毒性T细胞相关抗原4对体外淋巴细胞及骨上清液刺激增殖的影响
作者：郭传友 戴克戎 汤亭亭
单位：(200011 上海第二医科大学第九人民医院骨科)
关键词：
中华医学杂志000228 目前，器官移植的最大障碍是免疫排斥，移植抗原通过双信号、双识别启动了宿主的免疫系统而产生免疫排斥。其中第一信号是移植抗原与T细胞受体的结合，第二信号是B7与CD28/CTLA4的结合，若只有第一信号，而第二信号被阻断时，则出现T细胞的无能或凋亡， 无免疫排斥发生。毒性T细胞相关抗原4(CTLA4 )是 T 细胞激活的抑制性信号，国外已合成了CTLA4的可溶性分子─CTLA4-Ig，通过阻断B7/CD28的结合，成功地诱导了啮齿类动物器官移植的免疫耐受[1]，但在骨移植方面的研究还少见报道。我们设想，CTLA4-Ig对于免疫原性较低的骨移植来说， 应该更易成功。为此，我们首先观察了CTLA4-Ig对体外培养的淋巴细胞或骨上清液刺激受体淋巴细胞增殖的影响，以此直接反映CTLA4-Ig的免疫抑制能力，现报道如下。
, 百拇医药
一、 材料与方法
1.本实验采用经典的混合淋巴细胞培养和孙磊等[2]采用的骨匀浆上清与淋巴细胞混合培养的方法，研究CTLA4-Ig及对照品L6(免疫球蛋白Cγ1 Fc段的蛋白分子，与CTLA4Ig中的Ig结构相同。皆由美国 Linsley教授馈赠) 的免疫抑制作用。
2.小鼠脾淋巴细胞的分离：在无菌条件下，杀死动物取出脾脏，剪碎，过滤血网，用比重为1.088的Ficoll分离液分离、计数，调整细胞浓度。通过预实验确定刺激细胞浓度为2×106/ml，反应细胞浓度为4×106/ml，刺激细胞经60Co 3 000 rad照射，以消除其有丝分裂能力。
3.骨匀浆上清液的制备：取1只C57BL/6小鼠的双后肢骨， 去除软组织及骨髓，剪碎，置入匀浆器内，研磨成匀浆，加培养液12 ml，混匀后静止沉降1 h，取其上清液，即为骨匀浆上清液。
, 百拇医药
4.混合淋巴细胞培养：反应细胞为BALB/C小鼠脾淋巴细胞， 刺激细胞为C57BL/6小鼠脾淋巴细胞，置96孔培养板， 每孔加入反应细胞和刺激细胞各100μl。每只BALB/C小鼠分设6组： (1) 反应细胞+RPMI1640，简称 B+1640；(2)反应细胞+刺激细胞，简称B+C； (3)反应细胞+刺激细胞+L6(20 μg/ml)，简称B+C+L6(20)；(4)反应细胞+刺激细胞+CTLA4-Ig(5 μg/ml)，简称B+C+CTLA4-Ig(5)；(5)反应细胞+ 刺激细胞+CTLA4-Ig(10 μg/ml)，简称B+C+CTLA4-Ig(10)；(6)反应细胞+刺激细胞+CTLA4-Ig(20 μg/ml)，简称B+C+CTLA4-Ig(20)，每组重复4孔，取其均值，实验结果为5只BALB/C小鼠的均值±标准差。在37℃，5% CO2条件下培养5天。然后每孔加入37GBq3H-TdR(3H-胸腺核苷)，再培养16 h，收集每孔细胞于玻璃纤维滤纸上，烘干后放入闪烁瓶，加闪烁液1 ml，在Beckman-9 000型液闪计数器上测得3H-TdR掺入率。
, 百拇医药
5.骨匀浆上清液与淋巴细胞混合培养：将上述刺激细胞换成骨匀浆上清液100 μl(简称C上)，分组及测定方法同上。
6.另设B+C+CTLA4-Ig 20 μg/ml处理组，于培养第1、2、3d分别用锥蓝染色鉴别细胞存活情况。
二、结果
1.CTLA4-Ig对淋巴细胞刺激增殖的影响见表1。在混合淋巴细胞培养中，C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞明显刺激了BALB/C 小鼠脾淋巴细胞增殖(P<0.01)，加入对照品L6对淋巴细胞增殖影响不大(P>0.05)，加入CTLA4-Ig后，不论是5、10、20 μg/ml，都明显抑制了淋巴细胞增殖(P<0.001)，以20μg/ml较为明显，显示轻度浓度依赖性。
表1 CTLA4-Ig对小鼠淋巴细胞及骨上清液刺激增殖的影响 组别
, 百拇医药
3H-TdR
掺入率
骨上清液刺激
3H-TdR
掺入率
B+1640
7 639±
2 056
B+C
13 807±
3 021
B+C上
, 百拇医药
6 472±
1 775
B+C+L6
14 061±
2 960
