别载有c-myc的第1、2和3外显子反义片断)[1，2]分别导入球囊损伤的兔股动脉，观察它们对血管壁和VSMC的影响。
材料和方法
一、材料
1.雄性新西兰大白兔，体重2～3 kg，由军事医学科学院动物所提供。
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2.直径3 mm的PTCA球囊导管(瑞士Schneider公司)。
3.小鼠c-myc(c-33)单克隆抗体(简称单抗，德国Santa Cruz公司)；小鼠增殖细胞核抗原(PCNA)单抗、SP试剂盒(美国Zymed公司)；α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)单抗(丹麦DaKo公司)。
4.切片机(德国Sartorius-Werke公司)； Quantimet 520型显微图像分析仪(德国Leica公司)。
二、方法
1.兔股动脉内膜损伤模型的建立：质量分数为0.03的戊巴比妥钠30 mg/kg经耳缘静脉麻醉，固定、术野消毒，在股动脉搏动处剪开皮肤，分离筋膜，暴露及游离股动脉2～3 cm，在上下端各上一血管夹，剪开动脉下端一小口，插入带有导引钢丝的球囊导管，松开上侧血管夹，将球囊充液膨胀并缓慢抽拉，反复3次后夹上上端血管夹，撤出导管，结扎血管切口，缝合皮肤。实验组(3只兔)在损伤及阻断血流的情况下，用微量加样器向血管内各注50 μl逆转录病毒载体(0.5 μg/μl)和10 μl脂质体的混合物，15 min后结扎血管，恢复血流，缝合皮肤。术后1周给予肌注青霉素80万U/d，以防感染。
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2.血管节段的取材：术后第21 d，将动物麻醉，开胸后由心尖部插管，用质量分数为0.04的多聚甲醛灌洗固定，随后剪开手术部位，以遗留在皮下的血管结扎线为标记，取出线头以上近心端股动脉2～3 cm，多聚甲醛固定。取未损伤的股动脉为对照，进行同样处理。
3.免疫组化染色检测c-myc 、PCNA和α-SM actin表达：按SP试剂盒说明书进行。
4.c-myc 、PCNA和α-SM actin表达产物的半定量：使用图像分析仪进行吸光度(A值)测量，每组测量3～5张切片，共30个测量框，记录测量框中反应物面积(area)及平均A值(mean)。
5.分组和统计学处理：实验共分6组，包括正常血管组(normal)、单纯损伤组(+)、损伤及空载体pLNCX给予组(LN)、损伤及三种反义载体给予组(分别为aM1、aM2和aM3)，并采用SPSS 7.5软件，进行单因素方差分析。
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结果
一、兔股动脉内膜损伤模型的建立
在球囊损伤后21 d，与未损伤的正常股动脉(图1)相比，球囊损伤的动脉内弹性膜大部分仍保持连续、完整，部分则出现了局部断裂，中膜基本完好，但在内弹性膜断裂处则内层细胞走行改变，与新内膜相延续，内膜则发生显著的不规则增生，内皮下层增厚，使管腔变小(图2)，采用图像分析仪测量，内膜与中膜的面积比达到了1.37∶1，证明血管损伤模型已制作成功。
图1 正常股动脉，弹性纤维染色×4
图2 损伤股动脉，弹性纤维染色×4
二、对血管壁c-myc表达的影响(表1)
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表1 兔股动脉c-myc的表达 组别
面积
平均A值
内膜
中膜
内膜
中膜
正常对照
0.066±
0.007
743±
437
单纯损伤
, 百拇医药
0.140±
0.019
0.126±
0.014△
7 510±
3 696
9 547±
5 012△
LN
0.131±
0.016
0.120±
, 百拇医药
0.013△
7 277±
3 403
11 300±
4 333△
aM1
0.107±
0.022*
0.103±
0.020*△
7 452±
, 百拇医药 3 343
4 341±
5 476*
aM2
0.090±
0.009*▲
0.075±
0.006*
4 331±
3 345
3 224±
3 369*
, 百拇医药
aM3
0.104±
0.014*
0.089±
0.014*△
6 558±
7 525
4 835±
3 913*
注：*与LN组相比，P<0.01，▲与aM1，aM3相比，P<0.05，△与正常对照相比，P<0.01
, 百拇医药
