缺血预处理诱导心肌缺血再灌注中HSP70mRNA表达的研究
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山东医科大学学报 2000年第2期第38卷 论著
作者：郭玲 张运 许崇恩 游力
单位：郭玲(山东省立医院心内科)；张运 许崇恩(山东医科大学附属医院)；游力(山东省医学科学院)
关键词：缺血预处理；心肌缺血；心肌再灌注损伤；热休克蛋白类
山东医科大学学报000218摘 要：目的：探讨缺血预处理(IPC)对心肌缺血再灌注过程中心肌细胞HSP70mRNA表达的影响。方法：钳夹犬的左冠状动脉前降支，造成心肌缺血再灌注模型，应用核酸分子杂交技术观察IPC组与对照组子缺血前及缺血1h后行再灌注达1、2、4h的HSP70mRNA表达水平。并在透射电镜下观察两组中再灌注1h心肌组织超微结构的变化。结果：缺血前IPC组HSP70mRNA水平较对照组明显升高(P<0.05)；缺血再灌注达1h、2h时，两组HSP70mRNA水平有继续增高的趋势，但IPC组较对照组有显著性差异(P<0.05)；再灌注达4h时，两组HSP70mRNA水平均下降，并接近对照组缺血前水平(P>0.05)。电镜观察显示，IPC组心肌细胞损伤较对照组明显减轻。IPC能够诱导心肌细胞中HSP70mRNA早期迅速表达，并在缺血再灌注的一定时间内呈表达增高的趋势。结论：HSP70可能作为IPC发挥心肌保护作用的一种介质，为进一步开发和利用IPC的心肌保护作用提供理论依据。
, 百拇医药
分类号：R542.2；R456+.4 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0163-03
INDUCTION OF HSP70 mRNA EXPRESSION BY ISCHEMIA PRECONDlTlONING DURING ISCHEMIA REPERFUSION INJURY
GUO Ling,ZHANG Yun,XU Chong-en
(Dept. of Cardiology, Shandong Provincial Hospital)
Abstract：Objective: To study the effects of Ischemia Preconditioning (IPC) on the expression of HSP70 mRNA during ischemia reperfusion injury. Methods:Eight dogs were evenly divided into IPC group and control group. Dogs in IPC group were subjected to 5min left anterior descending coronary artery occlusions and 10min reperfusions for 4 times before 1h ischemia,and myocardial tissues from left ventricular free walls were excised after IPC,and at 1,2,4h of reperfusion as well as control group. Total RNA was extracted and subjected to Dot blotting. The myocardial ultrastructure of 1h reperfusion in two groups was observed under transmission electron microscope (TEM). Results:The levels of HSP70 mRNA in IPC and control groups before 1h ischemia were 2.65±0.21 and 2.36±0.19(P<0.05),and at 1h,2h reperfusions were 2.98±0.12 and 2.75±0.16(P<0.05), 3.26±0.18 and 3.19±0.14 ( P<0.05). But no difference between the two groups at 4h reperfusion(2.52±0.24 and 2.47±0.20, ( P>0.05). IPC can induce early expression of HSP70 mRNA in dog myocardium, and the expression levels increase in the following reperfusion process. Conclusion:It is suggested that HSP70 may act as a mediator for the protection of myocardium during ischemia reperfusion injury.