B+C上+L6
6 800±
1 968
B+C+CTLA4-Ig(5)
1 427±
400
B+C上+CTLA4-Ig(5)
, 百拇医药
702±
153
B+C+CTLA4-Ig(10)
1 263±
342
B+C上+CTLA4-Ig(10)
786±
165
B+C+CTLA4-Ig(20)
1 092±
341
B+C上+CTLA4-Ig(20)
, 百拇医药
924±
153
注：B为反应细胞；1640为RPMI1640；C为刺激细胞；L6为CTLA4-Ig的对照品
2. CTLA4-Ig对骨上清液刺激细胞增殖的影响,结果见表1。C57BL/6小鼠骨匀浆上清液刺激BALB/C小鼠淋巴细胞增殖的作用不明显，3H-TdR掺入率与B+1640组基本相同(P>0.05)，加入对照品L6对淋巴细胞增殖无显著影响(P>0.05)，但加入CTLA4-Ig后仍然明显抑制了淋巴细胞增殖(P<0.001)，不同浓度间差异无显著意义(P>0.05)。
3.锥蓝染色显示，当以20 μg/ml CTLA4-Ig加入混合淋巴细胞培养体系时，95%以上的细胞均存活，说明CTLA4-Ig 只是抑制淋巴细胞增殖，无毒性细胞杀伤作用。
, 百拇医药
三、讨论
骨移植免疫排斥问题尚未解决，目前各种移植骨预处理的方法，虽然降低了移植骨的免疫原性，但也使其骨诱导能力丧失，导致移植骨愈合延迟。全身使用免疫抑制剂，虽能提高移植骨的愈合能力，但在骨移植中并不适用。 因此如何既有效降低骨移植免疫排斥反应，又不降低机体正常免疫功能，并充分保留移植骨的生物学功能和力学强度，是临床实践中难以兼顾的问题。 至今为止，尚未有将CTLA4应用于骨移植的报道，我们的观察发现，在不同品系的两小鼠间，混合淋巴细胞培养显示出明显的刺激增殖效应(P<0.01)，当加入CTLA4-Ig后，不论是淋巴细胞或骨匀浆上清液刺激的淋巴细胞增殖，均可被CTLA4-Ig抑制，差异有显著意义(P<0.001)，且随CTLA4-Ig浓度的增加，其抑制作用愈加明显，文献报道的结果也显示了这种浓度依赖性，即剂量越大，越易诱导免疫耐受[3]，锥蓝染色表明这种抑制不是细胞毒性作用的结果。对照品L6是一种免疫球蛋白，实验显示其对细胞增殖无影响，说明CTLA4-Ig 的效应不是Ig 而是CTLA4作用的结果，这与国外学者的实验结果一致[4]。实验观察显示CTLA4-Ig不仅抑制了同种异体间的淋巴细胞的增殖，对骨上清液刺激增殖的抑制效应也非常明显。这表明CTLA4-Ig能够阻断骨组织抗原刺激的细胞免疫反应，这就为我们进行CTLA4-Ig诱导骨移植免疫耐受的研究奠定了基础。本研究结果还提示，CTLA4-Ig在诱导啮齿类动物器官移植免疫耐受方面的研究，有希望从根本上解决人类器官移植免疫排异问题。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670725)
参考文献
[1]Lenschow DJ,Zeng Y,Thistlethwaite JR,et al. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4Ig. Science, 1992, 257: 789-792.
[2]孙磊，粱吉，王利群，等.不同处理的同种异体骨对体外淋巴细胞增殖的影响，中华骨科杂志，1998,18:30-32.
[3]Tepper MA, Linsley PS, Tritschler D, et al. Tolerance induction by soluble CTLA4 in a mouse skin transplant model, Transplant Proc, 1994, 26: 3151-3154.
[4]Malsumura Y, Zuo XJ, Prehn J, et al. Soluble CTLA4- Ig modifies parameters of acute inflammation in rat lung allograft rejection without altering lymphocytic infiltration or transcription of key cytokines. Transplantation, 1995, 59:551-558.