与正常股动脉壁中膜c-myc表达量相比，单纯损伤组和空载体给予组(LN)不管是在表达强度或是表达数量(面积)上都明显提高，以LN为例，其中膜c-myc强度和数量分别增至正常的1.8倍和1.5倍，从图3也可以直接看出损伤组c-myc表达明显增强，而正常血管中c-myc表达只呈弱阳性(图4)，空载体给予组和单纯损伤组之间差异无显著意义。而三组反义载体给予组则中膜和内膜的c-myc表达均比空载体给予组显著减少，具体表现为：三组反义作用组中膜c-myc表达强度和数量(面积)均比空载体组显著减小(P<0.05)，具体为：aM2、aM3和aM1强度分别减少了37.5%、20.8%和17.8%，表达面积分别减少了71.5%、57.2%和61.6% 。其中aM2组下降最明显，强于aM1和aM3(P<0.05),其中膜c-myc表达强度与正常血管差异无显著意义(P>0.05)，只是表达数量(面积)比正常增多，(图5)无强阳性细胞。内膜中反义组c-myc的表达强度也都明显下降(P<0.05)，下降程度是aM2>aM3>aM1，且aM2组显著低于aM3和aM1组(P<0.05)，具体下降比例分别是31.3%、20.8%和17.8%，但内膜中c-myc表达数量(面积)各组变化差异无显著意义(P>0.05)，而且组内差异(标准差)较大(表1)。
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图3 损伤股动脉c-myc表达，免疫组化染色×40
图4 正常股动脉c-myc表达，免疫组化染色×40
图5 aM2组股动脉c-myc表达，免疫组化染色×40
表2 兔股动脉PCNA表达 组别
面积
平均A值
内膜
中膜
内膜
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中膜
正常对照
0.033±
0.0045
80±
54
单纯损伤
0.04±
0.006
0.045±
0.007△
16 205±
4 373
, 百拇医药
40 528±
10 498△
LN
0.0395±
0.0040
0.0416±
0.0045△
17 016±
3 684
37 348±
11 741△
aM1
, 百拇医药
0.0683±
0.0120*●
0.0594±
0.0115*△
13 273±
7 925
7 613±
7 052*△●
aM2
0.1465±
0.0203*▲
, 百拇医药
0.1089±
0.0113*△▲
1 836±
1 990*▲
267±
246*▲
aM3
0.0488±
0.0022*
0.0475±
0.0028*△
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17 747±
1 512
17 073±
5 943△
注：△与正常对照比较P<0.05；*与LN组比较P<0.05；▲与aM1,aM3比较P<0.05；
●与aM3比较P<0.05
表3 兔股动脉α-SM actin表达 组别
面积
平均A值
内膜
, 百拇医药
中膜
内膜
中膜
正常对照
0.086 6±
0.005 6
26 392±
1 234
单纯损伤
0.072 0±
0.004 2
0.063 3±
0.005 3△
, 百拇医药
1 942±
1 096
4 986±
1404△
LN
0.071 2±
0.005 2
0.066 9±
0.003 0△
1 746±
1 388
5 517±
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1012△
aM1
0.074 0±
0.003 3●
0.084 1±
0.009 4*
9 858±
4 027*●
8 679±
3 539*△●
aM2
, 百拇医药
0.077 2±
0.002 7*
0.087 7±
0.006 3*●
9 990±
2 639*
22 610±
1 707*△▲
aM3
0.079 1±
0.007 3*
, 百拇医药
0.079 1±
0.006 4*△
13 570±
6 849*
16 697±
4 936*△
注：△与正常对照相比，P<0.05；*与LN组相比，P<0.05；▲与aM1、aM3比较P<0.05；
●与aM3比较P<0.05
三、对血管壁内膜/中膜的影响(图6)
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图6 兔股动脉内膜/中膜
内膜损伤和空载体给予组(LN)的股动脉内膜显著增生，内膜与中膜的面积比达到1.34，与单纯损伤组差异无显著意义。而aM2和aM3组则使内膜/中膜比明显下降(图7)(P<0.05)，尤其是aM2组，与空载体转导组相比内膜/中膜比下降了72.6%，aM3组下降了35.2%，aM1组则与空载体转导对照组差异无显著意义。
图7 aM2组股动脉(内膜/中膜比明显下降)弹性纤维染色×4
单纯损伤的阳性对照组及空载体对照组，中膜PCNA的强度和数量(面积)均比正常股动脉显著增加(P<0.05)，尤其是面积急剧上升(如空载体对照组升至467倍)，说明PCNA阳性细胞大大增加。而三种反义基因转导组则出现内膜和中膜PCNA强度比空载体对照组显著增加(aM2>aM1>aM3, P<0.05，分别为：内膜增至3.7、1.7和1.2倍；中膜增至2.6、1.4和1.1倍)，而面积大量减少的现象(中膜降至7.1%、20.3%和45.6%,aM2
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图8 正常股动脉PCNA表达，免疫组化染色×20
