Bcr-abl特异性系列核酶体外切割活性比较及诱导K562细胞凋亡的实验研究
作者：冯琦 孙秉中 赵永同 孙凯 赵宁 刘利 颜真 韩苇 张英起
单位：冯琦 孙秉中 刘利(710033 西安，第四军医大学西京医院血液内科)；(第四军医大学生物技术中心)赵永同 赵宁 颜真 韩苇 张英起；孙凯(第四军医大学西京医院肝胆外科)
关键词：白血病，髓样，慢性；融合蛋白质类，bcr-abl；脱噬作用
中华医学杂志000222
【摘要】 目的 构建单、双及三单位核酶，鉴定其体外切割活性及对K562生物学特性的影响，探讨核酶用于基因治疗的前景。方法 首先针对bcr-abl融合位点设计并合成3个单核酶，而后通过基因重组构建单、双及三核酶载体，以体外切割试验鉴定并比较其活性。然后以脂质体将bcr-abl三核酶逆转录病毒载体转入K562细胞，观察其对K562细胞周期、凋亡、超微结构的影响。结果 构建成功bcr-abl特异性系列核酶共6个重组载体，切割试验证实系列核酶载体中三核酶体外切割活性最强，为70.8%，双核酶次之，分别为60.7%和30.3%，不同位点的单核酶切割活性分别为54.6%、25.3%和3.6%。bcr-abl特异性多核酶通过诱导凋亡抑制K562细胞增殖。结论 bcr-abl特异性核酶在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的应用前景，为多核酶体外净化骨髓联合自体骨髓移植治疗提供了理论和实验依据。
, http://www.100md.com
Study on the in vitro cleavage abilities of ribozymes specific to different sites of bcr-abl fusion gene and their induction of apoptosis in K562 cells
FENG Qi, SUN Bingzhong, ZHAO Yongtong, et al.
(Department of Hematology, Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University, Xi'an 710033， China)
【Abstract】 Objective To investigate the in vitro cleavage abilities of ribozymes specific to different sites of bcr-abl fusion gene and their effects on K562 cell. Methods First, three single-ribozymes specific to the fusion point were designed. After recombination, 6 vectors including single-, double- and triple- ribozymes were constructed and their in vitro cleavage abilities were compared. Then the triple-unit ribozyme retroviral vector was transfected into K562 cell to test its effect on cell cycle, apoptosis and cell structure. Results These ribozymes can cleave the template in vitro with different efficiency. The triple-unit ribozyme, with an efficiency of 70.8%, was the most efficient one. The cleavage efficiency of single-unit RZ1, RZ2 and RZ3 was 54.6%, 25.3% and 3.6%, respectively. Those of double-unit RZ12 and RZ23 were 60.7% and 30.3% respectively. The triple-unit ribozyme could inhibit the K562 cell growth by inducing apoptosis. Conclusion It is a new way to treat CML by ribozymes specific to bcr-abl fusion gene, which made it available to purge bone marrow by bcr-abl specific ribozymes.