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Keywords：Preconditioning; Myocardial ischemia; Myocardial reperfusion injury; Heat-shock proteins 近年来实施心肌保护方面的研究多注重于调动心脏内源性的保护机制，以提高心肌细胞自身耐受缺血缺氧的能力，其中缺血预处理(ischemispreconditioning，IPC)和热休克蛋白70(HSP70)是新近较受重视的两条“内源性”保护途径，而有关二者之间的关系尚存在许多争议。本研究意在通过心肌缺血再灌注前行IPC的方法，观察lPC对缺血再灌注过程中心肌细胞HSP70mRNA表达的影响，从而探讨HSP70mRNA表达与IPC之间的关系。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物与分组：健康杂种犬8只，雌雄不拘，体重14～25Kg，随机分为2组：缺血预处理(IPC)组4只，对照组4只。
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1.1.2仪器：透射电镜(H-800型)，日本日立公司产，山东师范大学电镜室提供；激光薄层扫描仪(CS-900型)，日本岛津公司产，济南军区药物检验所提供；高速台式离心机(TGL-16B型)，上海科学仪器厂产，山东省医学科学院生化室提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制备和标本留取实验动物经3%的戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉后，行气管插管，呼吸机辅助呼吸。自左侧第4肋间开胸，暴露心脏，于左冠状动脉前降支中上1/3交界处分离冠脉，以备阻断血流。标本留取方法：对照组：用无创伤动脉夹钳夹血管阻断血流1h后，行再灌注，分别于缺血前及再灌注达1、2、4h时，切取左心室游离壁的心肌组织，立即置1.5ml冻存管中，置液氮中保存备用。IPC组：先行缺血预处理，即阻断左冠状动脉前降支5min，再灌注10min，反复4次后，切取左心室游离壁组织冻存，其余实验及标本留取方法同对照组。另取两组中再灌注1h的心肌组织，迅速切成1mm3的小块，4℃保存，以备制作电镜切片。
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1.2.2心肌组织RNA的提取采取AGPC一步法提取RNA。准确称取心肌组织100mg，剪碎匀浆，加D液(denaturesolution，4mol异硫氰酸胍，25mmolNaAC，0.5%十二烷基肌氨酸钠和0.5mol2-巯基乙醇)，经酚氯仿抽提，离心后用异丙醇沉淀RNA，-70℃保存备用。
1.2.3斑点杂交HSP70探针为cDNA片段，2.3Kb(北京华美生物工程公司提供)，探针用地高辛配基标记，进行斑点杂交。主要过程：将变性的两组RNA样品(含RNA10μg，甲酰胺20μl，37%甲醛7μl，20×SSC20μl)点样于硝酸纤维素膜上，室温干燥，80℃烘烤2h，进行预杂交(5×SSC，封阻剂0.1%十二烷基肌氨酸钠，0.02%SDS)，42℃24h，再加入变性的探针，置于42℃，杂交16～18h，洗膜，避光显色。
1.2.4HSP70mRNA定量分析应用岛津SC-900型激光薄层扫描仪对斑点杂交膜进行激光密度扫描，并根据每一斑点的光密度积分值，进行HSP70mRNA的相对定量分析。
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1.3统计学处理方法所有数据均以均数±标准差(±
s)表示，经组间t检验进行统计学处理，P<0.05表示差异有显著性。(由于扫描所得光密度值较大，为了计算和比较方便，将数值进行对数转换，以对数值表示实际测量值)。
2结果
2.1电镜观察IPC组心肌细胞肌纤维排列较整齐，未发生断裂。线粒体仅轻度肿胀，嵴间腔隙轻度扩张(图1)；而对照组心肌纤维排列多不规则，部分肌节发生断裂，线粒体肿胀明显，嵴被破坏甚至消失(图2)。
图1IPC组再灌注1h心肌组织超微结构改变(×8000)
Fig.1Themyocardialultrastructureof1hreperfusionincontrolgroup
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图2对照组再灌注1h心肌组织超微结构改变(×8000)
Fig.2Themyocardialultrastructureof1hreperfusionincontrolgroup
2.2两组HSP70mRNA表达水平阻断左冠状动脉前降支1h前，IPC组心肌细胞USP70mRNA水平较对照组明显升高，表明短暂的心肌缺血和再灌注能够诱导HSP70mRNA的表达，且在随后的缺血再灌注过程中(再灌注1h、2h)其表达水平进一步升高，随再灌注时间延长(再灌注4h)，表达水平开始下降，逐渐接近缺血前水平(表1)。
表1实验各时相两组HSP70mRNA表达水平比较(±s)
3讨论
热休克蛋白(HSPs)是在多种损伤性应激原(如热休克、缺血、缺氧、pH值改变、感染、缺血再灌注等)的作用下合成的一种具有细胞保护作用的蛋白质[1，2]。IPC作为一种损伤性应激原，亦可能通过诱导HSPs的合成增加来有效地调动心肌自身的保护机制，提高对缺血缺氧的耐受力。HSPs的产生是由热休克转录因子(heatshocktranscriptionfactor，HSF)与HSP基因上特异DNA片段—热休克素(heatshockelement，HSE)的结合来调节的。在非应激状态下，HSF蛋白以单体形式存在，不与HSE结合，而在缺血缺氧等损伤性应激原作用下，HSF作为启动因子与HSE结合，激活HSPs基因，产生HSP70及其他应激蛋白[3]。HSP70具有稳定细胞膜结构，防止蛋白质变性等功能[4]。Currie等对离体大鼠心脏行热预处理，结果实验组心肌收缩力的恢复明显优于对照组，且线粒体损伤较轻，肌酸磷酸激酶释放减少，在HSP70水平增高的同时，伴有氧自由基清除剂一内源性过氧化氢酶的升高，分析认为，这可能与HSP70的直接作用有关[5]。另有用全身热休克法诱导HSP70产生的研究发现，预处理能够改善缺血后心脏机械功能的恢复，缩小心肌梗塞面积，减轻氧自由基及钙超载所致的心肌损伤，有利于心肌细胞ATP的保护和线粒体功能的保护，明显减轻心肌缺血再灌注损伤，而且HSP70mRNA表达及HSP70的含量与心功能的恢复呈正相关[6]。尽管IPC能够诱导HSP70mRNA的早期表达，但HSP70作为IPC发挥心肌保护作用的一种介质尚有争议。有研究发现，虽然心肌有HSP70mRNA的明显升高，但在IPC早期并无HSPs的产生增加，HSPs合成增加发生在心肌缺血后几小时，而此时IPC的保护作用已经消失。新近Kuzuya等的研究发现，IPC后24小时再次缺血时，心肌仍保留部分IPC效应，而此时HSPs的合成增加，推测HSP70可能在IPC的延迟相中发挥主要作用[7]。总之，有关IPC与HSPs之间的关系尚有待进一步研究。
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参考文献：