图9 损伤股动脉PCNA表达，免疫组化染色×20
图10 aM2组股动脉PCNA表达，免疫组化染色×20
五、对股动脉壁α-SM actin表达的影响
我们用鼠抗人的α-SM actin单抗检测了正常和球囊损伤各组动脉壁VSMC中α-SM actin的表达，结果表明单纯损伤及空载体转导组中膜和内膜α-SM actin表达强度和数量比正常动脉均明显下降(P<0.05 )，而三组反义组则中膜和内膜α-SM actin表达均比空载体对照组明显增加，其增加程度是aM2>aM3>aM1(表3)。
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新生内膜中有actin表达，但弱于中膜。中膜部分区域则失去规则排列，α-SM actin表达变稀少，排列紊乱。高倍镜下(图11)显示α-SM actin分布于胞质中，并以胞膜下为明显，核区未见表达，并因未复染而显示空泡状。
图11 aM2组α-SMactin表达，免疫组化染色×40
讨论
一、动脉内膜损伤模型的选择和建立
目前已有多种实验动物模型用于研究动脉粥样硬化(AS)中血管内膜SMC增生造成的管腔狭窄以及PTCA术后的再狭窄，但都未能令人满意。采用兔作为实验动物则可以使用人PTCA手术的器械，并能保证动物成活率，另外，我们选取股动脉作为手术部位，该处血管位置表浅，术野暴露良好，便于控制损伤、给药和取材。我们的实验结果充分证明了该区域可以取得满意的模型效果，并按血管损伤的组织学分级[3]分类属于1～2级损伤。因为内膜增生的程度与中膜损伤的程度密切相关，我们除了在复制模型的操作上进行一致性控制，还在其后的检测取材中选取组织损伤同一分级的切片进行检测和统计分析，以保证结果的可信度。
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二、三种反义c-myc导入对动脉壁c-myc表达的影响
首先，在我们复制的兔股动脉损伤模型中，血管壁c-myc的表达因球囊损伤所带来的极大刺激而产生大幅度的提高，表达量和表达强度均显著上升，证实在损伤的血管壁增生中的确有c-myc高表达的出现和参与。其次，三种反义c-myc的导入明显地下调了血管壁c-myc蛋白的表达，而且不管是在中膜或是内膜，其降低靶蛋白表达的作用都是aM2>aM3>aM1，显示了c-myc exon 2的反义基因在体内抑制自身基因表达的头号地位，表明c-myc反义基因的作用具有序列特异性和靶区优劣性，并揭示了反义抑制转录起始区具有强于一般的编码区或3'端、5'端非编码区的反义封闭作用。再次，从各实验组血管壁c-myc表达强度和面积的分布上看，不管是正常血管还是损伤血管，其血管壁c-myc的表达强度都极为接近(标准差小)，而表达面积却相当弥散(标准差大)，尤其是在新生的内膜中这种现象更为突出，使各组新生内膜c-myc表达面积显示不出统计学差异。结合对切片的观察，可以看出产生这种现象的原因，是细胞在血管壁中的不均匀分布所造成。尤其是在新生内膜中，细胞排列紊乱，常成群成堆出现，这种现象同时提示在血管壁尤其在新生内膜中，细胞的分裂增殖状态并不均一，密集区的细胞可能相对处于分裂旺盛状态。这种集落现象的出现，按照Benditt等[4]1973年提出的“单克隆学说”来解释，是由于AS斑块形成是单一细胞增殖所造成的结果，也是损伤反应造成的选择优势。
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三、三种反义c-myc导入对血管壁增生的影响
AS可归为两个过程：自发型AS和以内膜增生为特点的加速型AS。血管损伤对这两个过程都是一个重要的启动因素。而SMC的增殖对这两种形式造成的血管堵塞都是必要和重要的。细胞增殖需要早期快速反应基因产物的表达，用反义分子减少它们的表达，就可以抑制细胞增殖。基于这种原因，针对c-myc，c-myb等的反义寡核苷酸(asONDs)被应用于抑制VSMC增殖和防止再狭窄的研究。Shi等[5]曾使用c-myc的asONDs一次性地通过导管冠脉给药，结果单次导管冠脉给药即有效地减少了新内膜的形成。考虑到asONDs的作用持久性毕竟有限(在2周时已观察不到对内膜增生的抑制作用[6])，而且关于其作用效力和机制仍存在着疑问[7]，我们将构建成功的三种反义c-myc分子导入球囊损伤后的血管壁中，结果显示了各不相同的抗增生作用：aM2抗增生非常显著(达72.6%)，aM3次之(35.2%)，而aM1无明显作用，这一结果恰好与三种反义分子抑制myc表达的作用相平行，显示了myc表达抑制与VSMC增生抑制之间存在密切的联系，也显示了c-myc exon 2在其自身蛋白表达和细胞增殖调控中的重要地位。我们还同时观察了血管壁PCNA表达的变化。结果显示内皮损伤可以引起血管壁PCNA表达显著提高，PCNA阳性细胞极大地增多；而三种反义载体的导入可以引起血管壁中膜PCNA阳性细胞大大减少，但PCNA阳性细胞的强度却增加，而且阳性细胞数的减少与强度的增加具有对应关系：阳性细胞数越少，反应强度越高。除此之外，内膜中的PCNA反应强度比相应的中膜PCNA反应强度还要提高。这种现象的出现，有可能是局部未转染细胞的一种反馈调节作用所引起，这有待进一步的分析研究。