, 百拇医药
【Key words】 Leukemia, myeloid, chronic; Fusion proteins, bcr-abl; Apoptosis
慢性粒细胞白血病(慢粒)是一种骨髓多能干细胞异常增生性疾病，c-abl从第9号染色体转位到第22号染色体断裂集簇区(break point cluster)，形成bcr-abl融合基因，其编码的相对分子质量为210 000具有异常的蛋白酪氨酸激酶活性，在慢粒的发病中起重要的作用[1]。通过核酶特异性切割融合基因mRNA以阻断蛋白表达是慢粒基因治疗的策略之一。本研究中，我们设计合成了一系列针对bcr-abl的单核酶、双核酶及三核酶载体，对它们的体外活性进行了比较，并研究了bcr-abl特异性三核酶对K562细胞生长的抑制作用及机理。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药
1.细胞、质粒及主要试剂：含bcr-abl基因的pGD210载体由美国Whitehead研究所Daley教授惠赠；含 neo基因的pBCMGSNeo载体及菌株由本校生物技术中心合成。K562细胞株来自本校免疫教研室。各种内切酶、缺口平移系统及Taq酶均购自华美公司。质粒提取和纯化试剂盒，体外转录及RNA提取试剂盒分别购自美国Promega和美国Clonetech公司。Lipofectin购自北京原平公司。核酶单链及PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
二、方法
1.核酶的设计与合成：根据bcr-abl融合基因cDNA序列，通过计算机程序辅助，针对融合位点的上游-29 bp，-1 bp及下游+15 bp分别设计3个锤头状核酶，核酶的作用位点分别为GUC、GUU及GUA。核酶单链等比例退火后制备双链单核酶RZ1、RZ2及RZ3。
RZ1:GCGGATCCGAATGTCATCGTTTCGTCCTCA-CGGACTCATCAGCACTCAGCCACGCATGCGAGGAATT-
, 百拇医药
CAGAGTCGACCG
RZ2:GCGCATGCTTAAGCAGAGTTTCGTCCTCAC-GGACTCATCAGCAAAAGCCCTGAATTCCG
RZ3:GCGAATTCTCAGCGGCCAGTTTCGTCCTCA-CGGACTCATCAGGCATCTGACTGTCGACCG
2.系列载体的构建：通过基因重组及PCR扩增等方法[2]构建3个单核酶、2个双核酶及1个三核酶体外转录载体、三单位核酶逆转录病毒载体(pDoRneo-RZ123)以及核酶体外切割模板(pBS210)载体。经酶切、电泳鉴定及DNA序列测定证实上述载体构建成功[3]。
3.核酶及模板pBS210载体的体外转录：根据不同酶切侧翼序列的差异，将上述核酶载体及pBS210载体酶切线性化，通过DNA回收试剂盒回收纯化后溶于20 μl DEPC水中。体外转录采用T7噬菌体RNA聚合酶进行。模板RNA用[α-32P]UTP同位素标记。转录产物溶于50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，1mmol/L EDTA溶液中，-70℃保存。
, http://www.100md.com
4.核酶与模板的相互作用：将核酶和模板转录物95℃变性5min后，置于冰上，各取4.5 μl，加入100 mmol/L MgCl2 1.0 μl，37℃反应2 h后用终止液(96%甲酰胺、20 mmol/L EDTA、1 g/L溴酚蓝、1 g/L二甲苯青蓝)终止反应，热变性后进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1 h，暗室内放射自显影2～6 h，自动洗片机冲洗，薄层扫描分析结果。
5.脂质体介导三核酶转染K562细胞：脂质体采用Lipofectin，转染方法参照说明书进行，分别将pDoRneo-RZ123和阴性对照pDoRneo转染K562细胞，48 h～72 h后观察K562/RZ123和K562/neo的各项指标。
6.neo基因DNA斑点杂交：载体pBCMGSNeo用HindIII+XbaI双酶切，获得1.9 kb大小的neo基因片段，1%琼脂糖电泳回收后用[α-32P] dATP进行缺口平移标记做为探针。K562/RZ123、K562/neo及K562三组细胞按常规方法提取细胞染色体DNA，与neo探针进行斑点杂交[2]。