[1]Ang D, Liberek K,Skowyra D, et al. Biological role and regulation of the universally conserved heat shock protein[J]. J Biol Chem,1991,266:24233
[2]Iwaki K,Chi S,Dillmarm WH,et al. Induction of HSP70 in cultured rat neonatal cardiomyocytes by hypoxia and metabolic stress[J]. Circulation,1993,87:2023
[3]Pelham HRB. A regulatory upstream promoter element in Drosophila HSP70 heat shock gene[J]. Cell;1982,30:517
, http://www.100md.com
[4]Ciang HL, Terleky SR, Plant CP, et al. A role for a 70 kilodalon heat shock protein in 1ysosomal degradation of in tracellular proteim[J].Science,1989,246:382
[5]Currier WR, Karmazyn M, Kloc M, et al. Heat shock response is assoicated with enhanced postischemic ventricular recover[J]. Gr Res,1988,63:543
[6]Hutter M,Sievers RF,Barbosa V,et al. Heat shock protein induction in rat heart. A direct correlation between the amour of heat shock protein induced and the degree of my ocardial protein[J].Circulation,1994,89:355
[7]Kukreja RC, Lontos MC,Loesser KE, et al. Oxidant stress increases heat shock protein 70 mRNA in isolated perfused rat heart[J].Am J Physiol,1994,267:2213
收稿日期：1997-10-27, http://www.100md.com
单位：郭玲(山东省立医院心内科)；张运 许崇恩(山东医科大学附属医院)；游力(山东省医学科学院)
关键词：缺血预处理；心肌缺血；心肌再灌注损伤；热休克蛋白类
山东医科大学学报000218摘 要：目的：探讨缺血预处理(IPC)对心肌缺血再灌注过程中心肌细胞HSP70mRNA表达的影响。方法：钳夹犬的左冠状动脉前降支，造成心肌缺血再灌注模型，应用核酸分子杂交技术观察IPC组与对照组子缺血前及缺血1h后行再灌注达1、2、4h的HSP70mRNA表达水平。并在透射电镜下观察两组中再灌注1h心肌组织超微结构的变化。结果：缺血前IPC组HSP70mRNA水平较对照组明显升高(P<0.05)；缺血再灌注达1h、2h时，两组HSP70mRNA水平有继续增高的趋势，但IPC组较对照组有显著性差异(P<0.05)；再灌注达4h时，两组HSP70mRNA水平均下降，并接近对照组缺血前水平(P>0.05)。电镜观察显示，IPC组心肌细胞损伤较对照组明显减轻。IPC能够诱导心肌细胞中HSP70mRNA早期迅速表达，并在缺血再灌注的一定时间内呈表达增高的趋势。结论：HSP70可能作为IPC发挥心肌保护作用的一种介质，为进一步开发和利用IPC的心肌保护作用提供理论依据。
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分类号：R542.2；R456+.4 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0163-03
INDUCTION OF HSP70 mRNA EXPRESSION BY ISCHEMIA PRECONDlTlONING DURING ISCHEMIA REPERFUSION INJURY
GUO Ling,ZHANG Yun,XU Chong-en
(Dept. of Cardiology, Shandong Provincial Hospital)
Abstract：Objective: To study the effects of Ischemia Preconditioning (IPC) on the expression of HSP70 mRNA during ischemia reperfusion injury. Methods:Eight dogs were evenly divided into IPC group and control group. Dogs in IPC group were subjected to 5min left anterior descending coronary artery occlusions and 10min reperfusions for 4 times before 1h ischemia,and myocardial tissues from left ventricular free walls were excised after IPC,and at 1,2,4h of reperfusion as well as control group. Total RNA was extracted and subjected to Dot blotting. The myocardial ultrastructure of 1h reperfusion in two groups was observed under transmission electron microscope (TEM). Results:The levels of HSP70 mRNA in IPC and control groups before 1h ischemia were 2.65±0.21 and 2.36±0.19(P<0.05),and at 1h,2h reperfusions were 2.98±0.12 and 2.75±0.16(P<0.05), 3.26±0.18 and 3.19±0.14 ( P<0.05). But no difference between the two groups at 4h reperfusion(2.52±0.24 and 2.47±0.20, ( P>0.05). IPC can induce early expression of HSP70 mRNA in dog myocardium, and the expression levels increase in the following reperfusion process. Conclusion:It is suggested that HSP70 may act as a mediator for the protection of myocardium during ischemia reperfusion injury.