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四、三种反义c-myc导入对VSMC表型的影响
本实验结果表明，球囊损伤的血管中膜和内膜中的α-SM actin表达均下降，证实球囊损伤的血管壁SMC出现了表型转换和不完全的去分化现象，而且这种现象在SMC由中膜迁至内膜前已经发生。同时，我们的结果还显示反义c-myc的导入可以对抗损伤所造成的表型转换和去分化作用，而且该作用与c-myc蛋白的下调程度、血管壁增生的抑制程度相同步，就是说，能明显抑制c-myc表达的作用因素(如aM2)，不仅能明显抑制血管壁增生，而且可能明显对抗VSMC去分化和向合成型转换。
参考文献
[1]曾嵘，李进.人反义c-myc重组逆转录病毒表达载体pLNC-aM1的构建.解剖科学进展，1998，4:60-63.
[2]曾嵘，李进.人反义c-myc重组逆转录病毒表达载体pLNC-aM2和pLNC-aM3的构建.细胞与分子免疫学杂志，1998，3:103-105.
, 百拇医药
[3]Shi Y, Fard A, Galeo A, et al. Transcatheter delivery of c-myc antisense oligomers reduces neointimal formation in a porcine model of coronary artery balloon injury. Circulation, 1994,90:944-951.
[4]Benditt EP,Benditt JM.Evidence for the monoclonal origin of human atherosclerotic plaques. PNAS, 1973,70:1753-1756.
[5]Shi Y, Fard A, Galeo A, et al. Transcatheter delivery of c-myc antisense oligomers reduces neointimal formation in a porcine model of coronary artery balloon injury. Circulation, 1994,90:944-951.
[6]Edelman ER,Simons M, Sirois MG, et al. C-myc in vasculopoliferative disease. Circ Res, 1995, 76:176-182.
[7]Bock LC, Griffin LC, Latham JA, et al. Selection of single stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature, 1992,355:564-566.
收稿日期：1998-12-20, http://www.100md.com
单位：曾嵘 刘小蓉 李进(510515 广州，第一军医大学组织胚胎教研室)；宋立功(中国人民解放军总医院心内科)；郑梦利(中国人民解放军总医院胸外科)；周生(军事医学科学院三所二室)
关键词：血管内膜；损伤；基因疗法
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【摘要】 目的 了解反义c-myc基因导入对血管壁的影响。方法 将分别载有c-myc第1、2和3外显子反义片段的三种重组逆转录病毒表达载体aM1、aM2和aM3导入球囊损伤的兔股动脉壁，并于术后21天进行表达检测。结果 (1)兔股动脉区域不仅利于控制损伤、给药和取材，而且血管内膜和中膜的面积比达到了1.37∶1，其中膜c-myc表达强度和面积增至正常的1.8倍和1.5倍；(2)三个反义实验组中膜和内膜c-myc表达则显著减少，其中aM2、aM3和aM1中膜强度分别减少了37.5%、20.8%和17.8%，面积分别减少了 71.5%、57.2%和61.6%，内膜强度分别减少了31.3%、20.8%和17.8%；(3)aM2组内膜/中膜比下降了72.6%，aM3组下降了35.2%；(4)三种反义转染组内膜和中膜增殖细胞核抗原(PCNA)表达出现强度增加而面积显著减少的现象；(5)与内膜/中膜比下降相平行，三个反义转染组中膜和内膜α-SM actin的表达明显增加，增加程度为aM2>aM3>aM1。结论 兔股动脉损伤模型可以取得满意的模型效果，而反义c-myc导入能减少和抵消损伤血管myc的表达增加，对抗损伤所造成的血管壁内膜增生和平滑肌细胞去分化，并以aM2作用最强。
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Artery denuded model and effects of
three kinds of antisense c-myc RNA
ZENG Rong*, LIU Xiaorong, SONG Ligong, et al.
