钝顶螺旋藻多糖对白血病患者外周血LAK细胞活性的影响
作者：曾波航 王光明 曾亚仑
单位：曾波航 王光明 王光明 曾亚仑(广州医学院第二附属医院肿瘤科，510260)；曾亚仑(广州白云山中药厂，广州 510515)
关键词：螺旋藻多糖，LAK细胞，白血病
中国海洋药物000213 摘要 目的：了解钝顶螺旋藻多糖(SPP)对正常人和白血病患者LAK细胞活性作用，探讨螺旋藻作用机理。方法：以Raji细胞(人B细胞白血病细胞株)为靶细胞，用3H-TdR渗入法检测LAK细胞活性。结果：白血病病人LAK细胞活性降低；SPP可增强正常人和病人LAK细胞活性，且对正常人LAK细胞活性增强作用大于病人。结论：SPP可刺激LAK细胞活性，减少rIL-2用量。
EFFECT OF SPIRULINA PATENSIS POLYSACCHARIDE ON THE ACTIBITIES OF LAK CELL OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELL IN PATIENTS WITH LEUKEMIA.
, http://www.100md.com
Zeng Bohang,Wang Guangming,Zeng Yalun
(Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College,Guang Zhao 510260)
ABSTRACT Objective:The effects of spirulina patensis polysaccharide(SPP)on the activities of lymphokine-activited killer(LAK)cell from normal individuals and patients with leukemia were comparized.Mechanism of SPPs immunological effection was studied.Methods:With Raji cells being target cell,LAK cell activity was determined by 3H-TdR release assay.Results:LAK cell activity was lower in patients with leukemia than in normal individuals.SPP could increase LAK cell activity both normal individuals and patients with leukemia.It was higher LAK cell activity after adding SPP in normal individuals than patients with leukemia.Conclusion:SPP is able to stimulate LAK cell activity and to decrease rIL-2 quantity in LAK cell activation.
, 百拇医药
KEY WORD Polysaccaried of spirulina platensis(SPP), LAK cell,Leukemia.
淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)对肿瘤细胞有杀伤作用，已被用于临床治疗多种恶性肿瘤，并取得一定疗效，但由于白细胞介素-2(IL-2)用量过大、费用高、副作用大等限制了IL-2/LAK细胞临床应用。因此，寻找能提高LAK细胞活性，降低IL-2用量的药物，特别是从生药及有效成分中发现此类物质成为肿瘤生物治疗学的一个热点。本文用钝顶螺旋藻多糖(SPP)观察其对正常人和白血病病人外周血LAK细胞作用，探讨钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)提高免疫功能的作用机理。现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 实验对象 23例白血病人为我院住院患者，男性13例，女性10例，年龄15～75岁，中位年龄40岁，所有患者经临床和骨髓细胞学确诊，所有病人近3周未用免疫抑制剂及免疫增强药物。
, http://www.100md.com
1.2 对照组 为门诊健康体检者，男性15例，女性10例，年龄18～72岁，中位年龄42岁。
1.3 方法
1.3.1 LAK细胞活化，取肝素抗凝静脉血3～5ml，用淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞，配成1×109/L。根据实验要求，分别加入重组人白细胞介素-2rIL-2(沈阳三生药厂)1×106μ、5×105μ、2.5×105μ/L和SPP(分子量约21950，由南京大学张成武教授惠赠)(对照组加等量1640培养液)、5%CO2、37℃，培养96h，诱导LAK细胞，收集细胞，洗涤3次后，配成2×109/L即为待测活化LAK细胞，台盼兰染色计数活细胞>95%。
1.3.2 LAK细胞体外扩增，取外周血单个核细胞调整浓度为1×109/L，加入24孔培养板中，1ml/孔，分成SPP组、rIL-2组、SPP+rIL-2组及对照组(1640液作对照)，每组设3个复孔，3天换液一次，隔日进行细胞计数。
, 百拇医药
