干细胞因子基因5′旁侧1.42 kb调控序列的PCR扩增
作者：谭运年 谭文斌 彭兴华
单位：谭运年(广东医学院附院妇产科研究室，湛江 524001)；谭文斌(湖南医科大学分子生物学研究中心，长沙 410078)；彭兴华(湖南医科大学分子生物学研究中心，长沙 410078)
关键词：干细胞因子；调控序列，核酸；聚合酶链反应
广东医学院学报000201 摘要 目的：通过PCR扩增从基因组中获得长达1.42 kb人干细胞因子基因(SCF)5’旁侧调控序列，为后续表达调控研究做准备。方法：对常规PCR缓冲液调节pH值至9.0，Taq DNA聚合酶中加入适量的具有校正功能的TliDNA聚合酶，退火温度升至68℃，加大模板量，增加模板预变性时间，进行25个循环。结果：经过改变条件，成功地获得了所需的1.42 kb的SCF调控序列片段。结论：在一般的PCR体系中添加适量的具有3’→5’外切核酸酶活性和校正功能的TliDNA聚合酶扩增稍长DNA片段是经济可行的。
, 百拇医药
【中图分类号】 Q 523 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057 (2000) 02-0119-03
Amplification of the 1.42 kb 5’ flanking regulation of the stem ce ll factor
gene using polymerase chain react ion
Tan Yunnian，Tan Wenbin，Pen X inhua
(Research Department of Obstetrics a nd Gynecology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001)
, http://www.100md.com
Abstract Objective To prepare fo r the following regulation and expressio n study of the SCF gene，a 1.42 kb 5’ flanking regulation sequence was amp lified.Methods：Normal po lymerase chain reaction (PCR) buffer pH was adju sted to 9.0，some Tli DNA polymerases which has proofreading function wer e added，annealing temperature rise t o 68℃，the amount of the genomic DNA template increased，then run 25 PCR cycles. Results：SCF 5’ f lanking regulation sequence was successf ully amp lified.Conclusion：It is a economical and effective way to amplif y longer DNA fragment after some enzymes which has 3’→5’ exonuclease activity an d proofreading function were added t o the normal PCR system.
, http://www.100md.com
Key Words stem cell fact or；regula tion sequence；polymerase chain reaction
在造血环境中干细胞因子 (SCF) 是维持其微环境，造血干细胞 的 增殖，分化的因子，SCF在生殖细胞的增殖，分化方面均起着主要作用[1]。 SC F基因的突变是否导致不孕尚未清楚[2]。对于 SCF表达调控的研究，仅在 1996年人的 SCF的5’旁侧基因序列通过筛选基因组粘粒文库的方法得到 后才开始的，要构建带有长片段的 SCF的旁侧调控序列与 SCF全长 cD NA的融合克隆载体，首先，必需得到足够长的5’调控序列，然而一般的 PC R难以得到，我们通过一些 PCR条件的改进，成功地从人基因组 DNA中得 到了长达1.42 kb的人 SCF5’旁侧调控序列。
1 材料与方法
1.1材料
, 百拇医药
1.1.1 健康成人血 取自湘雅医院中心血库。
1.1.2 试剂与酶 dNTP，PCR buffer(pH 9.0 25℃)， TaqDNA 聚合酶购自上海生工公司。琼脂糖，TliDNA聚合酶，λDN A/EcoR Ⅰ+HindⅢ Markers，Φ X174 DNA/H aeⅢ Markers 购自上海普洛麦格公司，其余均为国产分析纯试剂。
1.1.3 引物设计 引物从计算机软件上设计，上海生工合成。上游引物序列 5’CCGCTCGAGAAACGCACCGGAACTAAT TAAAGC 3’，人工设计带有一Xho Ⅰ限制性内切酶位点和三个保护性碱基 ，下游引物序 列5’ CCAAACCCACCCCTCCATCC 3’下游引物位置紧靠第一 外显子。
1.2 方法
1.2.1 人基因组 DNA的提取与纯化[3] 取0.3 mL 用枸橼酸钠 抗疑全血于 1.5 mL Eppendorf管中，加入1 mL STMT(8 0g/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCL pH 8.0，0.5 mm ol/L MgCl2，1%TritonX-100)，充分混匀，使其溶血， 12 000r/min 2min，弃上清，沉淀加 0.4 mL 154 mmol/ L NaCl洗涤一次后加入 460 μL NE 溶液 (50 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTANa2，pH 8.0)，用吸管将沉淀 吹散，加入 30 μL 100g/L SDS，迅速混匀；再加入 50 μ L 20g/L 蛋白酶K，50℃水浴 2 h，再依次用苯酚，苯酚/氯仿，氯 仿抽提，上清加入1/10水相体积的 3 mmol/L NaAC(pH 5.2) 和2.5倍无水乙醇，混匀，置-70℃冰箱 30 min，12000 r/mi n，5 min，弃上清，沉淀用体积分数为0.7的乙醇洗一次，12000 r/ min，1 min，倒去上清，真空干燥，沉淀加入 50 μL 双蒸水溶解，储 存于-20℃备用。