(*Deparement of Histology and Embrgology , First Military Medical Vniversity , Guangzhou 510515, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of antisense c-myc on injuried vascular wall. Methods Three recombinant retroviral expression vectors,aM1, aM2 and aM3, which loading the reverse fragment of exon1,2 and 3 respectively, were transferred into denuded rabbit femoral artery wall and were assayed 21 days after operation. Results (1) The regions of rabbit femoral artery were not only convenient for injury control, drug giving and material drawing,but also gave a neointimal area to media area vatio of 1.37∶1. Their intensity and area of c-myc expression in media increased to 1.8 and 1.5 fold of normal value. (2) c-myc expression in aM2,aM3 and aM1 was reduced by 37.5%, 20.8%, and 17.8% with media intensity, 71.5%, 57.2%, and 61.6% with media area and 31.3%, 20.8%, and 17.8% with neointimal intensity respectively. (3) Neointimal area/media area of aM2 group reduced by 72.6%, aM3 group reduced by 35.2%, aM1 group had no significant difference comparing with control group. (4) Proliferating cellular nuclear antigen (PCNA) in the intimal and media of the three antisense transferred groups was enhanced with their expressive intensities, but reduced with expressive areas significantly. (5) With the declining of neointimal area/media area, α-SM actin expression in the intimal and media of the three antisense transferred groups was significantly increased (aM2>aM3>aM1). Conclusion (1) Rabbit femoral artery denuded model is a satisfactory animal model. (2) Antisense c-myc transferring can reduce or resist the c-myc increase in injured artery wall, resist neointimal hyperplasia and smooth muscle cells dedifferentiation,especially c-myc exon 2 antisense RNA vector aM2.
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【Key words】 Vascular intima; Damage; Therapy, gene
作为治疗冠状动脉粥样硬化后狭窄的治疗手段，经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)的手术成功率已达到95%以上，但其术后6个月内会有30%～50%的再狭窄发生率，意味着一半的病人将在术后半年需再手术。目前，尚未找到有效防止再狭窄的办法，而再狭窄的最主要病理过程是血管损伤后血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和迁移。在此，我们将构建成功的三种反义c-myc逆转录病毒表达载体aM1、aM2和aM3(分别载有c-myc的第1、2和3外显子反义片断)[1，2]分别导入球囊损伤的兔股动脉，观察它们对血管壁和VSMC的影响。
材料和方法
一、材料
1.雄性新西兰大白兔，体重2～3 kg，由军事医学科学院动物所提供。
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2.直径3 mm的PTCA球囊导管(瑞士Schneider公司)。
3.小鼠c-myc(c-33)单克隆抗体(简称单抗，德国Santa Cruz公司)；小鼠增殖细胞核抗原(PCNA)单抗、SP试剂盒(美国Zymed公司)；α-平滑肌肌动蛋白(α-SM actin)单抗(丹麦DaKo公司)。
4.切片机(德国Sartorius-Werke公司)； Quantimet 520型显微图像分析仪(德国Leica公司)。
二、方法