1.3.3 LAK细胞活性测定：取Riji细胞作为LAK细胞的靶细胞，在96孔板中每孔加入1×108/L LAK细胞(效：靶为20：1)，对照组加等量1640液，每孔设3个复孔，振荡混匀后，37℃、5%CO2中孵育20h，终止培养时，每孔加入50μl胰酶和DNA酶溶液(终浓度分别为0.15%和0.025%)，处理30分种后收集细胞，烘干滤纸，γ-液闪仪测每孔1min CPM(CPM：计数/分钟)
1.4 数据处理：用t检验和方差分析，判断各组间有无差异显著性。
2 结果
2.1 病人与正常人LAK活性及受SPP影响
从表1中可知：不同浓度rIL-2诱导病人LAK活性均低于正常人LAK活性。
, http://www.100md.com
表1 rIL-2浓度与LAK活性
n
rIL-2浓度
1×106μ/L
5×105μ/L
2.5×105μ/L
正常人
病人
25
23
46.8±8.5
35.3±10.7*
, 百拇医药
32.6±10.2
25.6±8.3*
20.6±9.4
16.7±9.3*
*与正常人相比较P<0.01
2.2 SPP对不同浓度rIL-2诱导LAK活性的影响
从表2可知，加入SPP(10μg/ml)后，正常人LAK活性在rIL-2浓度为1×106μ/L、5×105μ/L和2.5×105μ/L时，分别提高22.4%、37.7%和44.7%(P均<0.01)，当加入SPP在rIL-2浓度为5×105μ/L、2.5×105μ/L时，加入SPP，LAK活性的提高比rIL-2浓度为1×106μ/L时增高(P<0.05)，提示SPP可提高正常人LAK活性并减少rIL-2用量，其作用在rIL-2为低浓度时尤为显著。
, http://www.100md.com
2.3 SPP对病人在不同浓度rIL-2时对LAK细胞活性的影响
表2 SPP(10μg/ml)对正常人不同浓度rIL-2诱导LAK活性的作用
rIL-2浓度(μ/L)
1×106
5×105
2.5×105
正常人
加SPP组
46.8±8.5
57.3±9.1*
, http://www.100md.com
32.6±10.2
44.9±7.8*
20.6±9.4
29.8±10.6*
*与正常人相比较*P<0.01表3 SPP对病人不同rIL-2浓度时对LAK细胞的影响
RIL-2浓度(u/L)
1×106
5×105
2.5×105
病人组
, 百拇医药
病人加SPP组
35.3±10.7
40.5±7.9*
25.6±8.3
32.4±9.5*
16.7±9.3
21.8±10.3*
*与病人未加SPP组相比P<0.05
病人组加入SPP(10μg/ml)后，LAK活性在rIL-2浓度为1×106u/L、5×105u/L和2.5×105u/L 分别提高15.3%、26.6%和30.5%(P<0.05)，与正常人提高幅度相比差异有显著性(P均<0.05)(表4)。提示SPP也可提高患者LAK细胞活性，但增高的幅度低于正常人。
, http://www.100md.com
表4 SPP对正常人与病人LAK细胞的影响
rIL-2浓度(μ/L)
1×106
5×105
2.5×105
正常人
病人
22.4%
15.3%*
33.7%
26.6%*
, 百拇医药
44.7%
30.5%**
与正常人相比较*P<0.05，与正常人相比较**P<0.01。
2.4 SPP对LAK细胞扩增的影响
SPP(10μg/ml)单独培养单个核细胞至第8天，细胞多数已死亡，而rIL-2(5×105μ/L)组培养第6d略有减少，以后开始扩增，到第15d时可增加至180%，SPP(10μg/ml)和rIL-2(5×105μ/L)联合组LAK细胞数量与rIL-2组LAK细胞数量无明显差异。
3 讨论
曹广文等[1]发现黄芪多糖、刺五加多糖和枸杞子多糖在体外均能明显提高LAK细胞活性(分别为80%、60%和52%)，储大同等[2]则用黄芪F3在体外与低剂量的rIL-2(5×105u/L)合用，发现LAK活性是单用rIL-2的2.3倍与高剂量(106/ml)所产生的LAK活性相同，我们用SPP(10μg/ml)加入不同浓度的rIL-2诱导LAK细胞的培养体系中，显示SPP可提高正常人LAK细胞活性(22.4%～44.6%)。
, 百拇医药
螺旋藻已被用于恶性肿瘤的治疗，并取得一定的疗效，现认为螺旋藻及其多糖在动物实验中有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数，增加外周血液中T淋巴细胞的百分数和血清溶血素的含量，对正常小鼠骨髓细胞有促增殖作用，并有明显的抗癌与抗辐射作用[3～6]。但对LAK细胞的作用还不清楚，本文用钝顶螺藻(SPP)10μg/ml加入不同浓度的rIL-2诱导LAK细胞的培养体系中显示SPP可提高病人LAK细胞活性(15.3%～30.5%)。
我们还注意到：①SPP不能单独激活LAK细胞，这可能与需要IL-2做为第一信号激活淋巴细胞后，多糖才能发挥作用有关[7]，也可能是通过淋巴细胞高表达IL-2受体和/或IL-2的分泌，及其他细胞因子的分泌以增强其提高LAK细胞的杀伤活性有关[8、9]。②SPP对LAK细胞扩增无明显影响。③SPP可减少rIL-2用量，10μg/ml SPP可节省50%rIL-2，(SPP+5×105u/L rIL-2诱导LAK细胞活性与单独用1×106u/L rIL-2的LAK活性无差异,分别为32.4±9.5与35.3±10.7)，说明SPP不但可提高LAK细胞活性，而且可减少rIL-2用量，达到减少LAK细胞治疗中费用，降低IL-2副作用。
, 百拇医药
参考文献
[1]曹广文等.杞子多糖，黄芪多糖，刺五加多糖，鼠伤寒杆菌内毒素多糖对LAK活性的调节作用.第二军医大学学报，1992，13(3)：201.