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1.2.2 1.42 kb SCF 5’旁侧序列的 PCR扩增 50 μL扩 增体系中含 1.0μg 人基因组 DNA，50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)，0.1% Triton X -100，0.2 mmol/L dNTPs，1.2 mmol/LMgCl2 ，扩增调控序列引物各 10p mol，向 Taq DNA 聚合酶 200 U加入 6 U Tli DNA 聚合酶后混匀，从中取相当于 Taq DNA 聚合酶 2.5 U的混合酶加入反应体系，按 95℃ 预变性 5 min，94℃ 50 s，68℃ 1 min，72℃ 2 min程序循环 25次，然后 72℃延伸 10 min。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 取 PCR 产物5 μL 在1%琼脂糖凝胶电泳， 点 λ DNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Markers 和 ф X 174 DNA/HaeⅢ Markers 做标准，5v/cm 30 min.
, 百拇医药
2 结果
如图1所示，2 号泳道介于λ DNA/EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ Markers 1 584 bp 与1 375 bp 片段之间，紧靠ф X 174 DNA/Hae Ⅲ Markers最大片段 1 353 bp 处见一明显条带， 3 号泳道扩增条件同 2号但没加 TliDNA 聚合酶，4 号泳道为本 试验随后 RT-PCR扩增的1.2 kb的 SCF 全长 cDNA。
1 λ DNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ分子量标 记
2 加Tli DNA 聚合酶 PCR产物
3 没加 Tli DNA 聚合酶 PCR 产物
4 RT-PCR c DNA产物
, 百拇医药
5 ф X 174 DNA/HaeⅢ分子量标记
图1 PCR产物1%琼脂糖胶上电泳结果
3 讨论
从 1985年 Mullis 发明 PCR 技术已来，迄今已有十几年的时 间，各种 PCR技术的发明日新月异，尽管如此，在目前的临床基因诊断与基因 结构研究中。PCR扩增的片段大部分局限在 1 kb以下，如临床上各型病毒性 肝炎、解脲支原体、沙眼衣原体及其它致病性微生物的诊断等等，大部分扩增片段 均在 600 bp以下，点突变的 SSCP 检测技术更要求在 200 bp以 下最好。在基因结构研究中，由于 Taq DNA 聚合酶本身不具有3’→5’ 外切核酸酶活性的缺限，使得它的应用受到一定的局限，随着具有3’→5外切核 酸酶的发现与使用，逐步使得大片段的 DNA 的扩增得以实现和应用。
TaqDNA 聚合酶可扩增至 2 kb的 DNA片段，但尽管如此，对于从复 杂基因组中扩增却并非易事，当前利用 PCR 扩增 DNA大片段大多局限于 3～4 kb，尽管已有一些扩增大的 PCR产物报道[4]，但对最佳条件所做 系统研究不多，尤其是从复杂基因组中扩增。国外虽有一些公司有专门试剂出售， 但价格高昂，国内经费难以承受得起，有时能够通过一些改良的办法达到试验目的， 也没有必要去购买这些专门的试剂。
, 百拇医药
目前对于 TaqDNA聚合酶难以扩增大片段的缘由认为，其主要一个原因于 TaqDNA 聚合酶缺乏3’→5’外切核酸酶活性，错配的碱基阻止了链的延 伸反应，扩增片段越大，错配机会越多，产率将越低，甚至于无产物。但如果在此 反应体系中加入适量具有校正功能的酶，利用其3’→5’外切核酸酶活性，切除 这种错配形式的碱基，使得链的延伸反应得以继续。此方式除促进 PCR成功外， 此酶的外切核酸酶活性还可减少错配。据文献报道[4]，此种酶的加入可比单用 TaqDNA 聚合酶所得产物的正确性至少高 10倍。目前已有多家公司生 产这种性质的酶，如 Tli，Deep vent，pfu，pwo等。另外， 在 pH值选择方面，有文献报道[4，5]PCR反应过程中，低 pH值可促使 DNA脱嘌呤，使链反应中止，而适度提高 pH值，阻止 DNA脱嘌呤，可 使链反应继续。
本文依上述各点，应用 pH 9.0(25℃)反应体系，添加少量 TliDN A聚合酶，Taq∶Tli为33∶1单位比。在退火温度方面，本文从55～7 2℃均做了比较，结果发现从 55℃开始至 62℃，在琼脂糖胶上预定的扩增 的区带呈抹片形式，至 65℃有较明显的非特异性区带，至 68℃扩增效果好， 为单一非特异性区带，68℃ 以上非特异性条带多，与文献报道一致[5]，退 火温度如此之高，究其原因可能与模板变性有关，这亦是反应开始增加模板预变性 时间的原因，其它原因仍然不清楚。
, http://www.100md.com
PCR应用具有校正功能的 DNA聚合酶是 PCR技术发展的一大趋势，它 的应用不但能促使PCR的成功，提高产量，且能提高产物的特异性，对于后续 正确克隆的筛选等分子生物学操作相当有益。在目前这些酶还未普及的情况下，本 文的方法在一般的 PCR 体系中添加适量的具有校正功能的 DNA 聚合酶 扩增稍长DNA片段证明是非常经济有效的。