, http://www.100md.com
7.细胞凋亡的检测：首先收集1×106细胞，制成细胞悬液，PI染色后以流式细胞仪进行细胞周期分析。此外，同时提取细胞染色体DNA后，1.5%琼脂糖凝胶电泳8 h～10 h，观察是否出现典型的DNA阶梯状。
8.透射电镜观察细胞超微结构的变化：收集1×106细胞，按常规方法2.5%戊二醛固定、制备电镜标本观察。
9.RT-PCR检测核酶对RNA切割作用：设计RT-PCR引物使bcr-abl融合位点位于扩增序列的中部，扩增后片段大小为366bp。上游引物为：5' CGTCTAGAGATGCTGACCAACTCGTGTG 3'，下游引物为：5' CCCTGCAGACACCATTCCCCATTGTGAT 3'。参照 QuickPrepR Total RNA Extraction Kit 说明书提取3组细胞RNA后，37℃反转录1 h，按以下条件进行PCR反应：95℃60 s；60℃80 s；72℃120 s；共35个循环，72℃延长10 min。
, 百拇医药
结果
1.序列核酶载体的构建：针对bcr-abl融合基因设计3个锤头状核酶，经计算机程序模拟测定及基因库检索，以上3个核酶均可特异性结合于融合基因相应位点。通过基因重组后最终获得3个单核酶、2个双核酶及1个三核酶体外转录载体。此外，还构建了三核酶逆转录病毒载体及核酶体外切割模板载体(含bcr-abl融合基因片段，约366bp)[3]。
2.系列核酶切割效率的比较：单、双及三核酶体外切割模板RNA后，同位素放射自显影的结果见图1。因核酶切割位点不同，作用于模板后产生的片段大小也不相同。因片段过小，双核酶和三核酶切割产生的23nt和28nt片段未显影。上述切割结果经薄层扫描数据分析显示，单核酶RZ1、2、3的切割效率分别为54.6%、25.3%和3.6%，双核酶RZ12，RZ23的切割效率为60.7%和30.3%，三核酶的切割效率为70.8%。
, http://www.100md.com
注：1.模板被RZ1切割为259 nt和169 nt大小RNA；2.模板被RZ2切割为231 nt和197 nt大小RNA；3.模板被RZ3切割为220 nt和208 nt大小RNA；4.模板RNA 428 nt；5.模板被RZ12切割为169 nt、197 nt、231 nt及259 nt大小的RNA；6.模板被RZ23切割为197 nt、208 nt、220 nt及231 nt大小的RNA；7.模板被Z123切割为169 nt、197 nt、208 nt、220 nt、231 nt及259 nt大小的RNA
图1 核酶对模板的体外切割活性比较
3.细胞基因组DNA斑点杂交：pDoRneo-RZ123和pDoRneo载体分别转染K562细胞后，neo基因整合入K562细胞，提取DNA与neo探针杂交出现阳性斑点，而对照组细胞则为阴性，说明载体转染成功。
, http://www.100md.com
4.流式细胞仪检测细胞周期：pDoRneo转染K562细胞后对细胞周期及凋亡均无影响，但转染三核酶48 h、72 h后G1期和G2期细胞数明显增多，而S期细胞受抑(表1)。而且在G1峰前可见一亚二倍体凋亡峰，凋亡细胞分别占2.4%和18.4%。表1 K562细胞转染核酶及对照载体细胞周期的变化 组别
G1
G2
S
K562
37.7
4.4
58.0
, 百拇医药
K562/neo
38.8
4.3
56.9
K562/RZ123(48h)
40.4
(+7.2)
8.1
(+84.1)
51.6
(-11.0)
K562/RZ123(72h)
, 百拇医药
60.9
(+61.5)
5.4
(+22.7)
33.7
(-41.9)
注：括号内为百分率
5.透射电镜观察细胞凋亡的形态学改变：电镜下观察，K562细胞与K562/neo无区别，细胞形态正常，核仁、染色体及细胞器均未见异常，核膜、胞膜完整。K562/RZ123细胞则出现浓缩的染色质团块，环绕核膜，核膜不完整，并可见正在“出芽”、逐步形成凋亡小体；细胞浆内可以观察到细胞器的空泡样变性(图2～4)。
, 百拇医药
图2 正常K562细胞核膜完整，核仁清楚，细胞器结构正常
图3 转染neo基因的K562细胞(K562/neo)核膜完整，可见双核仁，细胞器结构正常