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Keywords：Preconditioning; Myocardial ischemia; Myocardial reperfusion injury; Heat-shock proteins 近年来实施心肌保护方面的研究多注重于调动心脏内源性的保护机制，以提高心肌细胞自身耐受缺血缺氧的能力，其中缺血预处理(ischemispreconditioning，IPC)和热休克蛋白70(HSP70)是新近较受重视的两条“内源性”保护途径，而有关二者之间的关系尚存在许多争议。本研究意在通过心肌缺血再灌注前行IPC的方法，观察lPC对缺血再灌注过程中心肌细胞HSP70mRNA表达的影响，从而探讨HSP70mRNA表达与IPC之间的关系。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物与分组：健康杂种犬8只，雌雄不拘，体重14～25Kg，随机分为2组：缺血预处理(IPC)组4只，对照组4只。
, http://www.100md.com
1.1.2仪器：透射电镜(H-800型)，日本日立公司产，山东师范大学电镜室提供；激光薄层扫描仪(CS-900型)，日本岛津公司产，济南军区药物检验所提供；高速台式离心机(TGL-16B型)，上海科学仪器厂产，山东省医学科学院生化室提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制备和标本留取实验动物经3%的戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉后，行气管插管，呼吸机辅助呼吸。自左侧第4肋间开胸，暴露心脏，于左冠状动脉前降支中上1/3交界处分离冠脉，以备阻断血流。标本留取方法：对照组：用无创伤动脉夹钳夹血管阻断血流1h后，行再灌注，分别于缺血前及再灌注达1、2、4h时，切取左心室游离壁的心肌组织，立即置1.5ml冻存管中，置液氮中保存备用。IPC组：先行缺血预处理，即阻断左冠状动脉前降支5min，再灌注10min，反复4次后，切取左心室游离壁组织冻存，其余实验及标本留取方法同对照组。另取两组中再灌注1h的心肌组织，迅速切成1mm3的小块，4℃保存，以备制作电镜切片。
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1.2.2心肌组织RNA的提取采取AGPC一步法提取RNA。准确称取心肌组织100mg，剪碎匀浆，加D液(denaturesolution，4mol异硫氰酸胍，25mmolNaAC，0.5%十二烷基肌氨酸钠和0.5mol2-巯基乙醇)，经酚氯仿抽提，离心后用异丙醇沉淀RNA，-70℃保存备用。
1.2.3斑点杂交HSP70探针为cDNA片段，2.3Kb(北京华美生物工程公司提供)，探针用地高辛配基标记，进行斑点杂交。主要过程：将变性的两组RNA样品(含RNA10μg，甲酰胺20μl，37%甲醛7μl，20×SSC20μl)点样于硝酸纤维素膜上，室温干燥，80℃烘烤2h，进行预杂交(5×SSC，封阻剂0.1%十二烷基肌氨酸钠，0.02%SDS)，42℃24h，再加入变性的探针，置于42℃，杂交16～18h，洗膜，避光显色。
1.2.4HSP70mRNA定量分析应用岛津SC-900型激光薄层扫描仪对斑点杂交膜进行激光密度扫描，并根据每一斑点的光密度积分值，进行HSP70mRNA的相对定量分析。
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1.3统计学处理方法所有数据均以均数±标准差(±
s)表示，经组间t检验进行统计学处理，P<0.05表示差异有显著性。(由于扫描所得光密度值较大，为了计算和比较方便，将数值进行对数转换，以对数值表示实际测量值)。
2结果
2.1电镜观察IPC组心肌细胞肌纤维排列较整齐，未发生断裂。线粒体仅轻度肿胀，嵴间腔隙轻度扩张(图1)；而对照组心肌纤维排列多不规则，部分肌节发生断裂，线粒体肿胀明显，嵴被破坏甚至消失(图2)。
图1IPC组再灌注1h心肌组织超微结构改变(×8000)
Fig.1Themyocardialultrastructureof1hreperfusionincontrolgroup
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图2对照组再灌注1h心肌组织超微结构改变(×8000)
Fig.2Themyocardialultrastructureof1hreperfusionincontrolgroup
2.2两组HSP70mRNA表达水平阻断左冠状动脉前降支1h前，IPC组心肌细胞USP70mRNA水平较对照组明显升高，表明短暂的心肌缺血和再灌注能够诱导HSP70mRNA的表达，且在随后的缺血再灌注过程中(再灌注1h、2h)其表达水平进一步升高，随再灌注时间延长(再灌注4h)，表达水平开始下降，逐渐接近缺血前水平(表1)。