收稿日期：1999-02-14, http://www.100md.com
单位：(200011 上海第二医科大学第九人民医院骨科)
关键词：
中华医学杂志000228 目前，器官移植的最大障碍是免疫排斥，移植抗原通过双信号、双识别启动了宿主的免疫系统而产生免疫排斥。其中第一信号是移植抗原与T细胞受体的结合，第二信号是B7与CD28/CTLA4的结合，若只有第一信号，而第二信号被阻断时，则出现T细胞的无能或凋亡， 无免疫排斥发生。毒性T细胞相关抗原4(CTLA4 )是 T 细胞激活的抑制性信号，国外已合成了CTLA4的可溶性分子─CTLA4-Ig，通过阻断B7/CD28的结合，成功地诱导了啮齿类动物器官移植的免疫耐受[1]，但在骨移植方面的研究还少见报道。我们设想，CTLA4-Ig对于免疫原性较低的骨移植来说， 应该更易成功。为此，我们首先观察了CTLA4-Ig对体外培养的淋巴细胞或骨上清液刺激受体淋巴细胞增殖的影响，以此直接反映CTLA4-Ig的免疫抑制能力，现报道如下。
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一、 材料与方法
1.本实验采用经典的混合淋巴细胞培养和孙磊等[2]采用的骨匀浆上清与淋巴细胞混合培养的方法，研究CTLA4-Ig及对照品L6(免疫球蛋白Cγ1 Fc段的蛋白分子，与CTLA4Ig中的Ig结构相同。皆由美国 Linsley教授馈赠) 的免疫抑制作用。
2.小鼠脾淋巴细胞的分离：在无菌条件下，杀死动物取出脾脏，剪碎，过滤血网，用比重为1.088的Ficoll分离液分离、计数，调整细胞浓度。通过预实验确定刺激细胞浓度为2×106/ml，反应细胞浓度为4×106/ml，刺激细胞经60Co 3 000 rad照射，以消除其有丝分裂能力。
3.骨匀浆上清液的制备：取1只C57BL/6小鼠的双后肢骨， 去除软组织及骨髓，剪碎，置入匀浆器内，研磨成匀浆，加培养液12 ml，混匀后静止沉降1 h，取其上清液，即为骨匀浆上清液。
, 百拇医药
4.混合淋巴细胞培养：反应细胞为BALB/C小鼠脾淋巴细胞， 刺激细胞为C57BL/6小鼠脾淋巴细胞，置96孔培养板， 每孔加入反应细胞和刺激细胞各100μl。每只BALB/C小鼠分设6组： (1) 反应细胞+RPMI1640，简称 B+1640；(2)反应细胞+刺激细胞，简称B+C； (3)反应细胞+刺激细胞+L6(20 μg/ml)，简称B+C+L6(20)；(4)反应细胞+刺激细胞+CTLA4-Ig(5 μg/ml)，简称B+C+CTLA4-Ig(5)；(5)反应细胞+ 刺激细胞+CTLA4-Ig(10 μg/ml)，简称B+C+CTLA4-Ig(10)；(6)反应细胞+刺激细胞+CTLA4-Ig(20 μg/ml)，简称B+C+CTLA4-Ig(20)，每组重复4孔，取其均值，实验结果为5只BALB/C小鼠的均值±标准差。在37℃，5% CO2条件下培养5天。然后每孔加入37GBq3H-TdR(3H-胸腺核苷)，再培养16 h，收集每孔细胞于玻璃纤维滤纸上，烘干后放入闪烁瓶，加闪烁液1 ml，在Beckman-9 000型液闪计数器上测得3H-TdR掺入率。
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5.骨匀浆上清液与淋巴细胞混合培养：将上述刺激细胞换成骨匀浆上清液100 μl(简称C上)，分组及测定方法同上。
6.另设B+C+CTLA4-Ig 20 μg/ml处理组，于培养第1、2、3d分别用锥蓝染色鉴别细胞存活情况。
二、结果
1.CTLA4-Ig对淋巴细胞刺激增殖的影响见表1。在混合淋巴细胞培养中，C57BL/6小鼠的脾淋巴细胞明显刺激了BALB/C 小鼠脾淋巴细胞增殖(P<0.01)，加入对照品L6对淋巴细胞增殖影响不大(P>0.05)，加入CTLA4-Ig后，不论是5、10、20 μg/ml，都明显抑制了淋巴细胞增殖(P<0.001)，以20μg/ml较为明显，显示轻度浓度依赖性。
表1 CTLA4-Ig对小鼠淋巴细胞及骨上清液刺激增殖的影响 组别
, 百拇医药
3H-TdR
掺入率
骨上清液刺激
3H-TdR
掺入率
B+1640
7 639±
2 056
B+C
13 807±
3 021
B+C上
, 百拇医药
6 472±
1 775
B+C+L6
14 061±
2 960