1.兔股动脉内膜损伤模型的建立：质量分数为0.03的戊巴比妥钠30 mg/kg经耳缘静脉麻醉，固定、术野消毒，在股动脉搏动处剪开皮肤，分离筋膜，暴露及游离股动脉2～3 cm，在上下端各上一血管夹，剪开动脉下端一小口，插入带有导引钢丝的球囊导管，松开上侧血管夹，将球囊充液膨胀并缓慢抽拉，反复3次后夹上上端血管夹，撤出导管，结扎血管切口，缝合皮肤。实验组(3只兔)在损伤及阻断血流的情况下，用微量加样器向血管内各注50 μl逆转录病毒载体(0.5 μg/μl)和10 μl脂质体的混合物，15 min后结扎血管，恢复血流，缝合皮肤。术后1周给予肌注青霉素80万U/d，以防感染。
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2.血管节段的取材：术后第21 d，将动物麻醉，开胸后由心尖部插管，用质量分数为0.04的多聚甲醛灌洗固定，随后剪开手术部位，以遗留在皮下的血管结扎线为标记，取出线头以上近心端股动脉2～3 cm，多聚甲醛固定。取未损伤的股动脉为对照，进行同样处理。
3.免疫组化染色检测c-myc 、PCNA和α-SM actin表达：按SP试剂盒说明书进行。
4.c-myc 、PCNA和α-SM actin表达产物的半定量：使用图像分析仪进行吸光度(A值)测量，每组测量3～5张切片，共30个测量框，记录测量框中反应物面积(area)及平均A值(mean)。
5.分组和统计学处理：实验共分6组，包括正常血管组(normal)、单纯损伤组(+)、损伤及空载体pLNCX给予组(LN)、损伤及三种反义载体给予组(分别为aM1、aM2和aM3)，并采用SPSS 7.5软件，进行单因素方差分析。
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结果
一、兔股动脉内膜损伤模型的建立
在球囊损伤后21 d，与未损伤的正常股动脉(图1)相比，球囊损伤的动脉内弹性膜大部分仍保持连续、完整，部分则出现了局部断裂，中膜基本完好，但在内弹性膜断裂处则内层细胞走行改变，与新内膜相延续，内膜则发生显著的不规则增生，内皮下层增厚，使管腔变小(图2)，采用图像分析仪测量，内膜与中膜的面积比达到了1.37∶1，证明血管损伤模型已制作成功。
图1 正常股动脉，弹性纤维染色×4
图2 损伤股动脉，弹性纤维染色×4
二、对血管壁c-myc表达的影响(表1)
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表1 兔股动脉c-myc的表达 组别
面积
平均A值
内膜
中膜
内膜
中膜
正常对照
0.066±
0.007
743±
437
单纯损伤
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0.140±
0.019
0.126±
0.014△
7 510±
3 696
9 547±
5 012△
LN
0.131±
0.016
0.120±
, 百拇医药
0.013△
7 277±
3 403
11 300±
4 333△
aM1
0.107±
0.022*
0.103±
0.020*△
7 452±
, 百拇医药 3 343
4 341±
5 476*
aM2
0.090±
0.009*▲
0.075±
0.006*
4 331±
3 345
3 224±
3 369*
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aM3
0.104±
0.014*
0.089±
0.014*△
6 558±
7 525
4 835±
3 913*
注：*与LN组相比，P<0.01，▲与aM1，aM3相比，P<0.05，△与正常对照相比，P<0.01
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与正常股动脉壁中膜c-myc表达量相比，单纯损伤组和空载体给予组(LN)不管是在表达强度或是表达数量(面积)上都明显提高，以LN为例，其中膜c-myc强度和数量分别增至正常的1.8倍和1.5倍，从图3也可以直接看出损伤组c-myc表达明显增强，而正常血管中c-myc表达只呈弱阳性(图4)，空载体给予组和单纯损伤组之间差异无显著意义。而三组反义载体给予组则中膜和内膜的c-myc表达均比空载体给予组显著减少，具体表现为：三组反义作用组中膜c-myc表达强度和数量(面积)均比空载体组显著减小(P<0.05)，具体为：aM2、aM3和aM1强度分别减少了37.5%、20.8%和17.8%，表达面积分别减少了71.5%、57.2%和61.6% 。其中aM2组下降最明显，强于aM1和aM3(P<0.05),其中膜c-myc表达强度与正常血管差异无显著意义(P>0.05)，只是表达数量(面积)比正常增多，(图5)无强阳性细胞。内膜中反义组c-myc的表达强度也都明显下降(P<0.05)，下降程度是aM2>aM3>aM1，且aM2组显著低于aM3和aM1组(P<0.05)，具体下降比例分别是31.3%、20.8%和17.8%，但内膜中c-myc表达数量(面积)各组变化差异无显著意义(P>0.05)，而且组内差异(标准差)较大(表1)。
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图3 损伤股动脉c-myc表达，免疫组化染色×40
图4 正常股动脉c-myc表达，免疫组化染色×40
图5 aM2组股动脉c-myc表达，免疫组化染色×40
表2 兔股动脉PCNA表达 组别
面积
平均A值
内膜
中膜
内膜
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中膜
正常对照
0.033±
0.0045
80±
54
单纯损伤
0.04±
0.006
0.045±
0.007△
16 205±
4 373
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40 528±
10 498△
LN
0.0395±
0.0040
0.0416±
0.0045△
17 016±
3 684
37 348±
11 741△
aM1
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0.0683±