[2]储大同.黄芪成分F3增强低剂量白介素-2诱导LAK细胞的细胞毒效应.中西医结合杂志，1990，10(1)：34.
[3]庞启深等.螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作用及其机理的研究.海洋科学，1991,9(5)：33-38.
[5]郭朝华等.钝顶螺旋藻多糖对正常小鼠髓造血干细胞和粒-单核细胞系祖细胞的影响.中华血液学杂志，1996，17(1)：32-33.
[6]王俏光.钝顶螺旋藻的抗癌作用及对免疫功能的影响.癌症,1996,15(6):423-425.
, 百拇医药
[7]李金锋.猪苓多糖，香菇多糖和分歧杆菌多糖对淋巴因子活化细胞活性增强作用的研究.中国中西医结合杂志,1996,16(4):224.
[8]Tvede NH et al.Interleukin-2 receptor expression by human blood lymphocyts after vaccination with pneumococcal polysaccheride.Clin Exp Immunol，1989，76:401-411.
[9]李金锋等.猪苓多糖对小鼠NK，LAK活性的影响.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15:89
收稿时间：1999-10-10, 百拇医药
单位：曾波航 王光明 王光明 曾亚仑(广州医学院第二附属医院肿瘤科，510260)；曾亚仑(广州白云山中药厂，广州 510515)
关键词：螺旋藻多糖，LAK细胞，白血病
中国海洋药物000213 摘要 目的：了解钝顶螺旋藻多糖(SPP)对正常人和白血病患者LAK细胞活性作用，探讨螺旋藻作用机理。方法：以Raji细胞(人B细胞白血病细胞株)为靶细胞，用3H-TdR渗入法检测LAK细胞活性。结果：白血病病人LAK细胞活性降低；SPP可增强正常人和病人LAK细胞活性，且对正常人LAK细胞活性增强作用大于病人。结论：SPP可刺激LAK细胞活性，减少rIL-2用量。
EFFECT OF SPIRULINA PATENSIS POLYSACCHARIDE ON THE ACTIBITIES OF LAK CELL OF PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELL IN PATIENTS WITH LEUKEMIA.
, http://www.100md.com
Zeng Bohang,Wang Guangming,Zeng Yalun
(Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical College,Guang Zhao 510260)
ABSTRACT Objective:The effects of spirulina patensis polysaccharide(SPP)on the activities of lymphokine-activited killer(LAK)cell from normal individuals and patients with leukemia were comparized.Mechanism of SPPs immunological effection was studied.Methods:With Raji cells being target cell,LAK cell activity was determined by 3H-TdR release assay.Results:LAK cell activity was lower in patients with leukemia than in normal individuals.SPP could increase LAK cell activity both normal individuals and patients with leukemia.It was higher LAK cell activity after adding SPP in normal individuals than patients with leukemia.Conclusion:SPP is able to stimulate LAK cell activity and to decrease rIL-2 quantity in LAK cell activation.
, 百拇医药
KEY WORD Polysaccaried of spirulina platensis(SPP), LAK cell,Leukemia.
淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)对肿瘤细胞有杀伤作用，已被用于临床治疗多种恶性肿瘤，并取得一定疗效，但由于白细胞介素-2(IL-2)用量过大、费用高、副作用大等限制了IL-2/LAK细胞临床应用。因此，寻找能提高LAK细胞活性，降低IL-2用量的药物，特别是从生药及有效成分中发现此类物质成为肿瘤生物治疗学的一个热点。本文用钝顶螺旋藻多糖(SPP)观察其对正常人和白血病病人外周血LAK细胞作用，探讨钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)提高免疫功能的作用机理。现将结果报告如下：
1 材料和方法
1.1 实验对象 23例白血病人为我院住院患者，男性13例，女性10例，年龄15～75岁，中位年龄40岁，所有患者经临床和骨髓细胞学确诊，所有病人近3周未用免疫抑制剂及免疫增强药物。
, http://www.100md.com
1.2 对照组 为门诊健康体检者，男性15例，女性10例，年龄18～72岁，中位年龄42岁。
1.3 方法
1.3.1 LAK细胞活化，取肝素抗凝静脉血3～5ml，用淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞，配成1×109/L。根据实验要求，分别加入重组人白细胞介素-2rIL-2(沈阳三生药厂)1×106μ、5×105μ、2.5×105μ/L和SPP(分子量约21950，由南京大学张成武教授惠赠)(对照组加等量1640培养液)、5%CO2、37℃，培养96h，诱导LAK细胞，收集细胞，洗涤3次后，配成2×109/L即为待测活化LAK细胞，台盼兰染色计数活细胞>95%。
1.3.2 LAK细胞体外扩增，取外周血单个核细胞调整浓度为1×109/L，加入24孔培养板中，1ml/孔，分成SPP组、rIL-2组、SPP+rIL-2组及对照组(1640液作对照)，每组设3个复孔，3天换液一次，隔日进行细胞计数。
, 百拇医药
1.3.3 LAK细胞活性测定：取Riji细胞作为LAK细胞的靶细胞，在96孔板中每孔加入1×108/L LAK细胞(效：靶为20：1)，对照组加等量1640液，每孔设3个复孔，振荡混匀后，37℃、5%CO2中孵育20h，终止培养时，每孔加入50μl胰酶和DNA酶溶液(终浓度分别为0.15%和0.025%)，处理30分种后收集细胞，烘干滤纸，γ-液闪仪测每孔1min CPM(CPM：计数/分钟)
1.4 数据处理：用t检验和方差分析，判断各组间有无差异显著性。
2 结果
2.1 病人与正常人LAK活性及受SPP影响
从表1中可知：不同浓度rIL-2诱导病人LAK活性均低于正常人LAK活性。
, http://www.100md.com
表1 rIL-2浓度与LAK活性
n
rIL-2浓度
1×106μ/L
5×105μ/L
2.5×105μ/L
正常人
病人
25
23
46.8±8.5
35.3±10.7*
, 百拇医药
32.6±10.2
25.6±8.3*
20.6±9.4
16.7±9.3*
*与正常人相比较P<0.01
2.2 SPP对不同浓度rIL-2诱导LAK活性的影响
从表2可知，加入SPP(10μg/ml)后，正常人LAK活性在rIL-2浓度为1×106μ/L、5×105μ/L和2.5×105μ/L时，分别提高22.4%、37.7%和44.7%(P均<0.01)，当加入SPP在rIL-2浓度为5×105μ/L、2.5×105μ/L时，加入SPP，LAK活性的提高比rIL-2浓度为1×106μ/L时增高(P<0.05)，提示SPP可提高正常人LAK活性并减少rIL-2用量，其作用在rIL-2为低浓度时尤为显著。
, http://www.100md.com
2.3 SPP对病人在不同浓度rIL-2时对LAK细胞活性的影响
表2 SPP(10μg/ml)对正常人不同浓度rIL-2诱导LAK活性的作用
rIL-2浓度(μ/L)
1×106
5×105
2.5×105
正常人
加SPP组
46.8±8.5
57.3±9.1*
, http://www.100md.com
32.6±10.2
44.9±7.8*
20.6±9.4
29.8±10.6*
*与正常人相比较*P<0.01表3 SPP对病人不同rIL-2浓度时对LAK细胞的影响
RIL-2浓度(u/L)
1×106
5×105
2.5×105
病人组
, 百拇医药
病人加SPP组
35.3±10.7
40.5±7.9*
25.6±8.3
32.4±9.5*
16.7±9.3
21.8±10.3*