基金项目：国家自然科学基金项目资助(NO.39700050)
作者简介：谭运年，男，1968年7月出生，医学硕士，助教
参考文献
[1] Anderson DM，Lyman SD，Baird A，e t al.Molecular cloning of mast cell gr owth factor，a hematopoietin that is active in both membrane bound and so luble forms.Cell，1990，63：235～243
, http://www.100md.com
[2] Bedell MA，Brannan CI，Evans EP，et al.DNA rearrangements located over 100 kb 5’ of the steel(sl)-coding reg ion in steel-panda and steel-contras ted mice deregulate SL expression an d cause female sterility by disrupti ng ovarian follicle development.Gene s Dev，1995，9：455～470
[3] 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，199 3.103～104
[4] Cheng S，Fockler C，Barnes WM，et al.Effective amplification of long t argets from cloned inserts and human genomic DNA.Proc Natl Acad Sci USA， 1994，91：5695～5699
[5] Barnes WM.PCR anplification of u p to 35-kb DNA with high fidelity an d high yield from Lamda bacteriophag e templates.Proc Natl Acad Sci USA，1 994，91：2216～2220
收稿日期：1999-09-18；修订日期：1999-12-26, 百拇医药
单位：谭运年(广东医学院附院妇产科研究室，湛江 524001)；谭文斌(湖南医科大学分子生物学研究中心，长沙 410078)；彭兴华(湖南医科大学分子生物学研究中心，长沙 410078)
关键词：干细胞因子；调控序列，核酸；聚合酶链反应
广东医学院学报000201 摘要 目的：通过PCR扩增从基因组中获得长达1.42 kb人干细胞因子基因(SCF)5’旁侧调控序列，为后续表达调控研究做准备。方法：对常规PCR缓冲液调节pH值至9.0，Taq DNA聚合酶中加入适量的具有校正功能的TliDNA聚合酶，退火温度升至68℃，加大模板量，增加模板预变性时间，进行25个循环。结果：经过改变条件，成功地获得了所需的1.42 kb的SCF调控序列片段。结论：在一般的PCR体系中添加适量的具有3’→5’外切核酸酶活性和校正功能的TliDNA聚合酶扩增稍长DNA片段是经济可行的。
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【中图分类号】 Q 523 【文献标识码】 A
文章编号：1005-4057 (2000) 02-0119-03
Amplification of the 1.42 kb 5’ flanking regulation of the stem ce ll factor
gene using polymerase chain react ion
Tan Yunnian，Tan Wenbin，Pen X inhua
(Research Department of Obstetrics a nd Gynecology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001)
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Abstract Objective To prepare fo r the following regulation and expressio n study of the SCF gene，a 1.42 kb 5’ flanking regulation sequence was amp lified.Methods：Normal po lymerase chain reaction (PCR) buffer pH was adju sted to 9.0，some Tli DNA polymerases which has proofreading function wer e added，annealing temperature rise t o 68℃，the amount of the genomic DNA template increased，then run 25 PCR cycles. Results：SCF 5’ f lanking regulation sequence was successf ully amp lified.Conclusion：It is a economical and effective way to amplif y longer DNA fragment after some enzymes which has 3’→5’ exonuclease activity an d proofreading function were added t o the normal PCR system.