0.0120*●
0.0594±
0.0115*△
13 273±
7 925
7 613±
7 052*△●
aM2
0.1465±
0.0203*▲
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0.1089±
0.0113*△▲
1 836±
1 990*▲
267±
246*▲
aM3
0.0488±
0.0022*
0.0475±
0.0028*△
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17 747±
1 512
17 073±
5 943△
注：△与正常对照比较P<0.05；*与LN组比较P<0.05；▲与aM1,aM3比较P<0.05；
●与aM3比较P<0.05
表3 兔股动脉α-SM actin表达 组别
面积
平均A值
内膜
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中膜
内膜
中膜
正常对照
0.086 6±
0.005 6
26 392±
1 234
单纯损伤
0.072 0±
0.004 2
0.063 3±
0.005 3△
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1 942±
1 096
4 986±
1404△
LN
0.071 2±
0.005 2
0.066 9±
0.003 0△
1 746±
1 388
5 517±
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1012△
aM1
0.074 0±
0.003 3●
0.084 1±
0.009 4*
9 858±
4 027*●
8 679±
3 539*△●
aM2
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0.077 2±
0.002 7*
0.087 7±
0.006 3*●
9 990±
2 639*
22 610±
1 707*△▲
aM3
0.079 1±
0.007 3*
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0.079 1±
0.006 4*△
13 570±
6 849*
16 697±
4 936*△
注：△与正常对照相比，P<0.05；*与LN组相比，P<0.05；▲与aM1、aM3比较P<0.05；
●与aM3比较P<0.05
三、对血管壁内膜/中膜的影响(图6)
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图6 兔股动脉内膜/中膜
内膜损伤和空载体给予组(LN)的股动脉内膜显著增生，内膜与中膜的面积比达到1.34，与单纯损伤组差异无显著意义。而aM2和aM3组则使内膜/中膜比明显下降(图7)(P<0.05)，尤其是aM2组，与空载体转导组相比内膜/中膜比下降了72.6%，aM3组下降了35.2%，aM1组则与空载体转导对照组差异无显著意义。
图7 aM2组股动脉(内膜/中膜比明显下降)弹性纤维染色×4
单纯损伤的阳性对照组及空载体对照组，中膜PCNA的强度和数量(面积)均比正常股动脉显著增加(P<0.05)，尤其是面积急剧上升(如空载体对照组升至467倍)，说明PCNA阳性细胞大大增加。而三种反义基因转导组则出现内膜和中膜PCNA强度比空载体对照组显著增加(aM2>aM1>aM3, P<0.05，分别为：内膜增至3.7、1.7和1.2倍；中膜增至2.6、1.4和1.1倍)，而面积大量减少的现象(中膜降至7.1%、20.3%和45.6%,aM2
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图8 正常股动脉PCNA表达，免疫组化染色×20
图9 损伤股动脉PCNA表达，免疫组化染色×20
图10 aM2组股动脉PCNA表达，免疫组化染色×20
五、对股动脉壁α-SM actin表达的影响
我们用鼠抗人的α-SM actin单抗检测了正常和球囊损伤各组动脉壁VSMC中α-SM actin的表达，结果表明单纯损伤及空载体转导组中膜和内膜α-SM actin表达强度和数量比正常动脉均明显下降(P<0.05 )，而三组反义组则中膜和内膜α-SM actin表达均比空载体对照组明显增加，其增加程度是aM2>aM3>aM1(表3)。
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新生内膜中有actin表达，但弱于中膜。中膜部分区域则失去规则排列，α-SM actin表达变稀少，排列紊乱。高倍镜下(图11)显示α-SM actin分布于胞质中，并以胞膜下为明显，核区未见表达，并因未复染而显示空泡状。
图11 aM2组α-SMactin表达，免疫组化染色×40
讨论
一、动脉内膜损伤模型的选择和建立
目前已有多种实验动物模型用于研究动脉粥样硬化(AS)中血管内膜SMC增生造成的管腔狭窄以及PTCA术后的再狭窄，但都未能令人满意。采用兔作为实验动物则可以使用人PTCA手术的器械，并能保证动物成活率，另外，我们选取股动脉作为手术部位，该处血管位置表浅，术野暴露良好，便于控制损伤、给药和取材。我们的实验结果充分证明了该区域可以取得满意的模型效果，并按血管损伤的组织学分级[3]分类属于1～2级损伤。因为内膜增生的程度与中膜损伤的程度密切相关，我们除了在复制模型的操作上进行一致性控制，还在其后的检测取材中选取组织损伤同一分级的切片进行检测和统计分析，以保证结果的可信度。
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二、三种反义c-myc导入对动脉壁c-myc表达的影响