*与病人未加SPP组相比P<0.05
病人组加入SPP(10μg/ml)后，LAK活性在rIL-2浓度为1×106u/L、5×105u/L和2.5×105u/L 分别提高15.3%、26.6%和30.5%(P<0.05)，与正常人提高幅度相比差异有显著性(P均<0.05)(表4)。提示SPP也可提高患者LAK细胞活性，但增高的幅度低于正常人。
, http://www.100md.com
表4 SPP对正常人与病人LAK细胞的影响
rIL-2浓度(μ/L)
1×106
5×105
2.5×105
正常人
病人
22.4%
15.3%*
33.7%
26.6%*
, 百拇医药
44.7%
30.5%**
与正常人相比较*P<0.05，与正常人相比较**P<0.01。
2.4 SPP对LAK细胞扩增的影响
SPP(10μg/ml)单独培养单个核细胞至第8天，细胞多数已死亡，而rIL-2(5×105μ/L)组培养第6d略有减少，以后开始扩增，到第15d时可增加至180%，SPP(10μg/ml)和rIL-2(5×105μ/L)联合组LAK细胞数量与rIL-2组LAK细胞数量无明显差异。
3 讨论
曹广文等[1]发现黄芪多糖、刺五加多糖和枸杞子多糖在体外均能明显提高LAK细胞活性(分别为80%、60%和52%)，储大同等[2]则用黄芪F3在体外与低剂量的rIL-2(5×105u/L)合用，发现LAK活性是单用rIL-2的2.3倍与高剂量(106/ml)所产生的LAK活性相同，我们用SPP(10μg/ml)加入不同浓度的rIL-2诱导LAK细胞的培养体系中，显示SPP可提高正常人LAK细胞活性(22.4%～44.6%)。
, 百拇医药
螺旋藻已被用于恶性肿瘤的治疗，并取得一定的疗效，现认为螺旋藻及其多糖在动物实验中有促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数，增加外周血液中T淋巴细胞的百分数和血清溶血素的含量，对正常小鼠骨髓细胞有促增殖作用，并有明显的抗癌与抗辐射作用[3～6]。但对LAK细胞的作用还不清楚，本文用钝顶螺藻(SPP)10μg/ml加入不同浓度的rIL-2诱导LAK细胞的培养体系中显示SPP可提高病人LAK细胞活性(15.3%～30.5%)。
我们还注意到：①SPP不能单独激活LAK细胞，这可能与需要IL-2做为第一信号激活淋巴细胞后，多糖才能发挥作用有关[7]，也可能是通过淋巴细胞高表达IL-2受体和/或IL-2的分泌，及其他细胞因子的分泌以增强其提高LAK细胞的杀伤活性有关[8、9]。②SPP对LAK细胞扩增无明显影响。③SPP可减少rIL-2用量，10μg/ml SPP可节省50%rIL-2，(SPP+5×105u/L rIL-2诱导LAK细胞活性与单独用1×106u/L rIL-2的LAK活性无差异,分别为32.4±9.5与35.3±10.7)，说明SPP不但可提高LAK细胞活性，而且可减少rIL-2用量，达到减少LAK细胞治疗中费用，降低IL-2副作用。
, 百拇医药
参考文献
[1]曹广文等.杞子多糖，黄芪多糖，刺五加多糖，鼠伤寒杆菌内毒素多糖对LAK活性的调节作用.第二军医大学学报，1992，13(3)：201.
[2]储大同.黄芪成分F3增强低剂量白介素-2诱导LAK细胞的细胞毒效应.中西医结合杂志，1990，10(1)：34.
[3]庞启深等.螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作用及其机理的研究.海洋科学，1991,9(5)：33-38.
[5]郭朝华等.钝顶螺旋藻多糖对正常小鼠髓造血干细胞和粒-单核细胞系祖细胞的影响.中华血液学杂志，1996，17(1)：32-33.
[6]王俏光.钝顶螺旋藻的抗癌作用及对免疫功能的影响.癌症,1996,15(6):423-425.
, 百拇医药
[7]李金锋.猪苓多糖，香菇多糖和分歧杆菌多糖对淋巴因子活化细胞活性增强作用的研究.中国中西医结合杂志,1996,16(4):224.
[8]Tvede NH et al.Interleukin-2 receptor expression by human blood lymphocyts after vaccination with pneumococcal polysaccheride.Clin Exp Immunol，1989，76:401-411.
[9]李金锋等.猪苓多糖对小鼠NK，LAK活性的影响.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15:89
收稿时间：1999-10-10, 百拇医药