, http://www.100md.com
Key Words stem cell fact or；regula tion sequence；polymerase chain reaction
在造血环境中干细胞因子 (SCF) 是维持其微环境，造血干细胞 的 增殖，分化的因子，SCF在生殖细胞的增殖，分化方面均起着主要作用[1]。 SC F基因的突变是否导致不孕尚未清楚[2]。对于 SCF表达调控的研究，仅在 1996年人的 SCF的5’旁侧基因序列通过筛选基因组粘粒文库的方法得到 后才开始的，要构建带有长片段的 SCF的旁侧调控序列与 SCF全长 cD NA的融合克隆载体，首先，必需得到足够长的5’调控序列，然而一般的 PC R难以得到，我们通过一些 PCR条件的改进，成功地从人基因组 DNA中得 到了长达1.42 kb的人 SCF5’旁侧调控序列。
1 材料与方法
1.1材料
, 百拇医药
1.1.1 健康成人血 取自湘雅医院中心血库。
1.1.2 试剂与酶 dNTP，PCR buffer(pH 9.0 25℃)， TaqDNA 聚合酶购自上海生工公司。琼脂糖，TliDNA聚合酶，λDN A/EcoR Ⅰ+HindⅢ Markers，Φ X174 DNA/H aeⅢ Markers 购自上海普洛麦格公司，其余均为国产分析纯试剂。
1.1.3 引物设计 引物从计算机软件上设计，上海生工合成。上游引物序列 5’CCGCTCGAGAAACGCACCGGAACTAAT TAAAGC 3’，人工设计带有一Xho Ⅰ限制性内切酶位点和三个保护性碱基 ，下游引物序 列5’ CCAAACCCACCCCTCCATCC 3’下游引物位置紧靠第一 外显子。
1.2 方法
1.2.1 人基因组 DNA的提取与纯化[3] 取0.3 mL 用枸橼酸钠 抗疑全血于 1.5 mL Eppendorf管中，加入1 mL STMT(8 0g/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCL pH 8.0，0.5 mm ol/L MgCl2，1%TritonX-100)，充分混匀，使其溶血， 12 000r/min 2min，弃上清，沉淀加 0.4 mL 154 mmol/ L NaCl洗涤一次后加入 460 μL NE 溶液 (50 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTANa2，pH 8.0)，用吸管将沉淀 吹散，加入 30 μL 100g/L SDS，迅速混匀；再加入 50 μ L 20g/L 蛋白酶K，50℃水浴 2 h，再依次用苯酚，苯酚/氯仿，氯 仿抽提，上清加入1/10水相体积的 3 mmol/L NaAC(pH 5.2) 和2.5倍无水乙醇，混匀，置-70℃冰箱 30 min，12000 r/mi n，5 min，弃上清，沉淀用体积分数为0.7的乙醇洗一次，12000 r/ min，1 min，倒去上清，真空干燥，沉淀加入 50 μL 双蒸水溶解，储 存于-20℃备用。
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1.2.2 1.42 kb SCF 5’旁侧序列的 PCR扩增 50 μL扩 增体系中含 1.0μg 人基因组 DNA，50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)，0.1% Triton X -100，0.2 mmol/L dNTPs，1.2 mmol/LMgCl2 ，扩增调控序列引物各 10p mol，向 Taq DNA 聚合酶 200 U加入 6 U Tli DNA 聚合酶后混匀，从中取相当于 Taq DNA 聚合酶 2.5 U的混合酶加入反应体系，按 95℃ 预变性 5 min，94℃ 50 s，68℃ 1 min，72℃ 2 min程序循环 25次，然后 72℃延伸 10 min。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 取 PCR 产物5 μL 在1%琼脂糖凝胶电泳， 点 λ DNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ Markers 和 ф X 174 DNA/HaeⅢ Markers 做标准，5v/cm 30 min.