图4 转染多核酶的K562细胞(K562/RZ123)核膜不完整，出现环绕核膜的浓缩染色质团块，并可见正在“出芽”、逐步形成的凋亡小体，胞浆内存在空泡样变性
6.RT-PCR检测细胞凋亡结果：K562及K562/neo细胞RNA经RT-PCR后均可扩增出约366 bp的电泳条带，与阳性对照组所得结果一致(图5)，而K562/RZ123细胞却只出现弥散的RNA条带，表明三核酶已成功切割bcr-abl融合基因。分离各实验组细胞的DNA 经电泳后结果显示：只有K562/RZ123细胞DNA出现典型的“DNA梯状”电泳条带。
, http://www.100md.com
注：1.含有bcr-abl融合基因的质粒pGD210经引物PCR；2.K562细胞RNA RT-PCR结果；
3.K562/neo细胞RNA RT-PCR结果；4.K562/RZ123细胞RNA RT-PCR结果
图5 核酶转染前后细胞RNA RT-PCR结果
讨论 自体骨髓移植是有望治愈慢粒的方法之一，但因缺乏有效的体外骨髓净化措施而限制了其在临床上的广泛应用[4]。目前通过基因治疗进行骨髓净化是慢粒治疗的新趋势。
虽然基因治疗在动物试验中已取得了令人鼓舞的结果，但其特异性(靶向性)差仍然是体内应用的最大障碍。单纯的基因治疗方案离临床治疗尚有较大距离，尤其是在肿瘤治疗方面。核酶是具有切割酶活性的RNA分子，能特异性地结合并切割靶RNA。锤头状核酶主要由13个保守氨基酸的催化活性中心和两端的底物结合区组成。核酶特异性作用于三联密码子GUX(X：A、U、C)，当其为GUC时核酶的切割活性最高[5]。通过分析bcr-abl基因，我们发现在其融合位点的上游-29 bp(GUC)，上游-1 bp(GUU)及下游+15 bp(GUA)处恰好存在3个相邻的天然核酶切割位点，为慢粒的核酶治疗创造了有利的条件。
, 百拇医药
在本试验中，我们针对这三个位点设计了3个单核酶，并进一步通过基因重组制备了双核酶及三核酶。单核酶的进一步联合不但促进了切割活性的提高，更有助于提高切割的特异性。多单位核酶有效地避免了单核酶对于体内正常abl基因及bcr基因的非特异性切割，更加安全可靠。从我们的实验结果可以看出三核酶切割活性>双核酶>单核酶。
本实验结果与国际上相关研究相比[6]，首次证明了bcr-abl特异性多核酶抑制K562细胞增殖是通过诱导细胞凋亡实现的，表明bcr-abl基因在K562细胞的无限增殖中起重要作用，通过抑制bcr-abl基因即能起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用，此结果再次证实了bcr-abl在慢粒发病机理中的作用。
基金项目：国家自然科学基金(39670330)资助项目
参考文献
[1]Lichtman MA, Williams WJ. Chronic myelogenous leukemia and related disorders in hematology. 4 th ed, McGrawHill, New York, 1990, 205-212.
, 百拇医药
[2]金冬雁，黎孟枫.译.J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等著.分子克隆，第2版.北京：科学出版社，1992.
[3]冯琦、孙秉中、赵永同，等.Bcr-abl特异性系列核酶载体的构建及初步鉴定.生命科学与生物技术.中国科协第三届青年学术年会议文集，北京：中国科学技术出版社，1998. 423-426.
[4]O'Brien SG , Goldman JM. Current approaches to hematopoietic stem-cell purging in chronic myeloid leukemia. JCO, 1995,13:541-546.
[5]Eckstein F. RNA interactions: ribozymes and antisense. Bio Soci Trans, 1996,24: 601-604.
[6]Leopold LH, Shore SK, Reddy EP. Multi-unit anti- bcr-abl ribozyme therapy in chronic myelogenous leukemia. Leukemia & Lymphoma, 1996,22: 365-373.