表1实验各时相两组HSP70mRNA表达水平比较(±s)
3讨论
热休克蛋白(HSPs)是在多种损伤性应激原(如热休克、缺血、缺氧、pH值改变、感染、缺血再灌注等)的作用下合成的一种具有细胞保护作用的蛋白质[1，2]。IPC作为一种损伤性应激原，亦可能通过诱导HSPs的合成增加来有效地调动心肌自身的保护机制，提高对缺血缺氧的耐受力。HSPs的产生是由热休克转录因子(heatshocktranscriptionfactor，HSF)与HSP基因上特异DNA片段—热休克素(heatshockelement，HSE)的结合来调节的。在非应激状态下，HSF蛋白以单体形式存在，不与HSE结合，而在缺血缺氧等损伤性应激原作用下，HSF作为启动因子与HSE结合，激活HSPs基因，产生HSP70及其他应激蛋白[3]。HSP70具有稳定细胞膜结构，防止蛋白质变性等功能[4]。Currie等对离体大鼠心脏行热预处理，结果实验组心肌收缩力的恢复明显优于对照组，且线粒体损伤较轻，肌酸磷酸激酶释放减少，在HSP70水平增高的同时，伴有氧自由基清除剂一内源性过氧化氢酶的升高，分析认为，这可能与HSP70的直接作用有关[5]。另有用全身热休克法诱导HSP70产生的研究发现，预处理能够改善缺血后心脏机械功能的恢复，缩小心肌梗塞面积，减轻氧自由基及钙超载所致的心肌损伤，有利于心肌细胞ATP的保护和线粒体功能的保护，明显减轻心肌缺血再灌注损伤，而且HSP70mRNA表达及HSP70的含量与心功能的恢复呈正相关[6]。尽管IPC能够诱导HSP70mRNA的早期表达，但HSP70作为IPC发挥心肌保护作用的一种介质尚有争议。有研究发现，虽然心肌有HSP70mRNA的明显升高，但在IPC早期并无HSPs的产生增加，HSPs合成增加发生在心肌缺血后几小时，而此时IPC的保护作用已经消失。新近Kuzuya等的研究发现，IPC后24小时再次缺血时，心肌仍保留部分IPC效应，而此时HSPs的合成增加，推测HSP70可能在IPC的延迟相中发挥主要作用[7]。总之，有关IPC与HSPs之间的关系尚有待进一步研究。
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参考文献：
[1]Ang D, Liberek K,Skowyra D, et al. Biological role and regulation of the universally conserved heat shock protein[J]. J Biol Chem,1991,266:24233
[2]Iwaki K,Chi S,Dillmarm WH,et al. Induction of HSP70 in cultured rat neonatal cardiomyocytes by hypoxia and metabolic stress[J]. Circulation,1993,87:2023
[3]Pelham HRB. A regulatory upstream promoter element in Drosophila HSP70 heat shock gene[J]. Cell;1982,30:517
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[4]Ciang HL, Terleky SR, Plant CP, et al. A role for a 70 kilodalon heat shock protein in 1ysosomal degradation of in tracellular proteim[J].Science,1989,246:382
[5]Currier WR, Karmazyn M, Kloc M, et al. Heat shock response is assoicated with enhanced postischemic ventricular recover[J]. Gr Res,1988,63:543
[6]Hutter M,Sievers RF,Barbosa V,et al. Heat shock protein induction in rat heart. A direct correlation between the amour of heat shock protein induced and the degree of my ocardial protein[J].Circulation,1994,89:355
[7]Kukreja RC, Lontos MC,Loesser KE, et al. Oxidant stress increases heat shock protein 70 mRNA in isolated perfused rat heart[J].Am J Physiol,1994,267:2213
收稿日期：1997-10-27, http://www.100md.com