B+C上+L6
6 800±
1 968
B+C+CTLA4-Ig(5)
1 427±
400
B+C上+CTLA4-Ig(5)
, 百拇医药
702±
153
B+C+CTLA4-Ig(10)
1 263±
342
B+C上+CTLA4-Ig(10)
786±
165
B+C+CTLA4-Ig(20)
1 092±
341
B+C上+CTLA4-Ig(20)
, 百拇医药
924±
153
注：B为反应细胞；1640为RPMI1640；C为刺激细胞；L6为CTLA4-Ig的对照品
2. CTLA4-Ig对骨上清液刺激细胞增殖的影响,结果见表1。C57BL/6小鼠骨匀浆上清液刺激BALB/C小鼠淋巴细胞增殖的作用不明显，3H-TdR掺入率与B+1640组基本相同(P>0.05)，加入对照品L6对淋巴细胞增殖无显著影响(P>0.05)，但加入CTLA4-Ig后仍然明显抑制了淋巴细胞增殖(P<0.001)，不同浓度间差异无显著意义(P>0.05)。
3.锥蓝染色显示，当以20 μg/ml CTLA4-Ig加入混合淋巴细胞培养体系时，95%以上的细胞均存活，说明CTLA4-Ig 只是抑制淋巴细胞增殖，无毒性细胞杀伤作用。
, 百拇医药
三、讨论
骨移植免疫排斥问题尚未解决，目前各种移植骨预处理的方法，虽然降低了移植骨的免疫原性，但也使其骨诱导能力丧失，导致移植骨愈合延迟。全身使用免疫抑制剂，虽能提高移植骨的愈合能力，但在骨移植中并不适用。 因此如何既有效降低骨移植免疫排斥反应，又不降低机体正常免疫功能，并充分保留移植骨的生物学功能和力学强度，是临床实践中难以兼顾的问题。 至今为止，尚未有将CTLA4应用于骨移植的报道，我们的观察发现，在不同品系的两小鼠间，混合淋巴细胞培养显示出明显的刺激增殖效应(P<0.01)，当加入CTLA4-Ig后，不论是淋巴细胞或骨匀浆上清液刺激的淋巴细胞增殖，均可被CTLA4-Ig抑制，差异有显著意义(P<0.001)，且随CTLA4-Ig浓度的增加，其抑制作用愈加明显，文献报道的结果也显示了这种浓度依赖性，即剂量越大，越易诱导免疫耐受[3]，锥蓝染色表明这种抑制不是细胞毒性作用的结果。对照品L6是一种免疫球蛋白，实验显示其对细胞增殖无影响，说明CTLA4-Ig 的效应不是Ig 而是CTLA4作用的结果，这与国外学者的实验结果一致[4]。实验观察显示CTLA4-Ig不仅抑制了同种异体间的淋巴细胞的增殖，对骨上清液刺激增殖的抑制效应也非常明显。这表明CTLA4-Ig能够阻断骨组织抗原刺激的细胞免疫反应，这就为我们进行CTLA4-Ig诱导骨移植免疫耐受的研究奠定了基础。本研究结果还提示，CTLA4-Ig在诱导啮齿类动物器官移植免疫耐受方面的研究，有希望从根本上解决人类器官移植免疫排异问题。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670725)
参考文献
[1]Lenschow DJ,Zeng Y,Thistlethwaite JR,et al. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4Ig. Science, 1992, 257: 789-792.
[2]孙磊，粱吉，王利群，等.不同处理的同种异体骨对体外淋巴细胞增殖的影响，中华骨科杂志，1998,18:30-32.
[3]Tepper MA, Linsley PS, Tritschler D, et al. Tolerance induction by soluble CTLA4 in a mouse skin transplant model, Transplant Proc, 1994, 26: 3151-3154.
[4]Malsumura Y, Zuo XJ, Prehn J, et al. Soluble CTLA4- Ig modifies parameters of acute inflammation in rat lung allograft rejection without altering lymphocytic infiltration or transcription of key cytokines. Transplantation, 1995, 59:551-558.
收稿日期：1999-02-14, http://www.100md.com