收稿日期：1999-04-14, 百拇医药
单位：冯琦 孙秉中 刘利(710033 西安，第四军医大学西京医院血液内科)；(第四军医大学生物技术中心)赵永同 赵宁 颜真 韩苇 张英起；孙凯(第四军医大学西京医院肝胆外科)
关键词：白血病，髓样，慢性；融合蛋白质类，bcr-abl；脱噬作用
中华医学杂志000222
【摘要】 目的 构建单、双及三单位核酶，鉴定其体外切割活性及对K562生物学特性的影响，探讨核酶用于基因治疗的前景。方法 首先针对bcr-abl融合位点设计并合成3个单核酶，而后通过基因重组构建单、双及三核酶载体，以体外切割试验鉴定并比较其活性。然后以脂质体将bcr-abl三核酶逆转录病毒载体转入K562细胞，观察其对K562细胞周期、凋亡、超微结构的影响。结果 构建成功bcr-abl特异性系列核酶共6个重组载体，切割试验证实系列核酶载体中三核酶体外切割活性最强，为70.8%，双核酶次之，分别为60.7%和30.3%，不同位点的单核酶切割活性分别为54.6%、25.3%和3.6%。bcr-abl特异性多核酶通过诱导凋亡抑制K562细胞增殖。结论 bcr-abl特异性核酶在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的应用前景，为多核酶体外净化骨髓联合自体骨髓移植治疗提供了理论和实验依据。
, http://www.100md.com
Study on the in vitro cleavage abilities of ribozymes specific to different sites of bcr-abl fusion gene and their induction of apoptosis in K562 cells
FENG Qi, SUN Bingzhong, ZHAO Yongtong, et al.
(Department of Hematology, Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University, Xi'an 710033， China)
【Abstract】 Objective To investigate the in vitro cleavage abilities of ribozymes specific to different sites of bcr-abl fusion gene and their effects on K562 cell. Methods First, three single-ribozymes specific to the fusion point were designed. After recombination, 6 vectors including single-, double- and triple- ribozymes were constructed and their in vitro cleavage abilities were compared. Then the triple-unit ribozyme retroviral vector was transfected into K562 cell to test its effect on cell cycle, apoptosis and cell structure. Results These ribozymes can cleave the template in vitro with different efficiency. The triple-unit ribozyme, with an efficiency of 70.8%, was the most efficient one. The cleavage efficiency of single-unit RZ1, RZ2 and RZ3 was 54.6%, 25.3% and 3.6%, respectively. Those of double-unit RZ12 and RZ23 were 60.7% and 30.3% respectively. The triple-unit ribozyme could inhibit the K562 cell growth by inducing apoptosis. Conclusion It is a new way to treat CML by ribozymes specific to bcr-abl fusion gene, which made it available to purge bone marrow by bcr-abl specific ribozymes.