首先，在我们复制的兔股动脉损伤模型中，血管壁c-myc的表达因球囊损伤所带来的极大刺激而产生大幅度的提高，表达量和表达强度均显著上升，证实在损伤的血管壁增生中的确有c-myc高表达的出现和参与。其次，三种反义c-myc的导入明显地下调了血管壁c-myc蛋白的表达，而且不管是在中膜或是内膜，其降低靶蛋白表达的作用都是aM2>aM3>aM1，显示了c-myc exon 2的反义基因在体内抑制自身基因表达的头号地位，表明c-myc反义基因的作用具有序列特异性和靶区优劣性，并揭示了反义抑制转录起始区具有强于一般的编码区或3'端、5'端非编码区的反义封闭作用。再次，从各实验组血管壁c-myc表达强度和面积的分布上看，不管是正常血管还是损伤血管，其血管壁c-myc的表达强度都极为接近(标准差小)，而表达面积却相当弥散(标准差大)，尤其是在新生的内膜中这种现象更为突出，使各组新生内膜c-myc表达面积显示不出统计学差异。结合对切片的观察，可以看出产生这种现象的原因，是细胞在血管壁中的不均匀分布所造成。尤其是在新生内膜中，细胞排列紊乱，常成群成堆出现，这种现象同时提示在血管壁尤其在新生内膜中，细胞的分裂增殖状态并不均一，密集区的细胞可能相对处于分裂旺盛状态。这种集落现象的出现，按照Benditt等[4]1973年提出的“单克隆学说”来解释，是由于AS斑块形成是单一细胞增殖所造成的结果，也是损伤反应造成的选择优势。
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三、三种反义c-myc导入对血管壁增生的影响
AS可归为两个过程：自发型AS和以内膜增生为特点的加速型AS。血管损伤对这两个过程都是一个重要的启动因素。而SMC的增殖对这两种形式造成的血管堵塞都是必要和重要的。细胞增殖需要早期快速反应基因产物的表达，用反义分子减少它们的表达，就可以抑制细胞增殖。基于这种原因，针对c-myc，c-myb等的反义寡核苷酸(asONDs)被应用于抑制VSMC增殖和防止再狭窄的研究。Shi等[5]曾使用c-myc的asONDs一次性地通过导管冠脉给药，结果单次导管冠脉给药即有效地减少了新内膜的形成。考虑到asONDs的作用持久性毕竟有限(在2周时已观察不到对内膜增生的抑制作用[6])，而且关于其作用效力和机制仍存在着疑问[7]，我们将构建成功的三种反义c-myc分子导入球囊损伤后的血管壁中，结果显示了各不相同的抗增生作用：aM2抗增生非常显著(达72.6%)，aM3次之(35.2%)，而aM1无明显作用，这一结果恰好与三种反义分子抑制myc表达的作用相平行，显示了myc表达抑制与VSMC增生抑制之间存在密切的联系，也显示了c-myc exon 2在其自身蛋白表达和细胞增殖调控中的重要地位。我们还同时观察了血管壁PCNA表达的变化。结果显示内皮损伤可以引起血管壁PCNA表达显著提高，PCNA阳性细胞极大地增多；而三种反义载体的导入可以引起血管壁中膜PCNA阳性细胞大大减少，但PCNA阳性细胞的强度却增加，而且阳性细胞数的减少与强度的增加具有对应关系：阳性细胞数越少，反应强度越高。除此之外，内膜中的PCNA反应强度比相应的中膜PCNA反应强度还要提高。这种现象的出现，有可能是局部未转染细胞的一种反馈调节作用所引起，这有待进一步的分析研究。
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四、三种反义c-myc导入对VSMC表型的影响
本实验结果表明，球囊损伤的血管中膜和内膜中的α-SM actin表达均下降，证实球囊损伤的血管壁SMC出现了表型转换和不完全的去分化现象，而且这种现象在SMC由中膜迁至内膜前已经发生。同时，我们的结果还显示反义c-myc的导入可以对抗损伤所造成的表型转换和去分化作用，而且该作用与c-myc蛋白的下调程度、血管壁增生的抑制程度相同步，就是说，能明显抑制c-myc表达的作用因素(如aM2)，不仅能明显抑制血管壁增生，而且可能明显对抗VSMC去分化和向合成型转换。
参考文献
[1]曾嵘，李进.人反义c-myc重组逆转录病毒表达载体pLNC-aM1的构建.解剖科学进展，1998，4:60-63.
[2]曾嵘，李进.人反义c-myc重组逆转录病毒表达载体pLNC-aM2和pLNC-aM3的构建.细胞与分子免疫学杂志，1998，3:103-105.
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[3]Shi Y, Fard A, Galeo A, et al. Transcatheter delivery of c-myc antisense oligomers reduces neointimal formation in a porcine model of coronary artery balloon injury. Circulation, 1994,90:944-951.
[4]Benditt EP,Benditt JM.Evidence for the monoclonal origin of human atherosclerotic plaques. PNAS, 1973,70:1753-1756.
[5]Shi Y, Fard A, Galeo A, et al. Transcatheter delivery of c-myc antisense oligomers reduces neointimal formation in a porcine model of coronary artery balloon injury. Circulation, 1994,90:944-951.
[6]Edelman ER,Simons M, Sirois MG, et al. C-myc in vasculopoliferative disease. Circ Res, 1995, 76:176-182.
[7]Bock LC, Griffin LC, Latham JA, et al. Selection of single stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature, 1992,355:564-566.
收稿日期：1998-12-20, http://www.100md.com