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2 结果
如图1所示，2 号泳道介于λ DNA/EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ Markers 1 584 bp 与1 375 bp 片段之间，紧靠ф X 174 DNA/Hae Ⅲ Markers最大片段 1 353 bp 处见一明显条带， 3 号泳道扩增条件同 2号但没加 TliDNA 聚合酶，4 号泳道为本 试验随后 RT-PCR扩增的1.2 kb的 SCF 全长 cDNA。
1 λ DNA/EcoR Ⅰ+Hind Ⅲ分子量标 记
2 加Tli DNA 聚合酶 PCR产物
3 没加 Tli DNA 聚合酶 PCR 产物
4 RT-PCR c DNA产物
, 百拇医药
5 ф X 174 DNA/HaeⅢ分子量标记
图1 PCR产物1%琼脂糖胶上电泳结果
3 讨论
从 1985年 Mullis 发明 PCR 技术已来，迄今已有十几年的时 间，各种 PCR技术的发明日新月异，尽管如此，在目前的临床基因诊断与基因 结构研究中。PCR扩增的片段大部分局限在 1 kb以下，如临床上各型病毒性 肝炎、解脲支原体、沙眼衣原体及其它致病性微生物的诊断等等，大部分扩增片段 均在 600 bp以下，点突变的 SSCP 检测技术更要求在 200 bp以 下最好。在基因结构研究中，由于 Taq DNA 聚合酶本身不具有3’→5’ 外切核酸酶活性的缺限，使得它的应用受到一定的局限，随着具有3’→5外切核 酸酶的发现与使用，逐步使得大片段的 DNA 的扩增得以实现和应用。
TaqDNA 聚合酶可扩增至 2 kb的 DNA片段，但尽管如此，对于从复 杂基因组中扩增却并非易事，当前利用 PCR 扩增 DNA大片段大多局限于 3～4 kb，尽管已有一些扩增大的 PCR产物报道[4]，但对最佳条件所做 系统研究不多，尤其是从复杂基因组中扩增。国外虽有一些公司有专门试剂出售， 但价格高昂，国内经费难以承受得起，有时能够通过一些改良的办法达到试验目的， 也没有必要去购买这些专门的试剂。
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目前对于 TaqDNA聚合酶难以扩增大片段的缘由认为，其主要一个原因于 TaqDNA 聚合酶缺乏3’→5’外切核酸酶活性，错配的碱基阻止了链的延 伸反应，扩增片段越大，错配机会越多，产率将越低，甚至于无产物。但如果在此 反应体系中加入适量具有校正功能的酶，利用其3’→5’外切核酸酶活性，切除 这种错配形式的碱基，使得链的延伸反应得以继续。此方式除促进 PCR成功外， 此酶的外切核酸酶活性还可减少错配。据文献报道[4]，此种酶的加入可比单用 TaqDNA 聚合酶所得产物的正确性至少高 10倍。目前已有多家公司生 产这种性质的酶，如 Tli，Deep vent，pfu，pwo等。另外， 在 pH值选择方面，有文献报道[4，5]PCR反应过程中，低 pH值可促使 DNA脱嘌呤，使链反应中止，而适度提高 pH值，阻止 DNA脱嘌呤，可 使链反应继续。
本文依上述各点，应用 pH 9.0(25℃)反应体系，添加少量 TliDN A聚合酶，Taq∶Tli为33∶1单位比。在退火温度方面，本文从55～7 2℃均做了比较，结果发现从 55℃开始至 62℃，在琼脂糖胶上预定的扩增 的区带呈抹片形式，至 65℃有较明显的非特异性区带，至 68℃扩增效果好， 为单一非特异性区带，68℃ 以上非特异性条带多，与文献报道一致[5]，退 火温度如此之高，究其原因可能与模板变性有关，这亦是反应开始增加模板预变性 时间的原因，其它原因仍然不清楚。
, http://www.100md.com
PCR应用具有校正功能的 DNA聚合酶是 PCR技术发展的一大趋势，它 的应用不但能促使PCR的成功，提高产量，且能提高产物的特异性，对于后续 正确克隆的筛选等分子生物学操作相当有益。在目前这些酶还未普及的情况下，本 文的方法在一般的 PCR 体系中添加适量的具有校正功能的 DNA 聚合酶 扩增稍长DNA片段证明是非常经济有效的。
基金项目：国家自然科学基金项目资助(NO.39700050)
作者简介：谭运年，男，1968年7月出生，医学硕士，助教
参考文献
[1] Anderson DM，Lyman SD，Baird A，e t al.Molecular cloning of mast cell gr owth factor，a hematopoietin that is active in both membrane bound and so luble forms.Cell，1990，63：235～243
, http://www.100md.com
[2] Bedell MA，Brannan CI，Evans EP，et al.DNA rearrangements located over 100 kb 5’ of the steel(sl)-coding reg ion in steel-panda and steel-contras ted mice deregulate SL expression an d cause female sterility by disrupti ng ovarian follicle development.Gene s Dev，1995，9：455～470
[3] 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，199 3.103～104
[4] Cheng S，Fockler C，Barnes WM，et al.Effective amplification of long t argets from cloned inserts and human genomic DNA.Proc Natl Acad Sci USA， 1994，91：5695～5699
[5] Barnes WM.PCR anplification of u p to 35-kb DNA with high fidelity an d high yield from Lamda bacteriophag e templates.Proc Natl Acad Sci USA，1 994，91：2216～2220
收稿日期：1999-09-18；修订日期：1999-12-26, 百拇医药