, 百拇医药
【Key words】 Leukemia, myeloid, chronic; Fusion proteins, bcr-abl; Apoptosis
慢性粒细胞白血病(慢粒)是一种骨髓多能干细胞异常增生性疾病，c-abl从第9号染色体转位到第22号染色体断裂集簇区(break point cluster)，形成bcr-abl融合基因，其编码的相对分子质量为210 000具有异常的蛋白酪氨酸激酶活性，在慢粒的发病中起重要的作用[1]。通过核酶特异性切割融合基因mRNA以阻断蛋白表达是慢粒基因治疗的策略之一。本研究中，我们设计合成了一系列针对bcr-abl的单核酶、双核酶及三核酶载体，对它们的体外活性进行了比较，并研究了bcr-abl特异性三核酶对K562细胞生长的抑制作用及机理。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药
1.细胞、质粒及主要试剂：含bcr-abl基因的pGD210载体由美国Whitehead研究所Daley教授惠赠；含 neo基因的pBCMGSNeo载体及菌株由本校生物技术中心合成。K562细胞株来自本校免疫教研室。各种内切酶、缺口平移系统及Taq酶均购自华美公司。质粒提取和纯化试剂盒，体外转录及RNA提取试剂盒分别购自美国Promega和美国Clonetech公司。Lipofectin购自北京原平公司。核酶单链及PCR引物由上海生物工程有限公司合成。
二、方法
1.核酶的设计与合成：根据bcr-abl融合基因cDNA序列，通过计算机程序辅助，针对融合位点的上游-29 bp，-1 bp及下游+15 bp分别设计3个锤头状核酶，核酶的作用位点分别为GUC、GUU及GUA。核酶单链等比例退火后制备双链单核酶RZ1、RZ2及RZ3。
RZ1:GCGGATCCGAATGTCATCGTTTCGTCCTCA-CGGACTCATCAGCACTCAGCCACGCATGCGAGGAATT-
, 百拇医药
CAGAGTCGACCG
RZ2:GCGCATGCTTAAGCAGAGTTTCGTCCTCAC-GGACTCATCAGCAAAAGCCCTGAATTCCG
RZ3:GCGAATTCTCAGCGGCCAGTTTCGTCCTCA-CGGACTCATCAGGCATCTGACTGTCGACCG
2.系列载体的构建：通过基因重组及PCR扩增等方法[2]构建3个单核酶、2个双核酶及1个三核酶体外转录载体、三单位核酶逆转录病毒载体(pDoRneo-RZ123)以及核酶体外切割模板(pBS210)载体。经酶切、电泳鉴定及DNA序列测定证实上述载体构建成功[3]。
3.核酶及模板pBS210载体的体外转录：根据不同酶切侧翼序列的差异，将上述核酶载体及pBS210载体酶切线性化，通过DNA回收试剂盒回收纯化后溶于20 μl DEPC水中。体外转录采用T7噬菌体RNA聚合酶进行。模板RNA用[α-32P]UTP同位素标记。转录产物溶于50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，1mmol/L EDTA溶液中，-70℃保存。
, http://www.100md.com
4.核酶与模板的相互作用：将核酶和模板转录物95℃变性5min后，置于冰上，各取4.5 μl，加入100 mmol/L MgCl2 1.0 μl，37℃反应2 h后用终止液(96%甲酰胺、20 mmol/L EDTA、1 g/L溴酚蓝、1 g/L二甲苯青蓝)终止反应，热变性后进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1 h，暗室内放射自显影2～6 h，自动洗片机冲洗，薄层扫描分析结果。
5.脂质体介导三核酶转染K562细胞：脂质体采用Lipofectin，转染方法参照说明书进行，分别将pDoRneo-RZ123和阴性对照pDoRneo转染K562细胞，48 h～72 h后观察K562/RZ123和K562/neo的各项指标。
6.neo基因DNA斑点杂交：载体pBCMGSNeo用HindIII+XbaI双酶切，获得1.9 kb大小的neo基因片段，1%琼脂糖电泳回收后用[α-32P] dATP进行缺口平移标记做为探针。K562/RZ123、K562/neo及K562三组细胞按常规方法提取细胞染色体DNA，与neo探针进行斑点杂交[2]。
, http://www.100md.com
7.细胞凋亡的检测：首先收集1×106细胞，制成细胞悬液，PI染色后以流式细胞仪进行细胞周期分析。此外，同时提取细胞染色体DNA后，1.5%琼脂糖凝胶电泳8 h～10 h，观察是否出现典型的DNA阶梯状。
8.透射电镜观察细胞超微结构的变化：收集1×106细胞，按常规方法2.5%戊二醛固定、制备电镜标本观察。
9.RT-PCR检测核酶对RNA切割作用：设计RT-PCR引物使bcr-abl融合位点位于扩增序列的中部，扩增后片段大小为366bp。上游引物为：5' CGTCTAGAGATGCTGACCAACTCGTGTG 3'，下游引物为：5' CCCTGCAGACACCATTCCCCATTGTGAT 3'。参照 QuickPrepR Total RNA Extraction Kit 说明书提取3组细胞RNA后，37℃反转录1 h，按以下条件进行PCR反应：95℃60 s；60℃80 s；72℃120 s；共35个循环，72℃延长10 min。
, 百拇医药
结果
1.序列核酶载体的构建：针对bcr-abl融合基因设计3个锤头状核酶，经计算机程序模拟测定及基因库检索，以上3个核酶均可特异性结合于融合基因相应位点。通过基因重组后最终获得3个单核酶、2个双核酶及1个三核酶体外转录载体。此外，还构建了三核酶逆转录病毒载体及核酶体外切割模板载体(含bcr-abl融合基因片段，约366bp)[3]。
2.系列核酶切割效率的比较：单、双及三核酶体外切割模板RNA后，同位素放射自显影的结果见图1。因核酶切割位点不同，作用于模板后产生的片段大小也不相同。因片段过小，双核酶和三核酶切割产生的23nt和28nt片段未显影。上述切割结果经薄层扫描数据分析显示，单核酶RZ1、2、3的切割效率分别为54.6%、25.3%和3.6%，双核酶RZ12，RZ23的切割效率为60.7%和30.3%，三核酶的切割效率为70.8%。
, http://www.100md.com
注：1.模板被RZ1切割为259 nt和169 nt大小RNA；2.模板被RZ2切割为231 nt和197 nt大小RNA；3.模板被RZ3切割为220 nt和208 nt大小RNA；4.模板RNA 428 nt；5.模板被RZ12切割为169 nt、197 nt、231 nt及259 nt大小的RNA；6.模板被RZ23切割为197 nt、208 nt、220 nt及231 nt大小的RNA；7.模板被Z123切割为169 nt、197 nt、208 nt、220 nt、231 nt及259 nt大小的RNA
图1 核酶对模板的体外切割活性比较
3.细胞基因组DNA斑点杂交：pDoRneo-RZ123和pDoRneo载体分别转染K562细胞后，neo基因整合入K562细胞，提取DNA与neo探针杂交出现阳性斑点，而对照组细胞则为阴性，说明载体转染成功。
, http://www.100md.com
4.流式细胞仪检测细胞周期：pDoRneo转染K562细胞后对细胞周期及凋亡均无影响，但转染三核酶48 h、72 h后G1期和G2期细胞数明显增多，而S期细胞受抑(表1)。而且在G1峰前可见一亚二倍体凋亡峰，凋亡细胞分别占2.4%和18.4%。表1 K562细胞转染核酶及对照载体细胞周期的变化 组别
G1
G2
S
K562
37.7
4.4
58.0
, 百拇医药
K562/neo
38.8
4.3
56.9
K562/RZ123(48h)
40.4
(+7.2)
8.1
(+84.1)
51.6
(-11.0)
K562/RZ123(72h)
, 百拇医药
60.9
(+61.5)
5.4
(+22.7)
33.7
(-41.9)
注：括号内为百分率
5.透射电镜观察细胞凋亡的形态学改变：电镜下观察，K562细胞与K562/neo无区别，细胞形态正常，核仁、染色体及细胞器均未见异常，核膜、胞膜完整。K562/RZ123细胞则出现浓缩的染色质团块，环绕核膜，核膜不完整，并可见正在“出芽”、逐步形成凋亡小体；细胞浆内可以观察到细胞器的空泡样变性(图2～4)。
, 百拇医药
图2 正常K562细胞核膜完整，核仁清楚，细胞器结构正常
图3 转染neo基因的K562细胞(K562/neo)核膜完整，可见双核仁，细胞器结构正常
图4 转染多核酶的K562细胞(K562/RZ123)核膜不完整，出现环绕核膜的浓缩染色质团块，并可见正在“出芽”、逐步形成的凋亡小体，胞浆内存在空泡样变性
6.RT-PCR检测细胞凋亡结果：K562及K562/neo细胞RNA经RT-PCR后均可扩增出约366 bp的电泳条带，与阳性对照组所得结果一致(图5)，而K562/RZ123细胞却只出现弥散的RNA条带，表明三核酶已成功切割bcr-abl融合基因。分离各实验组细胞的DNA 经电泳后结果显示：只有K562/RZ123细胞DNA出现典型的“DNA梯状”电泳条带。
, http://www.100md.com
注：1.含有bcr-abl融合基因的质粒pGD210经引物PCR；2.K562细胞RNA RT-PCR结果；
3.K562/neo细胞RNA RT-PCR结果；4.K562/RZ123细胞RNA RT-PCR结果
图5 核酶转染前后细胞RNA RT-PCR结果
讨论 自体骨髓移植是有望治愈慢粒的方法之一，但因缺乏有效的体外骨髓净化措施而限制了其在临床上的广泛应用[4]。目前通过基因治疗进行骨髓净化是慢粒治疗的新趋势。
虽然基因治疗在动物试验中已取得了令人鼓舞的结果，但其特异性(靶向性)差仍然是体内应用的最大障碍。单纯的基因治疗方案离临床治疗尚有较大距离，尤其是在肿瘤治疗方面。核酶是具有切割酶活性的RNA分子，能特异性地结合并切割靶RNA。锤头状核酶主要由13个保守氨基酸的催化活性中心和两端的底物结合区组成。核酶特异性作用于三联密码子GUX(X：A、U、C)，当其为GUC时核酶的切割活性最高[5]。通过分析bcr-abl基因，我们发现在其融合位点的上游-29 bp(GUC)，上游-1 bp(GUU)及下游+15 bp(GUA)处恰好存在3个相邻的天然核酶切割位点，为慢粒的核酶治疗创造了有利的条件。
, 百拇医药
在本试验中，我们针对这三个位点设计了3个单核酶，并进一步通过基因重组制备了双核酶及三核酶。单核酶的进一步联合不但促进了切割活性的提高，更有助于提高切割的特异性。多单位核酶有效地避免了单核酶对于体内正常abl基因及bcr基因的非特异性切割，更加安全可靠。从我们的实验结果可以看出三核酶切割活性>双核酶>单核酶。
本实验结果与国际上相关研究相比[6]，首次证明了bcr-abl特异性多核酶抑制K562细胞增殖是通过诱导细胞凋亡实现的，表明bcr-abl基因在K562细胞的无限增殖中起重要作用，通过抑制bcr-abl基因即能起到诱导肿瘤细胞凋亡的作用，此结果再次证实了bcr-abl在慢粒发病机理中的作用。
基金项目：国家自然科学基金(39670330)资助项目
参考文献
[1]Lichtman MA, Williams WJ. Chronic myelogenous leukemia and related disorders in hematology. 4 th ed, McGrawHill, New York, 1990, 205-212.
, 百拇医药
[2]金冬雁，黎孟枫.译.J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，等著.分子克隆，第2版.北京：科学出版社，1992.
[3]冯琦、孙秉中、赵永同，等.Bcr-abl特异性系列核酶载体的构建及初步鉴定.生命科学与生物技术.中国科协第三届青年学术年会议文集，北京：中国科学技术出版社，1998. 423-426.
[4]O'Brien SG , Goldman JM. Current approaches to hematopoietic stem-cell purging in chronic myeloid leukemia. JCO, 1995,13:541-546.
[5]Eckstein F. RNA interactions: ribozymes and antisense. Bio Soci Trans, 1996,24: 601-604.
[6]Leopold LH, Shore SK, Reddy EP. Multi-unit anti- bcr-abl ribozyme therapy in chronic myelogenous leukemia. Leukemia & Lymphoma, 1996,22: 365-373.
收稿日期：1999-04-14, 百拇医药